Иммуномагнитного Разделение жировое депо-специфической СЦА1<sup&gt; высокая</sup&gt; Полученные из жировой ткани стволовые клетки (ИСС)

Резюме

We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1^high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.

Аннотация

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function^1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance^3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1^high ASCs.

Введение

Стволовыми клетками антигена за 1 (СЦА1 или Ly6A / E) был впервые идентифицирован как маркера клеточной поверхности , выраженной гемопоэтических и мезенхимальных стволовых клеток ^5,6. Стромальные сосудистый фракция (НВФ) из жировой ткани , полученной от мыши жировых депо представляет собой гетерогенную популяцию клеток , состоящих из фибробластов, макрофагов, эндотелиальных клеток сосудов, нервные клетки и клетки - предшественники адипоцитов ^7. Клетки - предшественники адипоцитов, или полученные из жировой ткани стволовые клетки (ASCs) не являются липидами клетки , которые находятся в коллагеновой богатых периваскулярного внеклеточного матрикса (ECM) ^8. Около 50% СФДВ состоят из ИСС, которые характеризуются как LINEAGE-отрицательной (Lin ^-) и CD29 ⁺ CD34 ^+:: СЦА1 ^{+ 9.} Большинство из этих ячеек являются СЦА1 ^+: CD24 ^- адипоцитов клетки - предшественники, которые способны к дифференциации адипоцитов в пробирке; Однако, только часть клеток (0,08% от SVF) составляет СЦА1 +: CD24 ⁺ клетки , которые в полной мере способны пролиферировать и дифференцироваться в адипоциты в условиях , в естественных условиях ^9. Несмотря на потенциальную предостережением использования СЦА1 ⁺ SVF , не различая CD24 ⁺ клеток из CD24 ^- клетки, изолируя СЦА1 ⁺ ИСС из жировых депо с использованием иммуномагнитный разделения клеток является эффективным и практичным подходом для определения клеточно-автономной фенотип клеток - предшественников первичных адипоцитов.

В области ожирения и диабета, фиброза тканей и воспаления играют решающую роль в развитии и поддержании диабета ³ 2- го типа. В последнее время , Токунага и др. показали , что ^{высокие} СЦА1 клетки , выделенные из паховая (или подкожно, SQ) и perigonadal (или висцеральный, VIS) C57BL6 / J жировых отложениях имеют разные подписи генов и ECM ремоделирования в пробирке ^10. ММР14 (МТ1-ММР), прототипическим член мембранно-Tип семейства металлопротеиназ матрицы (ММР) опосредует развитие белой жировой ткани (WAT) через его коллагенолитического деятельности ^1.

Примеры экспериментов , которые могут проводиться с клетками , выделенными и обогащенных по следующему протоколу включают трехмерную культуру, исследования дифференциации, анализы деградации коллагена и РНК последовательности ^10,11. Деградация анализы следует проводить с кислотой экстрагируют коллагена , чтобы обеспечить сохранение телопептидом ^11,12. Следующий протокол продемонстрирует методы для выделения первичных сосудистых стромальных клеток из различных жировых депо и обогащения клеток-предшественников адипоцитов с использованием иммуномагнитный разделения клеток. Справедливость сортировки клеток будет оцениваться с проточной цитометрии и путем использования СЦА1-GFP мышей , которые выражают GFP в СЦА1 ⁺ клеток, движимый СЦА1 промотора ^13.

протокол

Этика Заявление: Мичиганского университета Комитета по использованию и уходу за животными (UCUCA) одобрил все методы и протоколы в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных (Институт лабораторных исследований животных, Национальный исследовательский совет). Мыши поддерживаются в Мичиганском университете вивария и получают свободный доступ к пище и воде и выдерживают на 12 ч темнота / свет цикла.

1. Подготовка

1. Подготовка первичной медиакультуру с DMEM, 10% FBS, 1x P / S / G, и 1x антибиотики / противогрибковые средства. Это будет использоваться, чтобы держать ткани в перед пищеварением. Поместите запас и аликвоты в водяной бане 37 ° С.
2. Приготовьте пять миллилитров типа III раствора коллагеназы при 5 мг / мл, растворенного в HBSS (+ Са + Mg) для каждого типа жировое изолируя до пяти мышей. Например, при выделении SQ и Вис от одного генотипа, делают 10 мл, если дикого типа и мутанта SQ и Вис, сделать 20 мл. Отрегулируйте рН до 7,4 и STEразозлить фильтр. Алиготе в 50 мл пробирки. Отложите подальше от света.
3. Используйте 70% этанола для дезинфекции операционного поля. Протереть и крышка с синим площадку. Спрей некоторое количество этанола на синей панели.
4. Используйте 22 G иглы придавить абсорбирующую прокладку на пенопластовой доске и обрезать ножницами. Спрей накладку с этанолом, затем установить доску на синей площадке и накрыть другим синим площадку до начала рассечение.
5. Наполните две 50 мл пробирки с этанолом и место в стойке, примыкающей к операционному полю. Поместите ножницы и пинцет в этаноле.
6. Заполните другую 50 мл пробирку с PBS плюс 1x анти-анти для полоскания этанол от хирургических инструментов.
7. В капот, этикетка 60 мм блюда для каждого типа ткани и заполнения культуральной средой нагревают до 37 ° С. Место пластин, прилегающих к хирургической области.

