Separazione immunomagnetica di Sca1 Fat Depot-specifica<sup&gt; alta</sup&gt; derivate da tessuto adiposo cellule staminali (ASC)

Riepilogo

We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1^high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.

Abstract

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function^1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance^3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1^high ASCs.

Introduzione

Staminali antigene cella 1 (Sca1, o Ly6A / E) per la prima volta identificata come un marcatore di superficie cellulare espressa da ematopoietiche e mesenchimali staminali cellule ^5,6. La frazione vascolare stromale (SVF) di tessuto adiposo ottenuto da depositi di grasso del mouse è una popolazione eterogenea di cellule che compongono dei fibroblasti, macrofagi, cellule endoteliali vascolari, cellule neuronali e cellule progenitrici degli adipociti ^7. Cellule progenitrici degli adipociti, o le cellule staminali derivate da tessuto adiposo (CSA) sono cellule non carichi di lipidi che si trovano nella matrice extracellulare perivascolare ricchi di collagene (ECM) ^8. Circa il 50% della SVF costituiti da ASC, caratterizzati come lineage-negative (Lin ^-) e CD29 ^+: CD34 ^+: Sca1 ^{+ 9.} La maggior parte di queste cellule sono Sca1 ^+: CD24 ^- progenitori adipociti, che sono capaci di adipociti differenziazione in vitro; Tuttavia, solo una frazione di cellule (0,08% del SVF) costituisce Sca1 ^{+: CD24 + cellule che sono pienamente in grado di proliferare e differenziarsi in adipociti nelle condizioni in vivo 9. Nonostante il potenziale avvertenza di usare Sca1 + SVF senza discriminare le cellule CD24 + CD24 da - cellule, isolando Sca1 + ASC da depositi di grasso che utilizzano la separazione immunomagnetica è un approccio efficiente e pratico per determinare il fenotipo delle cellule-autonoma di cellule progenitrici degli adipociti primaria.}

Nel campo di obesità e diabete, fibrosi dei tessuti e l'infiammazione gioca un ruolo fondamentale nello sviluppo e nella manutenzione del diabete di tipo-2 ^3. Recentemente, Tokunaga et al. hanno dimostrato che le cellule ^{di alta} SCA1 isolate da inguinale (o sottocutanea, SQ) e perigonadal (o viscerale, VIS) depositi di grasso C57BL6 / J mostrano diverse firme genetiche e ECM rimodellamento in vitro ^10. MMP14 (MT1-MMP), un membro prototipico della membrana-tmatrix ipo metalloproteinasi (MMP) famiglia media lo sviluppo di tessuto adiposo bianco (WAT), attraverso la sua attività collagenolitica ^1.

Esempi di esperimenti che possono essere eseguite con le cellule isolate e arricchite attraverso il seguente protocollo includono cultura tridimensionale, studi di differenziazione, saggi di degradazione del collagene, e RNA sequenziamento ^10,11. Test di degradazione devono essere condotte con il collagene acido estratto per garantire la conservazione di telopeptide ^11,12. Il seguente protocollo dimostrerà i metodi per isolare le cellule stromali vascolari primarie da diversi depositi di grasso e di arricchire le cellule progenitrici degli adipociti utilizzando separazione immunomagnetica. La validità della separazione delle cellule sarà valutata con la citometria a flusso e attraverso l'utilizzo di topi Sca1-GFP che esprimono GFP in Sca1 ⁺ cellule, guidata da un promotore Sca1 ^13.

Protocollo

Etica Dichiarazione: L'Università del Michigan Comitato Uso e manutenzione degli animali (UCUCA) ha approvato tutti i metodi ei protocolli in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (Institute for Research Laboratory Animal, Consiglio Nazionale delle Ricerche). I topi sono mantenuti in una Università del Michigan Vivarium e sono dati il ​​libero accesso a cibo e acqua e tenuti al / ciclo di luce 12 ore scuro.

