A separação imunomagnética Sca1 de gordura Depot-específica<sup&gt; alta</sup&gt; células-tronco derivadas de tecido adiposo (ASC)

Resumo

We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1^high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.

Resumo

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function^1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance^3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1^high ASCs.

Introdução

Stem antigénio da célula 1 (Sca1 ou Ly6A / E) foi pela primeira vez identificado como um marcador de superfície celular expressa por hematopoiéticos e células estaminais mesenquimais ^5,6. A fracção do estroma vascular (SVF) de tecido adiposo obtidas a partir de depósitos de gordura do rato é uma população heterogénea de células compreendendo de fibroblastos, macrófagos, células endoteliais vasculares, células neuronais, adipócitos e células progenitoras ^7. Células progenitoras de adipócitos, ou células-tronco derivadas de tecido adiposo (ASCs) são células não-lípidos carregados que residem na matriz extracelular rica em colagénio perivascular (ECM) ^8. Aproximadamente 50% de SVF consistem de ASC, os quais são caracterizados como linhagem negativa (Lin ^-) e CD29 ^+: CD34 ^+: Sca1 ^{+ 9.} A maior parte destas células são Sca1 ^+: CD24 ^- progenitores de adipócitos, que são capazes de diferenciação de adipócitos in vitro; no entanto, apenas uma fracção das células (0,08% de SVF) constitui Sca1 +: CD24 ⁺ células que são totalmente capazes de proliferar e se diferenciar em adipócitos nas condições in vivo ^9. Apesar do potencial ressalva de usar Sca1 ⁺ SVF sem discriminar células CD24 ⁺ de CD24 ^- células, isolando Sca1 ⁺ ASC de depósitos de gordura, através de separação de células imunomagn�ica é uma abordagem eficiente e prático para determinar o fenótipo de células-autônoma de células progenitoras adipócitos primário.

No campo da obesidade e da diabetes, fibrose tecidual e a inflamação desempenha um papel crítico no desenvolvimento e na manutenção de diabetes Tipo ^3-2. Recentemente, Tokunaga et al. mostraram que células de ^alta SCA1 isoladas de inguinal (ou subcutânea, SQ) e perigonadal (ou visceral, VIS) C57BL6 / J depósitos de gordura apresentam diferentes assinaturas genéticas e ECM remodelação in vitro ^10. MMP14 (MT1-MMP), um membro prototípico da membrana-tipo metaloproteinase de matriz (MMP) da família medeia o desenvolvimento de tecido adiposo branco (WAT) através da sua actividade colagenolítica ^1.

Exemplos de ensaios que podem ser realizados com as células isoladas e enriquecidas por meio do seguinte protocolo incluem cultura tridimensional, os estudos de diferenciação, os ensaios de degradação de colagénio, e a sequenciação de ARN ^10,11. Ensaios de degradação deve ser conduzida com colágeno extraído-ácido para garantir a preservação da telop�tido ^11,12. O protocolo a seguir irá demonstrar os métodos para isolar células estromais vasculares primárias de diferentes depósitos de gordura e enriquecer as células progenitoras adipócitos usando separação de células imunomagn�ica. A validade da separação de células será avaliada com citometria de fluxo e através da utilização de ratinhos Sca1-GFP que expressam GFP em células Sca1 ^+, conduzido por um promotor Sca1 ^13.

Protocolo

Declaração de Ética: A Universidade de Michigan Comitê de Uso e tratamento dos animais (UCUCA) aprovou todos os métodos e protocolos, de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Instituto de Pesquisa Animal Laboratory, Conselho Nacional de Pesquisa). Os ratinhos são mantidos no biotério da Universidade de Michigan e é dado livre acesso a comida e água e mantidos numa / ciclo de luz escuro de 12 h.

1. Preparações

1. Preparar meios de cultura primária com DMEM, 10% de FBS, 1x P / S / G e 1x antibióticos / antifúngicos. Isto irá ser utilizado para manter tecidos na digestão antes. Coloque estoque e da alíquota em 37 banho de água ºC.
2. Prepare cinco mililitros de solução de colagenase Tipo III em 5 mg / ml dissolvida em HBSS (+ Ca, Mg +) para cada tipo de almofada de gordura a ser isolado, até cinco ratos. Por exemplo, quando se isola SQ e VIS de um único genótipo, fazer 10 ml, se do tipo selvagem e mutante SQ e VIS, fazer 20 ml. Ajustar o pH para 7,4 e steirritar filtro. Aliquota em tubos de 50 ml. Separe longe da luz.
3. Use 70% de etanol para desinfectar campo cirúrgico. Limpe e cubra com uma almofada azul. Borrife um pouco de etanol no bloco azul.
4. Use os 22 g de agulhas de definir uma almofada absorvente para a placa de isopor e cortar com uma tesoura. Pulverizar o pad com etanol, em seguida, definir a bordo na plataforma azul e cubra com outra almofada azul até começando dissecção.
5. Encha dois tubos de 50 ml com etanol e coloque em uma posição adjacente ao campo cirúrgico. Coloque as tesouras e pinças do etanol.
6. Encher outro tubo de 50 ml com PBS acrescido 1x anti-anti para enxaguar etanol off instrumentos cirúrgicos.
7. Na capa, etiqueta 60 mm pratos para cada tipo de tecido e encher com meios de cultura aquecido a 37 ºC. Colocar as placas adjacentes à área cirúrgica.