2. Выделение подкожного (SQ) жировым

1. Эвтаназии мышь с передозировкой изофлуран и пневмоторакса.
2. нежноспрей мышь с 70% этанола и лежал навзничь. Закрепление лапы к пенополистирол с 22 г хвои.
3. Сделать небольшой разрез в коже нижней части живота. Держа верхнюю часть разреза с помощью пинцета, возьмите ножницы и отделить кожу от брюшины.
4. После того как кожа отделяется от брюшину от живота к грудной клетке, отражают кожу от брюшины к голове, сделав боковые разрезы в коже вдоль стороны тела.
5. Отражать оставшуюся кожу держит паховой жир прочь от тела и придавить к плате 22 G иглы.
6. Переключиться на тонких ножниц и пинцетов. Захват паховой жировой ткани с помощью пинцета в начале координат около брюшины и надрез прочь между кожей и паховых жира движется к паховой области, избегая загрязняя SQ с кожей.
7. Поместите инсолируемой паховой жировой ткани в мм блюдо маркированы 60.

3. Выделение Visceral (VIS) жировым

1. Аналогичным образом к шагу 2.5, разрезать брюшину открытую подвергать висцерального жира колодки и кишечника.
2. Переместить кишку прочь к грудной клетке.
3. Захватите VIS жировой ткани на дальнем конце и осторожно потяните вверх. Рассеките из VIS жировой ткани, стараясь при этом, чтобы исключить эпидидимальной (или матки, при использовании самок мышей) ткани.
4. Место в меченого блюдо и повторите шаг 3.3 для оставшейся VIS площадки.

4. коллагеназы жира колодки

1. Перемещение 60 мм блюд в капот культуре ткани и аспирата от средств массовой информации.
2. Фарш жировые подушечки с изогнутыми ножницами затем добавить в раствор коллагеназы. Обязательно полоскать ножницы и пинцет между типами тканей с этанолом и PBS.
3. Встряска при 300 оборотах в минуту и ​​37 ° С в течение 10-20 мин, пока ткани не перевариваются. Это приемлемо, если некоторые части SQ еще видны. Этот вопрос будет рассмотрен на более позднем этапе.
4. Добавить 25 мл культуральной среды в раствор коллагеназы, чтобы остановить collagenase лечение, и пипетку вверх и вниз 10 раз с 10 мл серологической пипетки, чтобы разогнать переваренные ткани.
5. Штамм клеток с использованием ячейки фильтра 100 мкм. Центрифуга в течение 10 мин при 300 х г.
6. Тщательно переливать от средств массовой информации, чтобы не нарушить осадок и добавляют 5 мл стерильной воды к осадку и осторожно пипеткой приостановить клетки. Подождите 2 мин для лизиса эритроцитов.
7. Добавьте 25 мл среды с 10% FBS и деформации клеток через новый 100 мкм клеточный фильтр.
8. Центрифуга в течение 10 мин при 300 х г. Декантируйте СМИ и ресуспендируют осадок в 1 мл культуральной среды.
9. Граф клеток с помощью гемоцитометра, использу 1: 1 трипановым синим.
10. Пластина 1 х 10 ⁶ клеток в одну лунку на 6-луночный планшет.

5. Магнитная разделение клеток

1. После того, как приблизительно от 4 до 6 ч клеточной адгезии, ополоснуть клетки дважды HBSS (-ca, -Mg). Диссоциируют прилипших клеток с использованием 0,05% трипсина. Развести суспензии клеток трипсина в буфере разделения 1 мл и спина для5 мин при 300 х г.
2. Отберите супернатант. Ресуспендируют клеток в 500 мкл буфера. Удалить 10 мкл аликвоты и подсчета клеток с использованием гемоцитометра.
3. Спин клетки в течение 5 мин при 300 х г.
4. Отберите супернатанту полностью. Ресуспендируют клеток в 90 мкл буфера. Добавляют 10 мкл анти-СЦА1-FITC первичное антитело. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 10 мин при 4 ° С в темноте.
5. Промыть клетки с 1 мл буфера и центрифугировать клетки в течение 5 мин при 300 х г. Удалить супернатант полностью.
6. Ресуспендируют клеток в 80 мкл буфера. Добавьте 20 мкл анти-FITC микрогранулы. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 мин при 4 ° С в темноте.
7. Промыть клетки с 1 мл буфера и центрифугировать клетки в течение 5 мин при 300 х г.
8. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 500 мкл буфера.
9. Поместите колонку в магнитный держатель и полоскать колонку с 500 мкл буфера.
10. Добавить клеточной суспензии в колонну. Избегайте пузырей в то время как пипеткой.
11. Соберите немеченого СЦА1 ^{- <}/ SUP> клетки и мыть колонке 3 раза 500 мкл буфера. Только добавить новый буфер, когда резервуар пуст. Избегайте пузырей в то время как пипеткой.
12. Удалить столбец из магнитного держателя и поместить в 15 мл коническую трубку.
13. Добавьте 1 мл буфера в колонку и элюции СЦА1 ^+, нажав поставляемый поршень через резервуар колонны.
14. Спин вниз клеточных фракций в течение 5 мин при 300 х г. Ресуспендируют клеток в 1 мл культуральной среды.
15. Удалить 10 мкл аликвоты из меченых и немеченых фракций и подсчета клеток с использованием гемоцитометра.
16. Пластинчатый каждую фракцию клеток в 1 лунку 6-луночного планшета.

