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Résumé

Présenté est le protocole de biocatalyseurs de cellules entières co-immobilisant pour la régénération du cofacteur et l'amélioration de la réutilisabilité, en utilisant la production de L-xylulose à titre d'exemple. La régénération du cofacteur est réalisée par couplage de deux souches d' Escherichia coli exprimant des enzymes fonctionnellement complémentaires; l'immobilisation du biocatalyseur à cellules entières est obtenue par l'encapsulation des cellules dans des billes d'alginate de calcium.

Résumé

Nous avons récemment développé un système de biocatalyseur à cellules entières simple, réutilisable et couplé à la capacité de régénération de cofacteur, et l'immobilisation de biocatalyseur pour un meilleur rendement de la production et la synthèse soutenue. Ci-joint décrit le processus expérimental pour l'élaboration d'un tel système composé de deux E. souches de E. coli qui expriment des enzymes fonctionnellement complémentaires. Ensemble, ces deux enzymes peuvent fonctionner de concert pour servir de médiateur à la régénération de cofacteurs chers pour améliorer le rendement de la production de la bioréaction. En outre, le procédé de synthèse d'une forme immobilisée du système couplé biocatalytique par encapsulation de cellules entières dans des billes d'alginate de calcium est signalée. A titre d'exemple, nous présentons l'amélioration de la biosynthèse de la L-xylulose à partir du L-arabinitol par couplage E. les cellules coli exprimant les enzymes L-arabinitol déhydrogénase ou la NADH oxydase. Dans des conditions optimales, et en utilisant une concentration initiale de 150mM de L-arabinitol, le rendement en L-xylulose maximale atteint 96%, ce qui est supérieur à ceux rapportés dans la littérature. La forme immobilisée des biocatalyseurs cellules entières couplées a démontré une bonne stabilité opérationnelle, le maintien de 65% du rendement obtenu dans le premier cycle après 7 cycles de réutilisation successive, tandis que le système de cellule libre presque complètement perdu l'activité catalytique. Par conséquent, les procédés présentés ici fournissent deux stratégies qui pourraient contribuer à l'amélioration de la production industrielle de L-xylulose, ainsi que d'autres composés à forte valeur ajoutée nécessitant l'utilisation de cofacteurs en général.

Introduction

Biotransformation des cellules entières en utilisant des microorganismes réductive est devenue une méthode très répandue pour la synthèse chimio-enzymatique de biomolécules dans le commerce et thérapeutiquement importantes 1 - 3. Il présente plusieurs avantages sur l'utilisation d'enzymes isolées, en particulier l'élimination des procédés de purification en aval coûteuses et la démonstration d'une durée de vie prolongée 4-7. Pour les voies biocatalytiques où les cofacteurs sont nécessaires pour la formation du produit, des systèmes de cellules entières ont le potentiel d'offrir in situ dans la régénération du cofacteur par l'addition de donneurs d' électrons co-substrats peu coûteux 5,8,9. Cependant, cette capacité est diminuée pour les réactions qui nécessitent une concentration stoechiométrique de co-substrats rares ou coûteux 10 - 13. Avec une mauvaise réutilisabilité des cellules entières, ce empêche la création d'un produ évolutif et continuSystème ction. modifications stratégiques des systèmes de cellules entières pour ces biotransformations cofacteur dépendant sont nécessaires pour surmonter les limitations mentionnées ci-dessus. Plus précisément, la combinaison de biocatalyseur de cellules entières qui agissent ensemble a été démontré que d'améliorer considérablement la productivité et la stabilité des enzymes 14 abrités. Ces facteurs, qui sont souvent essentielles pour permettre une production à grande échelle de produits commercialement viables, peuvent être optimisés en outre par biocatalytiques microbes co-immobilisant 15. Nous avons récemment développé un système biocatalytique cellule entière simple et réutilisable qui permet à la fois la régénération du cofacteur et biocatalyseur immobilisation pour la L-xylulose production 16. Dans cette étude, ce système a été utilisé comme un exemple pour illustrer les procédures expérimentales de l'application de ces deux stratégies pour améliorer le rendement de la production de biotransformation et biocatalyseur réutilisabilité.