1. preparati

1. Preparare terreni di coltura primaria con DMEM, 10% FBS, 1x P / S / G, e 1x antibiotici / antimicotici. Questo verrà utilizzato per mantenere i tessuti nella digestione prima. Mettere magazzino e aliquota in 37 ° C bagnomaria.
2. Preparare cinque millilitri di Tipo III soluzione di collagenasi a 5 mg / ml sciolti in HBSS (+ Ca, Mg +) per ciascun tipo di cuscinetto adiposo essere isolati, fino a cinque topi. Per esempio, quando isolando SQ e VIS da un singolo genotipo, fare 10 ml, se wild-type e mutante SQ e VIS, fanno 20 ml. Regolare il pH a 7,4 e sterile filtro. Aliquota in provette da 50 ml. Mettere da parte al riparo dalla luce.
3. Utilizzare il 70% di etanolo per disinfettare campo chirurgico. Pulire e coprire con un tampone blu. Spruzzare un po 'di etanolo sul pad blu.
4. Utilizzare i 22 aghi G da definire un tampone assorbente alla scheda di polistirolo e tagliare con le forbici. Spruzzare il pad con etanolo quindi impostare la scheda sul pad blu e coprire con un altro pad blu fino al inizio dissezione.
5. Riempire due provette da 50 ml con etanolo e posto in una posizione adiacente al campo chirurgico. Mettere le forbici e pinze in etanolo.
6. Riempire un altro tubo da 50 ml con PBS 1x più anti-anti per il risciacquo etanolo off strumenti chirurgici.
7. Nel cofano, etichetta di 60 piatti mm per ogni tipo di tessuto e riempire con terreni di coltura riscaldato a 37 ° C. Posizionare le piastre adiacenti alla zona chirurgica.

2. Isolamento di sottocutanea (SQ) Fat Pads

1. Euthanize mouse con una dose eccessiva di isoflurano e pneumotorace.
2. Delicatamentespruzzare il mouse con il 70% di etanolo e laici in posizione supina. Pin le zampe al bordo della gomma piuma con 22 aghi G.
3. Fare un piccolo taglio nella pelle del basso addome. Tenendo la parte superiore del taglio con le pinze, prendere le forbici e separare la pelle dal peritoneo.
4. Una volta che la pelle è separato dal peritoneo dall'addome al torace, riflettere la pelle lontano dal peritoneo verso la testa mediante tagli laterali nella pelle lungo il lato del corpo.
5. Riflettere il restante pelle tiene il grasso inguinale lontano dal corpo e definire con precisione alla scheda con 22 aghi G.
6. Passare a forbici sottili e pinze. Afferra il cuscinetto adiposo inguinale con la pinza all'origine vicino al peritoneo e tagliare via tra la pelle e il grasso inguinale progredendo verso l'inguine evitando di contaminare il SQ con la pelle.
7. Posizionare il cuscinetto adiposo inguinale insolated in mm piatto etichettato 60.

3. Isolamento di Visceral (VIS) cuscinetti di grasso

1. In modo simile al punto 2.5, tagliare il peritoneo aperto per esporre il viscerale cuscinetti adiposi e intestino.
2. Spostare l'intestino via verso il torace.
3. Afferra il cuscinetto adiposo VIS alla fine distale e delicatamente tirare su. Sezionare il cuscinetto adiposo VIS facendo attenzione ad escludere dell'epididimo (o uterina, se si utilizza topi di sesso femminile) dei tessuti.
4. Posto nel piatto etichettati e ripetere il punto 3.3 per il pad VIS rimanente.

