공동 인자 재생 및 개선 재사용에 대한 알긴산 구슬의 다중 생체 촉매의 고정화

요약

예를 들어 L-크실 로스를 생산하여 보조 인자 재생 및 재사용을위한 개선 된 공동 고정화 전체 세포 생체 촉매에 대한 프로토콜이다 선보였다. 보조인 재생 기능적 상보 효소 발현이 대장균 균주를 결합함으로써 달성된다; 전체 세포 생 촉매 고정화 칼슘 알기 네이트 비드에 세포 캡슐화함으로써 달성된다.

초록

우리는 최근 개선 된 생산 수율 및 지속적인 합성을위한 보조 인자 재생 및 생 촉매 고정화의 능력으로, 간단한 재사용과 결합 된 전체 세포 생 촉매 시스템을 개발했다. 이것과는 E. 설명이 이루어진 상기 시스템의 발전을위한 실험 절차 기능적으로 보완 효소를 발현 대장균 균주. 함께,이 두 효소는 생물 반응의 제품 수율 향상을위한 고가의 보조 인자의 재생을 중재하기 위해 공동으로 작동 가능하게 작동 할 수 있습니다. 또한, 칼슘, 알긴산 비드의 전체 세포의 밀봉하여 결합하는 생 촉매 시스템의 고정 된 형태를 합성하는 방법이보고되어있다. 예를 들어, 우리는 E. 결합하여 L-아라 비니에서 L 크실 로스의 개선을 제시 생합성 효소 L-아라 비니 NADH 탈수소 효소 혹은 산화 효소를 발현하는 대장균 세포. 최적의 조건에서 (150)의 초기 농도를 사용하여밀리미터 L-아라 비니는 최대 L 크실 로스 수율은 문헌에보고 된 것보다 높은 96 %에 도달. 자유 전지 시스템은 거의 완전하게 촉매 활성을 상실하는 동안 결합​​ 전체 세포 생 촉매의 고정 된 형태는 연속적으로 재사용 7 사이클 이후 첫 번째 사이클에서 얻어진 수율은 65 %로 유지하는 우수한 작동 안정성을 보여 주었다. 따라서, 여기에보고 된 방법은 L 크실 로스의 산업 생산뿐만 아니라, 일반적으로 보조 인자의 사용을 요구하는 다른 부가가치 화합물을 향상시킬 수있는 두 가지 전략을 제공한다.

서문

^{3 -} 미생물을 이용한 환원 전체 세포의 생체 내 변화는 상업적 및 치료 중요한 생체 분자 ^하나의 화학 - 효소 합성을위한 광범위한 방법이되고있다. ^{7 -} 그것은 절연 효소의 사용을 통해 여러 장점, 특히 비용 집약적 인 하류 정제 공정의 제거 및 연장 된 수명 ^(4)의 증명을 제공한다. 보조 인자가 제품의 형성에 요구되는 경로를 생 촉매를 들어, 전체 - 셀 시스템은 저렴 전자공 공동 ^5,8,9 기질의 첨가를 통해 원위치 팩터 재생에 제공 할 가능성이있다. ^{13 -} 그러나, 이러한 능력은 희귀하거나 고가 공동 기판 ^(10)의 화학량 론적 농도를 반응에 필요로 감소된다. 함께 전체 세포의 가난한 재사용으로,이 확장 가능하고 연속의 produ의 설립을 방해ction 시스템. 이러한 보조 인자 - 의존 생물 전환을위한 전체 전지 시스템의 전략적 변형은 상기 한계를 극복해야한다. 특히, 협력 작업 전체 세포 생체 촉매의 조합은 상당히 품은 효소 ^(14)의 생산성 및 안정성을 향상시키는 것으로 나타났다. 종종 상업적 제품의 대량 생산을 가능하게하는 중요한 요인은 공동 고정화 미생물 생 촉매 ^(15)에 의해 더 최적화 될 수있다. 우리는 최근 L 크실 로스 생산 ^(16)에 대한 보조 인자 재생 및 생 촉매의 고정화를 모두 할 수있는 간단하고 재사용 가능한 전체 세포 생 촉매 시스템을 개발했다. 이 연구에서,이 시스템은 개선 된 생물 전환 수율 및 생체 촉매의 재사용을 위해 두 가지 전략을 적용하는 실험 절차를 설명하기위한 예로서 사용되었다.