L-xylulose appartient à une class de molécules biologiquement utiles nommé sucres rares. Sucres rares sont monosaccharides uniques ou des dérivés de sucre qui se produisent très rarement dans la nature, mais jouent un rôle crucial en tant qu'éléments de reconnaissance dans les molécules bioactives 17,18. Ils ont une variété d'applications allant des édulcorants, des aliments fonctionnels 19 agents thérapeutiques potentiels. L-xylulose peut être utilisé comme un inhibiteur potentiel de plusieurs alpha-glucosidases, et peut également être utilisé comme un indicateur de l' hépatite ou la cirrhose du foie 17,20. L'efficacité de conversion élevé de xylitol à L-xylulose dans les systèmes de cellules entières a été rapporté précédemment dans Pantoea ananatis 21,22, Alcaligenes sp. 701B 23, Bacillus pallidus Y25 24,25 et Escherichia coli 26. Dans E. coli, cependant, il a été réalisé en utilisant uniquement (<67 mM) , de faibles concentrations de xylitol 26 en raison des effets inhibiteurs potentiels d'une concentration initiale de xylitol supérieur à 100 mM sur l' activité de xylitol-4-déshydrogénase 21,26. L'équilibre thermodynamique entre le xylulose et le xylitol a été montré pour favoriser fortement la formation de xylitol 25,27. En outre, le rendement xylulose est limitée par la quantité de cofacteurs coûteux qui doivent être fournis en l'absence d'un système in situ de régénération de cofacteur. Ensemble, ces facteurs limitent le potentiel de mise à l'échelle dans les systèmes durables pour L-xylulose biosynthèse.

Pour surmonter ces limitations et améliorer le rendement de biotransformation L-xylulose, la stratégie de régénération du cofacteur a été employée d'abord par l'établissement d'un système de biocatalytique cellule entière couplée. Plus précisément, la L-arabinitol 4-déshydrogénase (EC 1.1.1.12) à partir Hypocrea jecorina (HjLAD), une enzyme dans la voie catabolique L-arabinose de champignons, a été sélectionné pour catalyser la conversion de la L-arabinitol en L-xylulose 28,29 . Comme beaucoup d'enzymes de biosynthèse, un limitatio majeurn de HjLAD est qu'il nécessite une quantité stoechiométrique de la chère nicotinamide adénine dinucléotide cofacteur (NAD +, la forme oxydée du NADH) pour effectuer cette conversion. NADH oxydase trouvée dans Streptococcus pyogenes (SpNox) a été montré pour afficher une forte activité cofacteur régénération 30,31. Profitant de cet attribut de SpNox, E. coli exprimant des cellules HjLAD pour la production de L-xylulose ont été couplés avec E. coli exprimant des cellules SpNox pour la régénération du NAD + pour stimuler la production de L-xylulose représenté par la réaction de couplage représentée sur la figure 1A. Dans des conditions optimales et en utilisant une concentration initiale de 150 mM de L-arabinitol, le rendement en L-xylulose maximale atteint 96%, ce qui rend ce système beaucoup plus efficace que ceux rapportés dans la littérature.

La stratégie d'immobilisation de cellules entières a été employée à côté d'améliorer encore la possibilité de réutilisation de la biocatalyt coupléesystème ic. Méthodes couramment utilisées pour l' immobilisation de cellules entières comprennent adsorption / liaison covalente à des matrices solides, réticulation / piégeage et l' encapsulation dans des réseaux polymères 32. Parmi ces méthodes, la méthode la plus appropriée pour l'immobilisation des cellules est l'encapsulation dans des perles d'alginate de calcium. Leurs propriétés de gélification doux, matrice aqueuse inerte et porosité élevée aident à préserver les propriétés physiologiques et la fonctionnalité des produits biologiques encapsulées 33. Par conséquent, le système couplé biocatalyseur contenant à la fois E. cellules de E. coli hébergeant HjLAD ou SpNox ont été immobilisés dans des billes d'alginate de calcium , pour permettre de multiples cycles de production de L-xylulose (figure 2) .Le système biocatalyseur immobilisé a démontré une bonne stabilité de fonctionnement, le maintien de 65% du rendement de conversion du premier cycle après 7 cycles de réutilisation successive, tandis que le système acellulaire presque complètement perdu son activité catalytique.

Protocole

1. Le total des cellules biocatalyseurs Préparation

NOTE: Le recombinant E. cellules coli hébergeant pET28a- SpNox 31 ou pET28a- HjLAD 28 sont ci - après dénommées E. et E. coli SpNox coli HjLAD, respectivement.