4. Collagenasi digestione dei grassi Pad

1. Spostare 60 mm piatti alla cappa coltura tissutale e aspirare fuori media.
2. Tritare i cuscinetti adiposi con forbici curve poi aggiungere alla soluzione di collagenasi. Assicuratevi di risciacquare le forbici e pinze tra tipi di tessuto con etanolo e PBS.
3. Agitare a 300 rpm e 37 ° C per 10-20 minuti fino a quando i tessuti vengono digeriti. È accettabile se alcuni pezzi di SQ sono ancora visibili. Questo problema verrà affrontato in un passaggio successivo.
4. Aggiungere 25 ml di terreni di coltura per la soluzione di collagenasi per fermare la collagtrattamento enase, e pipetta su e giù per 10 volte con una pipetta 10 ml sierologica per disperdere i tessuti digeriti.
5. cellule Strain usando un colino cella di 100 micron. Centrifugare per 10 min a 300 x g.
6. decantare con cautela media non disturbare il pellet e aggiungere 5 ml di acqua sterile per il pellet e delicatamente pipetta di sospendere le cellule. Attendere 2 minuti per la lisi degli eritrociti.
7. Aggiungere 25 ml di media con cellule FBS e di deformazione del 10% attraverso un nuovo colino cella 100 micron.
8. Centrifugare per 10 min a 300 x g. mezzi decantare e risospendere pellet in 1 ml di terreni di coltura.
9. Contare le cellule con un emocitometro utilizzando 1: 1 trypan blu.
10. Piastra 1 x 10 ⁶ cellule in un bene su un 6-pozzetti.

5. separazione cellulare magnetica

1. Dopo circa 4 a 6 ore di adesione cellulare, lavare le cellule due volte con HBSS (-Ca, -Mg). Dissociarsi cellule aderenti con 0,05% tripsina. Diluire sospensione cellulare tripsina in tampone di separazione 1 ml e girare per5 min a 300 x g.
2. Aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in 500 microlitri di buffer. Rimuovere una aliquota di 10 microlitri e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
3. cellule Spin per 5 min a 300 x g.
4. Aspirare il surnatante completamente. Risospendere le cellule in 90 microlitri di buffer. Aggiungere 10 microlitri anticorpo primario anti-Sca1-FITC. Mescolare bene e incubare per 10 minuti a 4 ° C al buio.
5. Lavare le cellule con 1 ml di tampone e celle di centrifugazione per 5 min a 300 x g. Rimuovere completamente il surnatante.
6. Risospendere le cellule in 80 microlitri di buffer. Aggiungere 20 microsfere anti-FITC microlitri. Mescolare bene e incubare per 15 min a 4 ° C al buio.
7. Lavare le cellule con 1 ml di tampone e celle di centrifugazione per 5 min a 300 x g.
8. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 500 microlitri di buffer.
9. Mettere colonna del supporto magnetico e risciacquare colonna con 500 microlitri di buffer.
10. Aggiungere sospensione cellulare a colonna. Evitare bolle mentre pipettaggio.
11. Raccogliere il Sca1 senza etichetta ^{- <}/ Sup> cellule e lavare colonna 3 volte con 500 microlitri di buffer. Solo aggiungere nuovo buffer quando il serbatoio è vuoto. Evitare bolle mentre pipettaggio.
12. Rimuovere colonna dal supporto magnetico e posto in un tubo da 15 ml.
13. Aggiungere 1 ml di tampone a colonna ed eluire Sca1 ⁺ spingendo stantuffo fornito attraverso il serbatoio di colonna.
14. Centrifugare frazioni cellulari per 5 min a 300 x g. Risospendere le cellule in terreni di coltura 1 ml.
15. Rimuovere una aliquota di 10 microlitri dalle frazioni etichettati e senza etichetta e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
16. Piastra ogni frazione di cellule in 1 pozzetto di una piastra da 6 pozzetti.