L 크실 로스는 CIA 요원에 속하는생물학적으로 유용한 분자의 SS는 희소 당을 이름. 희귀 설탕은 자연에서 매우 드물게 발생 고유 단당류 또는 당 유도체, 그러나 생리 활성 분자 ^{(17, 18)의} 인식 요소로 중요한 역할을한다. 그들은 감미료, 기능성 식품의 잠재적 인 치료제 ^(19)에 이르기까지 다양한 응용 프로그램이 있습니다. L 크실 로스 여러 α-글루코의 전위 억제제로서 사용될 수 있으며, 또한 간염이나 간경변 ^{17, 20의} 지표로서 사용될 수있다. 전체 셀 시스템 L 크실 로스에 자일리톨 고효율 변환 판토 이전에보고되었다 ^{(21, 22)는,} 알칼리 게 네스 SP ananatis. 701B ²³ 바실러스 창백 Y25 ^24,25 대장균 ^26. E.에서 대장균은, 그러나, 높은 인해 하나 이상의 초기 자일리톨 농도 전위 억제 효과가 낮은 (<67 mM)을 자일리톨의 농도 ^(26)를 통해서만 이루어졌다자일리톨-4-탈수소 효소 활성 ^21,26에서 00 밀리미터. 크실 로스 및 자일리톨 간의 열역학적 평형 강력 자일리톨 ^{25, 27의} 형성을 선호하는 것으로 나타났다. 또한, 크실 로스 수율 시츄 팩터 재생 시스템에서의 부재에 제공되어야하는 고가의 보조 인자의 양에 의해 제한된다. 함께, 이러한 요인 L 크실 로스 생합성 지속 시스템에 확장 가능성을 제한한다.

이러한 한계를 극복하고 L 크실 로스 생물 전환 수율을 향상시키기 위해, 보조 인자의 재생 전략은 결합 된 전체 세포 생 촉매 시스템을 확립함으로써 제를 사용 하였다. 구체적으로, L- 아라 비니 -4- 탈수소 Hypocrea의 jecorina 행 (EC 1.1.1.12) (HjLAD) 진균의 L-아라비 이화 경로의 효소, L-크실 로스 ^{(28, 29)에} L-아라 비니의 전환을 촉진하기 위해 선택된 . 많은 생합성 효소와 같은 주요 limitatioHjLAD의 N은 상기 전환을 수행하기 위해 고가의 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드의 보조 인자 (NAD ^+, NADH의 산화 된 형태)의 화학량 론적 양을 필요로한다는 것이다. 연쇄상 구균 화농 (SpNox)에서 발견 된 NADH 산화 효소는 높은 보조 인자 - 재생 활동 ^{(30, 31)를} 표시하는 것으로 나타났다. SpNox, E.의이 속성을 활용 L 크실 로스의 제조 HjLAD를 발현하는 대장균 세포와 결합 된 E. NAD ^+의 재생에 SpNox 발현 대장균 세포는도 1a에 도시 된 커플 링 반응에 의해 도시 된 L 크실 로스 생산을 촉진한다. 최적의 조건 150 mM의 L-아라 비니의 초기 농도를 사용에서 최대 L 크실 로스 수익률은 훨씬 더 효율적으로 문헌에보고 된 것보다이 시스템을, 96 %에 달했다.

전 세포 고정화 전략은 상기 결합 biocatalyt의 재사용을 향상시키기 위해 다음의 이용했다IC 시스템. 전체 세포 고정화 일반적으로 사용되는 방법은 고체 매트릭스, 고분자 네트워크 ^(32)의 가교 / 함정 수사 및 캡슐에 연결 흡착 / 공유를 포함한다. 이러한 방법 중, 세포 고정화에 가장 적합한 방법은 칼슘 알기 네이트 비드에 캡슐화된다. 그들의 가벼운 겔화 특성, 불활성 수성 매트릭스와 높은 다공성 캡슐화 된 생물학적 ^(33)의 생리 학적 특성과 기능을 보존하는 데 도움이. 따라서, 결합 된 생 촉매 시스템은 E. 모두 포함 HjLAD 또는 SpNox 은닉 대장균 세포는 7 일주기 이후에 첫 번째 사이클의 전환 수율 65 %를 유지 국지적 고정화 생체 촉매 시스템이 잘 작동 안정성을 입증 L 크실 로스 생산의 다수의 사이클을 사용하는 칼슘, 알기 네이트 비드에 (도 2) 고정화 연속 재사용 자유 전지 시스템은 거의 그 촉매 활성을 잃고있다.

프로토콜

1. 전체 세포 생체 촉매의 제조

참고 : 재조합 E. pET28a- SpNox ³¹ pET28a- HjLAD ²⁸ 대장균 형질 세포 이하 E.라고도 대장균 _SpNox 및 E. 대장균 _HjLAD, 각각.