2. Isolamento de subcutânea (SQ) Fat Pads

1. Euthanize rato com uma overdose de isoflurano e pneumotórax.
2. Suavementespray de rato com 70% de etanol e leigos supina. Pin as patas para a placa de espuma com 22 agulhas G.
3. Faça um pequeno corte na pele do abdômen inferior. Segurando a parte superior do corte com a pinça, pegue a tesoura e separar a pele do peritônio.
4. Uma vez que a pele é separada do peritoneu do abdómen ao tórax, reflectir a pele para longe do peritoneu para a cabeça, fazendo cortes laterais na pele ao longo do lado do corpo.
5. Refletir o restante da pele segurando a gordura inguinal longe do corpo e fixar para baixo à placa com 22 agulhas G.
6. Mudar para uma tesoura fina e fórceps. Agarre a almofada de gordura inguinal com a pinça na origem perto do peritônio e snip de distância entre a pele e gordura inguinal progredindo em direção a virilha evitando a contaminação do SQ com a pele.
7. Coloque a almofada de gordura inguinal insolated no prato mm marcado 60.

3. Isolamento da Visceral (VIS) bolsas de gordura

1. De uma maneira semelhante ao passo 2.5, cortar o peritoneu aberto para expor o almofadas de gordura visceral e intestino.
2. Mova o intestino em direção ao tórax.
3. Agarre a almofada de gordura VIS na extremidade distal e puxe para cima. Dissecar a almofada de gordura VIS, tendo o cuidado de excluir do epidídimo (ou uterina, se utilizando do sexo feminino camundongos) do tecido.
4. Coloque no prato rotulados e repita o passo 3.3 para o bloco restante VIS.

4. A colagenase digestão da gordura Pads

1. Mova 60 mm pratos para a capa de cultura de tecidos e aspirar off mídia.
2. Picar as bolsas de gordura com tesoura curva, em seguida, adicionar a solução de colagenase. Certifique-se de lavar as tesouras e pinças entre tipos de tecido com etanol e PBS.
3. Agitar a 300 rpm e 37 ° C durante 10-20 minutos, até que os tecidos são digeridos. É aceitável se algumas peças de SQ ainda são visíveis. Esta questão será abordada em uma etapa posterior.
4. Adicionar 25 ml de meio de cultura para a solução de colagenase para parar o collagtratamento Enase e pipeta cima e para baixo 10 vezes com uma pipeta 10 ml sorológico para dispersar os tecidos digeridos.
5. As células da estirpe utilizando um filtro de células 100 mm. Centrifugar durante 10 minutos a 300 x g.
6. Cuidadosamente decantar media para não perturbar o sedimento e adicionar 5 ml de água estéril para o sedimento e gentilmente pipeta de suspender as células. Espera 2 minutos para lisar os eritrócitos.
7. Adicionar 25 ml de meio com células FBS e deformação de 10% através de um novo filtro de células 100 mm.
8. Centrifugar durante 10 minutos a 300 x g. Decantar e meios sedimento ressuspender em 1 ml de meio de cultura.
9. Contar as células com um hemocitómetro utilizando 1: 1 de azul de tripano.
10. Placa 1 X 10 ⁶ células num poço de uma placa de 6 poços.

5. Separação celular Magnetic

1. Depois de cerca de 4 a 6 horas de adesão celular, lavar as células duas vezes com HBSS (-Ca, Mg). Separar as células aderentes utilizando 0,05% de tripsina. Diluir suspensão de células de tripsina em 1 ml de tampão de separação e rotação para5 min a 300 x g.
2. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 500 ul de tampão. Remove-se uma alíquota de 10 ul e contar as células utilizando um hemocitómetro.
3. células de centrifugação durante 5 min a 300 x g.
4. Aspirar o sobrenadante completamente. Ressuspender as células em 90 ul de tampão. Adiciona-se 10 de anticorpo primário anti-Sca1-FITC ul. Misture bem e incubar por 10 minutos a 4 ºC no escuro.
5. Lavar as células com 1 ml de tampão e células de centrifugação durante 5 minutos a 300 x g. Remover o sobrenadante completamente.
6. Ressuspender as células em 80 ul de tampão. Adicionar 20 pi microesferas anti-FITC. Misture bem e incubar durante 15 min a 4 ºC no escuro.
7. Lavar as células com 1 ml de tampão e células de centrifugação durante 5 minutos a 300 x g.
8. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 ul de tampão.
9. Coloque coluna no suporte magnético e lave coluna com 500 ul de tampão.
10. Adicionar a suspensão de células em coluna. Evitar bolhas enquanto pipetagem.
11. Recolher o Sca1 não marcado ^{- <}/ Sup> células e lavagem da coluna 3 vezes com 500 ul de tampão. Apenas adicionar novo buffer quando o reservatório está vazio. Evitar bolhas enquanto pipetagem.
12. Remover a coluna do suporte magnético e coloque em um tubo de 15 ml.
13. Adicionar 1 ml de tampão de coluna e eluir Sca1 ⁺ empurrando o êmbolo fornecido através do reservatório coluna.
14. Girar as fracções de células durante 5 min a 300 x g. Ressuspender as células em 1 ml de meio de cultura.
15. Remove-se uma alíquota de 10 ul das fracções marcadas e não marcadas e contar as células utilizando um hemocitómetro.
16. Placa cada fracção de células em um poço de uma placa de 6 poços.