6. Проверка иммуномагнитного Разделение СЦА1 ^{высокой} с АСУ проточной цитометрии

1. Промойте клетки дважды HBSS (-ca, -Mg) и диссоциируют клеток с использованием 0,05% трипсина.
2. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин. Ресуспендируют клеток в 1 мл среды культивирования и подсчет с помощью гемоцитометра.
3. Получить> 10 ⁶ клеток в 1 мл культуральной среды и центрифугирования при 300 мкг в течение 5 мин.
4. Удалить супернатант и повторите шаг 6,3 еще два раза.
5. Ресуспендируют клетки с 1 мл 2% козьей сывороткой + 2% бычьего сывороточного альбумина и блок в течение 30 мин при комнатной температуре.
6. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин.
7. Удалите блокирующий раствор.
8. Добавить крысу IgG2a Alexa Fluor 647 (0,25 мкг, 1: 400) или анти-СЦА1 Alexa Fluor 647 (0,25 мкг, 1: 400), в 100 мкл PBS с 2% сыворотки козьего молока и 2% БСА + PBS при 4 ° C в течение 30 мин в темноте.
9. Добавьте 1 мл холодного PBS к клеткам. Центрифуга 300 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
10. Удалить супернатант и повторите шаг 6,9 еще два раза.
11. Ресуспендируют клеток в 1 мл PBS. Pass клеточные суспензии через сито 100 клеток мкм в рамках подготовки к проточной цитометрии анализа.

Результаты

Обогащение СЦА1 ^{высоких} ИСС из разных жировым.

Сосудистые стромальные клетки , выделенные из жира SQ дисплей фибробластоподобных, растянуты форму клетки , независимо от уровня экспрессии СЦА1 (рис 1А). С другой стороны, Вис...

Обсуждение

Здесь мы демонстрируем изоляцию и иммуномагнитный разделение клеток мышиных ИСС от различных жировых отложений и их использование для проведения экспериментов в лабораторных условиях . Представленный метод эффективен для быстрого выделения большого количества СЦА1-положитель?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Type 3 Collagenase	Worthington Biochemical	LS004182	Tissue digestion
DMEM	Gibco	11965-092	High-glucose culture medium
Pen/Strep/Glutamine (100x)	Gibco	10378-016	Media antibiotic
Anti-anti (100x)	Gibco	15240-062	Media antifungal
FBS	Gibco	16000-044
PBS (1x, pH 7.4)	Gibco	10010-023
Trypsin (0.05%)	Gibco	25300-054
Cell strainer	BD Bioscience	352360	100-μm cell strainer
60 mm plates	BD Falcon	353004
Scissors	FST	14001-12	Large
Scissors	FST	14091-11	Fine, curved tip
Large Forceps	FST	11000-12
Fine Forceps	Any vendor
25G 5/8” needles	BD	305122
22G 1.5” needles	BD	305159
15 ml conical tubes	BD Falcon	352097
50 ml conical tubes	BD Falcon	352098
MACS separation columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Anti-Sca1 microbead kit (FITC)	Miltenyi Biotec	130-092-529	FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb
AutoMACS running buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
MiniMACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Blue chux pads	Fisher	276-12424
Absorbent pads	Fisher	19-165-621
Styrofoam board			Use from 50 ml tubes
70% ethanol
Isoflurane	Any vendor
Rat IgG2a Alexa Fluor 647	Invitrogen	R2a21
Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647	Invitrogen	MSCA21
Rat IgG2a R-PE	Invitrogen	R2a04
Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE	Invitrogen	MF48004
Round-bottom tube	BD Falcon	352058
HBSS (–Ca, –Mg)	Gibco	14175-095
HBSS (+Ca, +Mg)	Gibco	14025-092	For collagenase solution
Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid	Prepare in house12
10x MEM	Gibco	11430-030
1 M HEPES	Gibco	15630-080
0.34 N NaOH	Prepare in house
Cover slips	Corning	2870-22
Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers	Invitrogen	A-20004
0.89 M NaHCO3	Gibco	25080-094