  1. Inoculer une seule colonie de E. coli HjLAD dans 3 ml de milieu Luria-Bertani (LB) additionné de kanamycine (50 pg / ml) et on incube dans un incubateur secoueur O / N à 37 ° C, 250 tours par minute.
  2. Diluer la culture de 1: 100 dans 200 ml de LB frais contenant 50 ug / ml de kanamycine et incuber à 37 ° C, 250 tours par minute jusqu'à ce que la DO600 atteigne environ 0,6.
  3. HjLAD induire l' expression de protéine en ajoutant 0,1 mM de β-D-thiogalactopyranoside d' isopropyle (IPTG) au milieu de culture et on incube à 16 ° C, 180 tpm pendant 16 heures.
    1. Vous pouvez également réaliser l' induction à 25 ° C, 200 rpm pendant 6 heures si la biosynthèse de la L-xylulose (étape 2 ci-dessous) est réalisée le même jour.
  4. Récolter les E. induite coli , des cellules HjLAD par centrifugation à 3.200 x g pendant 20 min à 4 ° C Jeter le surnageant et passer à l'étape 2 pour traiter le culot cellulaire.
  5. En parallèle, effectuez les étapes 1.1 à 1.4 pour E. coli SpNox.

2. biosynthèse de L-xylulose par couplage E. et E. coli HjLAD coli SpNox pour la régénération du cofacteur

  1. Remettre en suspension les culots de cellules de E. et E. coli HjLAD coli SpNox séparément dans un tampon de 50 mM de Tris-HCl (pH 8,0) à une densité cellulaire de 5,0 g de poids cellulaire sec (gDCW) / L.
    Remarque: Une corrélation entre gDCW et la densité optique mesurée à 600 nm (DO 600) peut être mis en place pour faciliter l'expérience. La formule utilisée dansce protocole est 1 gDCW / L = 0,722 * OD 600 à 0,0965, qui peut varier entre les différents spectromètres.
  2. Mélanger 600 pi de 5,0 gDCW / L E. coli HjLAD, 600 pi de 5,0 gDCW / L E. coli SpNox, 100 ul de 20 mM de NAD +, et 150 ul de 2 M de L-arabitol dans un 14 ml , tube à fond rond et à amener le volume réactionnel à 2 ml par addition de 550 ul de 50 mM de Tris-HCl (pH 8,0) .
    Remarque: Le rapport des deux cellules entières biocatalyseurs montant peut être optimisé pour améliorer la biosynthèse du produit. Pour le système décrit, un rapport de E. coli SpNox: E. coli HjLAD = 1: 1 a été trouvée comme étant optimale pour la L-xylulose biosynthèse (figure 1B).
  3. Incuber le mélange réactionnel à 30 ° C, 200 tours par minute pendant 8 heures.
  4. Recueillir le surnageant après centrifugation à 4 ° C, 3.200 xg pendant 10 min une procéder à quantifier la production de L-xylulose comme décrit à l'étape 3 ci-dessous.

3. Dosage colorimétrique L-xylulose Quantification

  1. Aspirer 100 ul du surnageant ont été recueillies de la réaction de l'étape 2.4 dans un tube de 1,5 ml.
  2. Ajouter 50 ul de 1,5% de cystéine, 900 ul d'acide sulfurique à 70%, et 50 ul de 0,1% carbazole dissous dans l'éthanol et mélanger doucement en retournant le tube 3 fois.
  3. Incuber le mélange réactionnel à 37 ° C, 200 tours par minute pendant 20 minutes.
  4. Mesurer l'absorbance optique du mélange réactionnel à 560 nm (560) à l' aide d' un spectrophotomètre.
    1. On dilue le mélange réactionnel si la lecture A 560 est supérieur à 1.

