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Resumen

Se presenta el protocolo para biocatalizadores de células completas co-inmovilización para la regeneración de cofactor y la mejora de la reutilización, usando la producción de L-xilulosa como un ejemplo. La regeneración del cofactor se consigue mediante el acoplamiento de dos cepas de Escherichia coli que expresa las enzimas funcionalmente complementarios; la inmovilización biocatalizador de célula completa se consigue mediante encapsulación de células en perlas de alginato de calcio.

Resumen

Hemos desarrollado recientemente un sistema de biocatalítica de células enteras simple, reutilizable y junto con la capacidad de regeneración de cofactor y la inmovilización biocatalizador para el rendimiento de producción mejorada y síntesis sostenida. La presente se describe el procedimiento experimental para el desarrollo de un sistema de este tipo que consta de dos E. cepas de E. coli que expresan enzimas funcionalmente complementarios. Juntas, estas dos enzimas pueden funcionar cooperativamente para mediar en la regeneración de cofactores caros para mejorar el rendimiento del producto de la biorreacción. Además, se informa del método de síntesis de una forma inmovilizada del sistema biocatalıtica acoplado por la encapsulación de células enteras en perlas de alginato de calcio. A modo de ejemplo, presentamos la biosíntesis mejorada de L-xilulosa a partir de L-arabinitol acoplando E. células de E. coli que expresan las enzimas L-arabinitol deshidrogenasa o NADH oxidasa. En condiciones óptimas y el uso de una concentración inicial de 150mM L-arabinitol, el rendimiento máximo L-xilulosa alcanzó 96%, que es superior a los reportados en la literatura. La forma inmovilizada de los biocatalizadores de células completas, junto demostró una buena estabilidad de funcionamiento, el mantenimiento de 65% de los rendimientos obtenidos en el primer ciclo después de 7 ciclos de re-uso sucesivo, mientras que el sistema libre de células perdió casi por completo la actividad catalítica. Por lo tanto, los métodos que aquí se ofrece dos estrategias que podrían ayudar a mejorar la producción industrial de L-xilulosa, así como otros compuestos de valor añadido que requieren el uso de cofactores en general.

Introducción

Biotransformación reductiva de células enteras utilizando microorganismos se ha convertido en un método generalizado para la síntesis quimio-enzimática de biomoléculas comercialmente y terapéuticamente importantes 1 - 3. Presenta varias ventajas sobre el uso de enzimas aisladas, especialmente la eliminación de los procesos de purificación de aguas abajo de alto coste y la demostración de un tiempo de vida prolongado 4-7. Para vías biocatalıticas donde se requieren cofactores para la formación de productos, los sistemas de células enteras tienen el potencial para proporcionar in situ regeneración cofactor mediante la adición de bajo costo donantes de electrones co-sustratos 5,8,9. Sin embargo, esta capacidad se reduce para las reacciones que requieren una concentración estequiométrica de co-sustratos raros o caros 10 - 13. Junto con pobre capacidad de reutilización de células enteras, esto impide el establecimiento de un produ escalable y continuosistema cción. se requieren modificaciones estratégica de los sistemas de células completas para estas biotransformaciones dependiente del cofactor para superar las limitaciones antes mencionadas. Específicamente, la combinación de los biocatalizadores de células completas que funcionan en conjunto se han mostrado para mejorar de manera significativa la productividad y la estabilidad de las enzimas albergaron 14. Estos factores, que son a menudo críticos para permitir la producción a gran escala de productos comercialmente viables, se pueden optimizar aún más por microbios biocatalıticas co-inmovilización 15. Hemos desarrollado recientemente un sistema de biocatalítica de células enteras simple y reutilizable que permite tanto la regeneración de cofactor y la inmovilización biocatalizador para la producción de L-xilulosa 16. En este estudio, este sistema se utiliza como un ejemplo para ilustrar los procedimientos experimentales de la aplicación de estas dos estrategias para mejorar el rendimiento de producción de biotransformación y la reutilización biocatalizador.