6. Verificação de Separação Immunomagnetic de Sca1 ^alta ACSs com Citometria de Fluxo

1. Lavar as células duas vezes com HBSS (-Ca, Mg) e dissociar as células usando tripsina a 0,05%.
2. células centrifugar a 300 xg por 5 min. Ressuspender as células em meios de cultura 1 ml e contar com um hemocitômetro.
3. Obter> 10 ⁶ células em 1 mL de meios de cultura e centrifugar a 300 xg durante 5 min.
4. Remover o sobrenadante e repita o passo 6.3 mais duas vezes.
5. Ressuspender as células com 1 ml de soro de cabra 2% + BSA a 2% e de bloco, durante 30 min à TA.
6. células centrifugar a 300 xg por 5 min.
7. Remover solução de bloqueio.
8. Adicionar ratazana IgG2a Alexa Fluor 647 (0,25 g, 1: 400) ou anti-Sca1 Alexa Fluor 647 (0,25 g, 1: 400), em 100 ul de PBS com soro de cabra 2% e 2% de BSA + PBS a 4 ° C durante 30 min no escuro.
9. Adicionar 1 ml de PBS frio a células. Centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
10. Remover o sobrenadante e repita o passo 6.9 mais duas vezes.
11. Ressuspender as células em 1 ml de PBS. Passa suspensões de células através de um coador de células de 100 um em preparação para a análise por citometria de fluxo.

Resultados

Enriquecimento de ^altas ASC SCA1 de diferentes bolsas de gordura.

As células estromais vasculares isoladas a partir de SQ visor de gordura do tipo fibroblastos, esticado a forma da célula, independentemente do nível de expressão Sca1 (Figura 1A). Por outro lado, VIS (eWAT derivados) células de ^baixa SCA1 ^alta e SCA1 demonstrar diferença distinta na sua forma celular. Como...

Discussão

Aqui demonstramos o isolamento e separação de células imunomagnética de ASC de murino a partir de diferentes camadas de gordura e o seu uso em experiências in vitro. O método apresentado é eficaz para o isolamento rápido de um grande número de ASC SCA1-positivo, o que é vantajoso sobre o isolamento tecnicamente complexo e caro mediada por FACS de ASC ^9,14. Ao contrário de FACS, a separação imunomagnética célula não permite a utilização de antigénio múltiplos para a identificação...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Type 3 Collagenase	Worthington Biochemical	LS004182	Tissue digestion
DMEM	Gibco	11965-092	High-glucose culture medium
Pen/Strep/Glutamine (100x)	Gibco	10378-016	Media antibiotic
Anti-anti (100x)	Gibco	15240-062	Media antifungal
FBS	Gibco	16000-044
PBS (1x, pH 7.4)	Gibco	10010-023
Trypsin (0.05%)	Gibco	25300-054
Cell strainer	BD Bioscience	352360	100-μm cell strainer
60 mm plates	BD Falcon	353004
Scissors	FST	14001-12	Large
Scissors	FST	14091-11	Fine, curved tip
Large Forceps	FST	11000-12
Fine Forceps	Any vendor
25G 5/8” needles	BD	305122
22G 1.5” needles	BD	305159
15 ml conical tubes	BD Falcon	352097
50 ml conical tubes	BD Falcon	352098
MACS separation columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Anti-Sca1 microbead kit (FITC)	Miltenyi Biotec	130-092-529	FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb
AutoMACS running buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
MiniMACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Blue chux pads	Fisher	276-12424
Absorbent pads	Fisher	19-165-621
Styrofoam board			Use from 50 ml tubes
70% ethanol
Isoflurane	Any vendor
Rat IgG2a Alexa Fluor 647	Invitrogen	R2a21
Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647	Invitrogen	MSCA21
Rat IgG2a R-PE	Invitrogen	R2a04
Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE	Invitrogen	MF48004
Round-bottom tube	BD Falcon	352058
HBSS (–Ca, –Mg)	Gibco	14175-095
HBSS (+Ca, +Mg)	Gibco	14025-092	For collagenase solution
Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid	Prepare in house12
10x MEM	Gibco	11430-030
1 M HEPES	Gibco	15630-080
0.34 N NaOH	Prepare in house
Cover slips	Corning	2870-22
Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers	Invitrogen	A-20004
0.89 M NaHCO3	Gibco	25080-094