6. Verifica di separazione immunomagnetica di Sca1 ^alta ACSS con citometria a flusso

1. Lavare le cellule due volte con HBSS (-Ca, -Mg) e dissociare le cellule utilizzando 0,05% tripsina.
2. cellule centrifugare a 300 xg per 5 min. Risospendere le cellule in terreni di coltura 1 ml e contare con un emocitometro.
3. Ottenere> 10 ⁶ cellule in 1 ml di terreni di coltura e centrifugare a 300 xg per 5 min.
4. Rimuovere il surnatante e ripetere il punto 6.3 altre due volte.
5. Risospendere le cellule con 1 ml di 2% siero di capra + 2% BSA e blocco per 30 minuti a RT.
6. cellule centrifugare a 300 xg per 5 min.
7. Rimuovere soluzione bloccante.
8. Aggiungere topo IgG2a Alexa Fluor 647 (0,25 mg, 1: 400) o anti-Sca1 Alexa Fluor 647 (0,25 mg, 1: 400), in 100 ml di PBS con siero di capra 2% e il 2% BSA + PBS a 4 ° C per 30 minuti al buio.
9. Aggiungere 1 ml di PBS freddo per le cellule. Centrifugare 300 xg per 5 minuti a 4 ° C.
10. Rimuovere il surnatante e ripetere il punto 6.9 altre due volte.
11. Risospendere le cellule in 1 ml di PBS. Passare sospensioni cellulari attraverso un colino cella di 100 micron di preparazione per l'analisi di citometria di flusso.

Risultati

Arricchimento di ^alte ASC SCA1 provenienti da diversi cuscinetti di grasso.

Le cellule stromali vascolari isolati dalla visualizzazione grasso SQ fibroblasti-like, allungato la forma delle cellule indipendentemente dal livello di espressione Sca1 (Figura 1A). D'altra parte, VIS (EWAT-derivati) SCA1 ^alta e ^bassa Sca1 cellule mostrano netta differenza nella loro forma cellula...

Discussione

Qui dimostriamo l'isolamento e la separazione immunomagnetica cellule di ASC murine da diversi cuscinetti di grasso e il loro utilizzo per esperimenti in vitro. Il metodo presentato è efficace per la rapida isolamento di un gran numero di ASC SCA1-positivo, che è vantaggiosa sulla tecnicamente complessi e costosi isolamento FACS-mediata di ASC ^9,14. Diversamente FACS, separazione immunomagnetica non consente l'uso di antigeni multipli per l'identificazione di una popolazione di cellule ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Type 3 Collagenase	Worthington Biochemical	LS004182	Tissue digestion
DMEM	Gibco	11965-092	High-glucose culture medium
Pen/Strep/Glutamine (100x)	Gibco	10378-016	Media antibiotic
Anti-anti (100x)	Gibco	15240-062	Media antifungal
FBS	Gibco	16000-044
PBS (1x, pH 7.4)	Gibco	10010-023
Trypsin (0.05%)	Gibco	25300-054
Cell strainer	BD Bioscience	352360	100-μm cell strainer
60 mm plates	BD Falcon	353004
Scissors	FST	14001-12	Large
Scissors	FST	14091-11	Fine, curved tip
Large Forceps	FST	11000-12
Fine Forceps	Any vendor
25G 5/8” needles	BD	305122
22G 1.5” needles	BD	305159
15 ml conical tubes	BD Falcon	352097
50 ml conical tubes	BD Falcon	352098
MACS separation columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Anti-Sca1 microbead kit (FITC)	Miltenyi Biotec	130-092-529	FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb
AutoMACS running buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
MiniMACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Blue chux pads	Fisher	276-12424
Absorbent pads	Fisher	19-165-621
Styrofoam board			Use from 50 ml tubes
70% ethanol
Isoflurane	Any vendor
Rat IgG2a Alexa Fluor 647	Invitrogen	R2a21
Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647	Invitrogen	MSCA21
Rat IgG2a R-PE	Invitrogen	R2a04
Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE	Invitrogen	MF48004
Round-bottom tube	BD Falcon	352058
HBSS (–Ca, –Mg)	Gibco	14175-095
HBSS (+Ca, +Mg)	Gibco	14025-092	For collagenase solution
Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid	Prepare in house12
10x MEM	Gibco	11430-030
1 M HEPES	Gibco	15630-080
0.34 N NaOH	Prepare in house
Cover slips	Corning	2870-22
Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers	Invitrogen	A-20004
0.89 M NaHCO3	Gibco	25080-094