L-xilulosa pertenece a una class de moléculas biológicamente útiles nombrado azúcares raros. Azúcares monosacáridos son raros o únicos derivados de azúcares que se producen muy raramente en la naturaleza, sino que desempeñan un papel crucial como elementos de reconocimiento en las moléculas bioactivas 17,18. Tienen una gran variedad de aplicaciones que van desde los edulcorantes, alimentos funcionales para terapéuticos potenciales 19. L-xilulosa se ​​puede utilizar como un inhibidor potencial de múltiples alfa-glucosidasas, y también puede ser utilizado como un indicador de la hepatitis o cirrosis hepática 17,20. Alta eficiencia de conversión de xilitol a L-xilulosa en los sistemas de células enteras se ha informado anteriormente en Pantoea ananatis 21,22, Alcaligenes sp. 701B 23, Bacillus pálido Y25 24,25 y 26 de Escherichia coli. En E. coli, sin embargo, sólo se alcanzó usando (<67 mM) concentraciones bajas de xilitol 26 debido a los posibles efectos inhibidores de una concentración inicial de xilitol superior a 100 mM sobre la actividad xilitol deshidrogenasa-4-21,26. El equilibrio termodinámico entre xilulosa y xilitol se ha demostrado que favorecen fuertemente la formación de xilitol 25,27. Además, el rendimiento de xilulosa está limitada por la cantidad de cofactores caros que tienen que ser suministrado en la ausencia de un sistema de regeneración de cofactor en situ. En conjunto, estos factores limitan el potencial de ampliación en los sistemas sostenibles para la biosíntesis de L-xilulosa.

Para superar estas limitaciones y mejorar el rendimiento de biotransformación-L xilulosa, se empleó la estrategia de regeneración cofactor primero mediante el establecimiento de un sistema de biocatalítica de células enteras acoplado. Específicamente, L-arabinitol 4-deshidrogenasa (EC 1.1.1.12) a partir de Hypocrea jecorina (HjLAD), una enzima en la vía catabólica-L arabinosa de hongos, fue seleccionado para catalizar la conversión de L-arabinitol en L-xilulosa 28,29 . Al igual que muchas enzimas biosintéticas, un limitatio importanten de HjLAD es que requiere una cantidad estequiométrica de la cara dinucleótido de nicotinamida adenina cofactor (NAD +, la forma oxidada de NADH) para llevar a cabo esta conversión. NADH oxidasa se ​​encuentra en Streptococcus pyogenes (SpNox) se ha demostrado que mostrar una alta actividad de cofactor de regeneración 30,31. Aprovechando este atributo de SpNox, E. células de E. coli que expresan HjLAD para la producción de L-xilulosa se ​​acoplaron con E. células de E. coli que expresan SpNox para la regeneración de NAD + para aumentar la producción de L-xilulosa representado por la reacción de acoplamiento se muestra en la Figura 1A. En condiciones óptimas y usando una concentración inicial de 150 mM de L-arabinitol, el rendimiento máximo de L-xilulosa alcanzó el 96%, por lo que este sistema mucho más eficiente que los reportados en la literatura.

La estrategia de inmovilización de células enteras se empleó junto a mejorar aún más la capacidad de reutilización de la biocatalyt acopladoEl sistema de CI. Métodos utilizados comúnmente para la inmovilización de células enteras incluyen la adsorción / unión covalente a las matrices sólidas, la reticulación / atrapamiento y encapsulación en redes poliméricas 32. Entre estos enfoques, el método más adecuado para la inmovilización de células es la encapsulación en perlas de alginato de calcio. Sus propiedades de gelificación leves, matriz acuosa inerte y de alta porosidad ayudan a preservar las propiedades fisiológicas y la funcionalidad de los productos biológicos encapsulados 33. Por lo tanto, el sistema de biocatalizador acoplado que contiene tanto E. células de E. coli que albergan HjLAD o SpNox se inmovilizó en perlas de alginato de calcio para permitir múltiples ciclos de producción de L-xilulosa (Figura 2) .El sistema biocatalizador inmovilizado demostró una buena estabilidad de funcionamiento, el mantenimiento de 65% del rendimiento de conversión del primer ciclo después de 7 ciclos de sucesiva reutilización, mientras que el sistema libre de células perdió casi por completo su actividad catalítica.

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Protocolo

1.-Preparación de células enteras biocatalizadores

NOTA: La E. recombinante células de E. coli que albergan pET28a- SpNox 31 o 28 pET28a- HjLAD se denominarán en adelante como E. coli SpNox y E. coli HjLAD, respectivamente.