4. Immobilisation des recombinants catalyseurs de cellules entières dans des billes d'alginate de calcium

  1. Dissoudre 4 g d'alginate de sodium dans 100 ml d'eau distillée. Préparer une solution d'alginate par addition de sodium alginate à l'eau pour éviter la formation de grumeaux. Chauffer le mélange si nécessaire.
  2. Ajouter 600 pi de 5,0 gDCW / L E. coli HjLAD et 600 pi de 5,0 gDCW / L E. coli SpNox dans 1,2 ml de 4% alginate préparé à l' étape 4.1 et mélanger les cellules et l' alginate par pipetage doux pour éviter la formation de bulles.
  3. Aspirer la suspension d' alginate / cellule dans une seringue en utilisant une aiguille et ajouter le mélange goutte à goutte en un chlorure de 0,3 M de calcium (CaCl 2) une solution dans un bêcher de 100 ml avec une agitation continue.
    Remarque: Le volume de 2 solution CaCl utilisée pour la formation d' alginate de talon devrait être suffisant pour que les gouttelettes d'alginate d'être complètement submergés. En outre, la distance entre l'aiguille de la seringue et la surface de la solution de chlorure de calcium doit être maintenue dans une plage optimale pour assurer la formation de perles sphériques uniformément. La plage de distance optimale peut être déterminée expérienceallié et dépend du diamètre interne de l'aiguille. Comme une estimation, une distance de ~ 15 ± 5 cm a été jugée optimale pour un 0,6 cm (diamètre intérieur) de l'aiguille de la seringue.
  4. Laissez les perles dans la solution de CaCl 2 pour 2 - 3 heures à température ambiante sans agitation pour permettre la formation de réticulation et de gel des perles.
  5. Décanter la solution de CaCl 2 , sans perturber les perles en versant avec précaution la solution de CaCl 2 dans un tube conique de 50 ml, et de transférer les billes restantes dans une solution de CaCl 2 dans un autre tube conique de 50 ml.
  6. Laver les billes avec 10 ml de 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) de tampon trois fois pour éliminer les cellules excessives CaCl 2 et non-encapsulée.
    REMARQUE: A chaque étape donnée, ne pas centrifuger les perles comme faisant leur rupture. Pour séparer les perles de la solution, laisser reposer la suspension reposer pendant 3-5 min. Les perles se déposent au fond et le tampon de lavage peuvent être décantédans un autre récipient.
    1. Ne pas jeter le tampon de lavage utilisé. Rassembler le tampon utilisé Tris-HCl lavage (30 ml) avec la solution de CaCl 2 usée recueillie lors de l' étape 4.5.
  7. Pellet E. de non immobilisé cellules de E. coli par centrifugation du CaCl2 et du Tris-HCl à la solution de l' étape regroupés récoltés 4,6 à 3.200 g pendant 20 min. Pour déterminer l'efficacité de l'immobilisation, calculer la densité des cellules un-encapsulé sédimentées dans gDCW / L comme décrit à l'étape 2.1.
  8. Transférer les billes lavées à l'étape 4.6 dans un tube. Suivre les étapes 2.2 - 3.4 pour évaluer la biosynthèse de la L-xylulose en utilisant toutes les billes lavées à la place des pastilles cellulaires.

5. Stabilité Dosage de Immobilized biocatalyseurs pour L-xylulose production

  1. Collecter les perles provenant de l'étape 4.8 et laver deux fois avec 10 ml de 50 mM de Tris-HCl (pH 8,0) tampon sans centrifugation (comme décrit à l'étape 4.6).
  2. Utilisez tousdes billes lavées pour effectuer la réaction décrite dans les étapes 2.2 - 3.4.
  3. Répéter les étapes 05.01 à 05.02 pour le nombre souhaité de cycles de production et de mesurer la quantité de L-xylulose produite dans le surnageant de réaction dans chaque cycle.

Résultats

Pour permettre la régénération du cofacteur, la synthèse de la L-xylulose a été réalisée dans un système de biocatalyseur à cellules entières contenant couplée E. et E. coli HjLAD coli , des cellules SpNox. À la suite de l'optimisation des différents paramètres, la réutilisabilité de ce système a été amélioré par l' immobilisant dans des billes d'alginate de calcium (Figu...

Discussion

les progrès technologiques récents ont permis une forte augmentation dans la commercialisation de produits biothérapeutiques recombinants, ce qui entraîne une augmentation progressive de leur valeur de marché dans l'industrie de la biotechnologie. Un tel progrès est l'avènement de l' ingénierie métabolique dans des microorganismes recombinants, qui a montré une grande promesse dans l' établissement de systèmes industriels évolutifs 38. Comme avec la plupart des procédés, la comm...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition. Le document vise à rapports méthodologie détaillée pour générer un système de biocatalytique cellule entière couplée immobilisée dans des billes d'alginate. Nouveautés scientifiques ont été rapportés dans une étude précédente 16.

Remerciements

Cette recherche a été financée par le Programme de recherche en sciences de base par la National Research Foundation de Corée (NRF), financé par le Ministère de l'éducation, de la science et de la technologie (NRF-2013R1A1A2012159 et NRF-2013R1A1A2007561), Université Konkuk, et le Département de génie chimique et mCubed Programme à l'Université du Michigan.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
LB broth Sigma AldrichL3022-6X1KG
KanamycinFisherBP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)Sigma AldrichI6758-10G
Tris baseFisherBP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrateSigma AldrichN7004-1G
L-ArabinitolSigma AldrichA3506-10G
L-CysteineSigma Aldrich168149
Sulfuric acidSigma Aldrich320501-500ML
CarbazoleSigma AldrichC5132
Ethanol FisherBP2818-4
Sodium alginateSigma AldrichW201502
Calcium chloride dihydrateSigma Aldrich223506-500G
Excella E24 shaker incubatorNew Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis SpectrophotometerAgilent Technologies
Centrifuge 5810REppendrof
BeakersFisher
SyringeFisher
NeedleFisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing BalanceOhaus

Références

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