1. E.의 단일 식민지의 예방 37 ^O C, 250 rpm에서 대장균 루리아 - 베르 타니 (LB) 카나마이신 (50 μg의 / ml)로 보충 매체의 3 ㎖에 _HjLAD 및 보육 통 O에 품어 / N.
2. 1 문화를 희석 : / ㎖ 카나마이신 50 μg의 37 ^O를 C 부화 포함 신선한 LB의 200ml에 100, 250 rpm으로 외경까지 ₆₀₀ ~ 0.6에 도달한다.
3. 배양액에 0.1 mM의 이소 프로필 β-D- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 첨가하여 HjLAD 단백질 발현을 유도하고 16 ^O C, 16 시간 동안 180 rpm으로 배양한다.
   1. 또한, 25 ^O C, 200 RP에서 유도을 수행만약 L 생합성 크실 로스 6 HR (하기 단계 2)를위한 m 당일 행한다.
4. 유도 E. 수확 4 ^오 ℃에서 20 분 동안 3,200 XG에 원심 분리하여 대장균 _{HjLAD 세포} 뜨는을 취소하고 세포 펠렛을 처리하기 위해 2 단계로 진행합니다.
5. E. 1.4 - 병렬로 수행은 1.1 단계 대장균 _SpNox.

2. 생합성 커플 링 E.에 의해 L 크실 로스 대장균 _HjLAD 및 E. 공동 인자의 재생에 대한 대장균 _SpNox

1. E.의 세포 펠렛을 재현 탁 대장균 _HjLAD 및 E. 콜라이 _SpNox 별도로 5.0 g 건조 세포 무게 (gDCW) / L의 세포 밀도로 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)이다.
   참고 gDCW 600 나노 미터 (OD _600)에서 측정 된 광학 밀도 사이의 상관 관계는, 실험을 용이하게 확립 할 수있다. 에 사용되는 수식이 프로토콜은 1 gDCW / L = 0.722 * OD ₆₀₀ - 다른 분석기에 따라 다를 수 있습니다 0.0965.
2. 5.0 gDCW / L E. 600 μl를 혼합 대장균 _HjLAD, 5.0 gDCW / L E. 600 μL 콜라이 _SpNox, 14 mL의 20 mM의 NAD ⁺ 100 ㎕, 2 M의 L-아라 비니 150 μL 둥근 바닥 튜브 및 50 mM 트리스 - 염산 550 μL를 첨가하여이 용액에 반응 부피를 가지고 (PH 8.0) .
   주 : 두 전체 세포 생 촉매의 양의 비는 제품의 생합성을 향상시키기 위해 최적화 될 수있다. 서술 된 시스템, E.의 비로 대장균 _SpNox : E. 대장균 _HjLAD 1 = 1이 L 크실 로스 생합성 (그림 1B)를위한 최적의 것으로 밝혀졌다.
3. ^30의 C ^O 8 시간 동안 200 rpm에서 반응 혼합물을 인큐베이션.
4. 4 ^O C에서 원심 분리 한 후 상등액을 수집 3,200 XG에 10 분 A에 대한차 아래 3 단계에 설명 된대로 L 크실 로스 생산을 정량화로 진행합니다.

L 크실 로스 정량 3. 비색 분석

1. 기음 1.5 ML 튜브로 단계 2.4에서 수집 반응 상층 액 100 ㎕.
2. 1.5 % 시스테인 50 μL, 70 % 황산을 900 ㎕의 에탄올에 용해 된 0.1 % 카바 졸 50 μl를 첨가하고, 튜브를 3 회 반전시켜 부드럽게 혼합한다.
3. ^입출력 37 C, 20 분 동안 200 rpm에서 반응 혼합물을 인큐베이션.
4. 분광 광도계를 사용하여 560 나노 미터 _(560)에서 반응 혼합물의 흡광도를 측정한다.
   1. _560는 A 기록이 1 이상이면, 반응 액을 희석한다.

칼슘 알긴산 비즈에서 재조합 전체 셀 촉매의 고정화 (4)