  1. Se inocula una sola colonia de E. coli HjLAD en 3 ml de medio Luria-Bertani (LB) complementado con kanamicina (50 mg / ml) y se incuba en un incubador agitador O / N a 37 ° C, 250 rpm.
  2. Diluir el cultivo por 1: 100 en 200 ml de LB fresco que contiene 50 mg / ml de kanamicina y se incuba a 37 ° C, 250 rpm hasta que la DO 600 alcanza ~ 0,6.
  3. Inducir la expresión de la proteína HjLAD añadiendo 0,1 mM isopropil β-D-tiogalactopiranósido (IPTG) al medio de cultivo y se incuba a 16 ° C, 180 rpm durante 16 hr.
    1. Alternativamente, lleve a cabo la inducción a 25 ° C, 200 rpm durante 6 horas si la biosíntesis de L-xilulosa (Paso 2 a continuación) se lleva a cabo el mismo día.
  4. Se recoge el E. inducida coli HjLAD células por centrifugación a 3200 xg durante 20 min a 4 ° C Descartar el sobrenadante y proceder al paso 2 para procesar el sedimento celular.
  5. En paralelo, realice los pasos 1.1 a 1.4 para E. coli SpNox.

2. Biosíntesis de L-xilulosa por acoplamiento E. coli HjLAD y E. coli SpNox para la regeneración del cofactor

  1. Resuspender los sedimentos celulares de E. coli HjLAD y E. coli SpNox por separado en tampón 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) a una densidad celular de 5,0 g de peso celular seco (gDCW) / L.
    Nota: Una correlación entre gDCW y la densidad óptica medida a 600 nm (OD 600) se puede establecer para facilitar el experimento. La fórmula utilizada eneste protocolo es 1 gDCW / L = 0.722 * OD 600 a 0,0965, que puede variar entre los diferentes espectrómetros.
  2. Mezclar 600 l de 5,0 gDCW / L E. coli HjLAD, 600 l de 5,0 gDCW / L E. coli SpNox, 100 l de 20 mM de NAD +, y 150 l de 2 M L-arabinitol en un 14 ml de tubo de fondo redondo y llevar el volumen de reacción a 2 ml mediante la adición de 550 l de 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) .
    Nota: La relación de la cantidad biocatalizadores dos de célula completa se puede optimizar para mejorar la biosíntesis del producto. Para el sistema descrito, una proporción de E. coli SpNox: E. coli HjLAD = 1: 1 se encontró que era óptima para la biosíntesis de L-xilulosa (Figura 1B).
  3. Incubar la mezcla de reacción a 30 ° C, 200 rpm durante 8 horas.
  4. Recoger el sobrenadante después de centrifugación a 4 ° C, 3.200 × g durante 10 min unand proceder para cuantificar la producción de L-xilulosa como se describe en el Paso 3 a continuación.

3. ensayo colorimétrico para la cuantificación L-xilulosa

  1. Aspirar 100 l del sobrenadante de reacción recogida del paso 2.4 en un tubo de 1,5 ml.
  2. Añadir 50 l de 1,5% de cisteína, 900 l de ácido sulfúrico 70%, y 50 l de 0,1% carbazol disolvió en etanol y se mezcla suavemente invirtiendo el tubo 3 veces.
  3. Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C, 200 rpm durante 20 min.
  4. Medir la absorbancia óptica de la mezcla de reacción a 560 nm (A 560), utilizando un espectrofotómetro.
    1. Se diluye la mezcla de reacción si la lectura A 560 está por encima de 1.

4. Inmovilización de recombinantes catalizadores de células enteras en perlas de alginato de calcio

  1. Disolver 4 g de alginato de sodio en 100 ml de agua destilada. Preparar la solución de alginato mediante la adición sodium alginato al agua para evitar la formación de grumos. Se calienta la mezcla si es necesario.
  2. Añadir 600 l de 5.0 gDCW / L E. coli HjLAD y 600 l de 5,0 gDCW / L E. coli SpNox en 1,2 ml 4% de alginato preparado en la etapa 4.1 y mezclar las células y alginato por pipeteo suave para evitar la formación de burbujas.
  3. Aspirar la suspensión de alginato / células en una jeringa con una aguja y añadir la mezcla gota a gota en un cloruro de 0,3 M de calcio (CaCl 2) solución en un vaso de precipitados de 100 ml con agitación continua.
    Nota: El volumen de la solución de CaCl 2 utilizado para la formación de esferas de alginato debería ser suficiente para que las gotitas de alginato esté completamente sumergido. Además, la distancia entre la aguja de la jeringa y la superficie de la solución de cloruro de calcio debe mantenerse dentro de un intervalo óptimo para asegurar la formación de perlas uniformemente esféricas. El rango óptimo se puede determinar la distancia experimentoaliado y depende del diámetro interior de la aguja. Como una estimación, se encontró una distancia de ~ 15 ± 5 cm para ser óptima para una 0,6 cm (diámetro interior) de la aguja de la jeringa.
  4. Deja las perlas en la solución de CaCl 2 por 2 - 3 horas a TA sin agitación para permitir la formación de reticulación y de gel de perlas.
  5. Decantar la solución de CaCl 2 sin perturbar las perlas vertiendo cuidadosamente la solución de CaCl 2 en un tubo cónico de 50 ml, y la transferencia de las perlas restantes en solución de CaCl2 en otro tubo cónico de 50 ml.
  6. Lavar las perlas con 10 ml de 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) Tampón de tres veces para eliminar las células excesivas CaCl 2 y un-encapsulado.
    NOTA: En cualquier paso dado, no centrifugar las perlas ya que al hacerlo se romperá ellos. Para separar las perlas de la solución, permite la suspensión repose durante 3 - 5 min. Las perlas se depositan en el fondo y el tampón de lavado se puede decantaren otro recipiente.
    1. No deseche el tampón de lavado utilizado. En común el tampón utilizado Tris-HCl de lavado (30 ml) con la solución utilizada CaCl 2 recogido de la etapa 4.5.
  7. E. sedimentar los no-inmovilizados coli células por centrifugación de la solución de CaCl 2 y Tris-HCl agrupado recogieron de la etapa 4.6 a 3.200 xg durante 20 min. Para determinar la eficacia de inmovilización, calcular la densidad de las células de un-encapsulado sedimentadas en gDCW / L como se ha descrito en el paso 2.1.
  8. Transferir las perlas lavadas desde el paso 4.6 en un tubo. Siga los pasos 2.2 - 3.4 para evaluar la biosíntesis de L-xilulosa utilizando todas las perlas lavadas en lugar de gránulos de las células.

5. Ensayo de Estabilidad de Inmovilizados biocatalizadores para la producción de L-xilulosa

  1. Recoger las perlas de la etapa 4.8 y lavar dos veces con 10 ml de 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) tampón sin centrifugación (como se describe en el paso 4.6).
  2. Use todode las perlas lavadas para llevar a cabo la reacción como se describe en los pasos 2.2 - 3.4.
  3. Repetir los pasos 5.1 a 5.2 para el número deseado de ciclos de producción y medir la cantidad de L-xilulosa producido en el sobrenadante de reacción en cada ciclo.

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Resultados

Para activar la regeneración de cofactor, la síntesis de L-xilulosa se ​​llevó a cabo en un sistema de biocatalítica de células enteras acoplado que contiene E. coli HjLAD y E. células de E. coli SpNox. Después de la optimización de varios parámetros, la reutilización de este sistema se ha mejorado mediante la inmovilización en perlas de alginato de calcio (Figura 2).

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Discusión

Los recientes avances tecnológicos han permitido un aumento en la comercialización de productos bioterapéuticos recombinantes, lo que resulta en un aumento gradual de su valor de mercado en la industria de la biotecnología. Uno de estos avances es la llegada de la ingeniería metabólica de microorganismos recombinantes, que ha mostrado una gran promesa en el establecimiento de sistemas industriales escalables 38. Al igual que con la mayoría de los procesos, la comercialización exitosa de biomoléculas ...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia. El documento tiene por objeto informar metodología detallada para generar un sistema biocatalıtica de células enteras junto inmovilizada en perlas de alginato. Novedades científicas han sido reportados en un estudio previo 16.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por el Programa Básico de Investigación de Ciencias a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (NRF-2013R1A1A2012159 y NRF-2013R1A1A2007561), Universidad de Konkuk, y el Departamento de Ingeniería Química y mCubed programa de la Universidad de Michigan.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
LB broth Sigma AldrichL3022-6X1KG
KanamycinFisherBP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)Sigma AldrichI6758-10G
Tris baseFisherBP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrateSigma AldrichN7004-1G
L-ArabinitolSigma AldrichA3506-10G
L-CysteineSigma Aldrich168149
Sulfuric acidSigma Aldrich320501-500ML
CarbazoleSigma AldrichC5132
Ethanol FisherBP2818-4
Sodium alginateSigma AldrichW201502
Calcium chloride dihydrateSigma Aldrich223506-500G
Excella E24 shaker incubatorNew Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis SpectrophotometerAgilent Technologies
Centrifuge 5810REppendrof
BeakersFisher
SyringeFisher
NeedleFisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing BalanceOhaus

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