1. 100 ml의 증류수에 4g의 알긴산 나트륨을 녹인다. 의를 추가하여 알긴산 용액을 제조물에 대한 비난의 알긴산은 덩어리의 형성을 방지 할 수 있습니다. 필요한 경우 혼합물을 가열한다.
2. 5.0 gDCW / L E.의 600 μl를 추가 대장균 _HjLAD 5.0 gDCW / L E. 600 μL 콜라이 _{SpNox 1.2} ml의 4 %의 알긴산 단계 4.1 제조 및 기포 형성을 방지하기 위해 부드럽게 피펫 팅하여 세포와 알긴산 섞는다.
3. 연속 교반하면서 100 ㎖ 비이커에 (염화칼슘 ₂₎ 솔루션을 바늘을 이용하여 주사기에 알지네이트 / 세포 현탁액을 대기음 및 0.3 M 염화 칼슘에 적가 혼합물을 추가합니다.
   주 : 알긴산 물방울이 완전히 잠길 수 있도록 알긴산 비드 형성을 위해 사용 _CaCl2를 용액의 부피가 충분해야한다. 또한, 주사​​기 바늘과 염화칼슘 수용액의 표면 사이의 거리를 균일하게 구상 비드의 형성을 보장하기 위해 최적의 범위로 유지되어야한다. 거리의 최적 범위는 실험을 결정할 수있다아군과 바늘의 내부 직경에 따라 다르다. 예상 된 바와 같이, ~ 15 ± 5 cm의 거리가 0.6 cm (내경) 주사기 바늘에 대해 최적 인 것으로 밝혀졌다.
4. 가교 겔 비드를 형성 할 수 있도록 교반없이 실온에서 3 시간 - 2에 대한 염화칼슘 ₂ 용액에 구슬을 둡니다.
5. 조심스럽게 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 _CaCl2를 용액을 부어 구슬을 방해하지 않고 _CaCl2를 용액을 경사 분리하고, 또 다른 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 _CaCl2를 용액에 남아있는 비드 옮긴다.
6. _CaCl2를 과도 캡슐화되지 않은 세포를 제거하기 위해 50 mM Tris-HCl (pH8.0)을 10 ㎖로 3 회 비드 버퍼 씻는다.
   노트: 주어진 단계에서 그들을 파열 것이다 이렇게 같은 구슬을 원심 분리하지 않습니다. 5 분 - 솔루션에서 구슬을 분리하기 위해, 현탁액 3 그대로 방치한다. 비드 바닥에 침전되고 세척 완충액 경사 분리 될 수있다다른 용기에.
   1. 사용 된 세척 버퍼를 버리지 마십시오. 단계 4.5에서 수집 _CaCl2를 사용한 용액과 사용하는 트리스 -HCl의 세척 완충액 (30 ㎖)을 풀.
7. 미 고정 E. 펠렛 풀링 된 _CaCl2를 트리스 - 염산 용액을 원심 분리하여 대장균 세포는 20 분 동안 3200 × g으로 46 단계에서 수집. 단계 2.1에 기재된 바와 같이 고정화 효율을 결정하기 gDCW / L의 펠릿 캡슐화되지 않은 세포의 밀도를 계산한다.
8. 튜브로 단계 4.6에서 세척 구슬을 전송합니다. 단계 2.2에 따라 - 3.4 세포 펠렛 대신에 세정 비드를 모두 사용하여 L 크실 로스 생합성을 평가.

L 크실 로스 생산을위한 고정화 생체 촉매 5. 안정성 분석

1. 단계 4.8에서 비드를 수집한다 (단계 4.6에 기재된 바와 같이)를 원심 분리없이 50 mM 트리스 -HCl (pH 8.0) 완충액 10 ㎖로 두 번 세척 하였다.
2. 모든 사용3.4 - 단계 2.2에 기재된 바와 같이 세정 비드의 반응을 수행한다.
3. 생산 사이클의 원하는 수의 5.2 각 사이클에서, 반응 상층 액 제조 L 크실 로스의 양을 측정 - 반복 단계 5.1.

결과

보조 인자의 재생을 가능하게하기 위해, L 크실 로스 합성 E. 함유 결합 전체 세포 생 촉매 시스템 행했다 대장균 _HjLAD 및 E. 대장균 _{SpNox 세포.} 다양한 파라미터의 최적화에 따라,이 시스템의 재사용 칼슘 알기 네이트 비드에 (도 2)를 고정함으로써 개선되었다.

토론

최근 기술의 발전은 생명 공학 산업에서의 시장 가치의 점진적인 상승의 결과로, 재조합 biotherapeutics의 상용화에 서지을 사용할 수있다. 하나는 이러한 발전은 확장 성 산업 시스템 ^(38)을 구축에 큰 약속을 보여 주었다 재조합 미생물의 대사 공학의 출현이다. 대부분의 프로세스에서와 같이, 유전자 조작 된 미생물에 의해 생산 된 재조합 생 분자의 성공적인 상업화는 시스템 ^(39)의

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB broth	Sigma Aldrich	L3022-6X1KG
Kanamycin	Fisher	BP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758-10G
Tris base	Fisher	BP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate	Sigma Aldrich	N7004-1G
L-Arabinitol	Sigma Aldrich	A3506-10G
L-Cysteine	Sigma Aldrich	168149
Sulfuric acid	Sigma Aldrich	320501-500ML
Carbazole	Sigma Aldrich	C5132
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Sodium alginate	Sigma Aldrich	W201502
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	223506-500G
Excella E24 shaker incubator	New Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer	Agilent Technologies
Centrifuge 5810R	Eppendrof
Beakers	Fisher
Syringe	Fisher
Needle	Fisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance	Ohaus