קיבוע של biocatalysts רב בחרוזים אלגינט עבור פקטור רגנרציה Reusability משופר

Summary

מוצג פרוטוקול biocatalysts כל תא שיתוף משתק להתחדשות פקטור ויכולת שימוש חוזרת משופר, באמצעות הייצור של L-xylulose כדוגמא. התחדשות פקטור מושגת על ידי צימוד שני זני Escherichia coli להביע אנזימים משלימים מבחינה תפקודית; וקיבוע biocatalyst כל תא מושגת על ידי אנקפסולציה תא חרוזים אלגינט סידן.

Abstract

פתחנו לאחרונה מערכת biocatalytic פשוט, לשימוש חוזר ו מצמידה כל תא עם יכולת התחדשות פקטור וקיבוע biocatalyst תשואת ייצור משופרת וסינתזה מתמשכת. בזאת הוא תאר את הליך הניסויים לפיתוח של מערכת כזו מורכב משני E. קולי זני המבטאים אנזימים משלימים מבחינה תפקודית. יחד, שני אנזימים אלה יכולים לתפקד שיתוף ניתוח לתווך ההתחדשות של קו-פקטורים יקרים לשיפור תפוקת התוצר של bioreaction. בנוסף, השיטה של ​​סינתזת צורה משותקת של מערכת biocatalytic מצמידה ידי אנקפסולציה של תאים שלמים בחרוזי אלגינט סידן מדווחת. כדוגמא, אנו מציגים את ביוסינתזה המשופרת של L-xylulose מ L-arabinitol ידי צימוד E. קולי תאים המבטאים את האנזימים dehydrogenase L-arabinitol או מונואמין NADH. בתנאים אופטימליים ושימוש בריכוז ההתחלתי של 150המ"מ L- arabinitol, תשואת L-xylulose המקסימאלי הגיעה 96%, שהוא גבוה יותר מאשר אלו המדווחים בספרות. הצורה המשותקת של biocatalysts כל תא המצמידים הפגינה יציבות תפעולית טובה, שמירת 65% מהתשואה שהושגה במחזור הראשון אחרי 7 מחזורים של שימוש חוזר רצוף, בעוד מערכת תא חינם כמעט לחלוטין אבדה את הפעילות הקטליטית. לכן, שיטות דיווח כאן מספק שתי אסטרטגיות שיכול לעזור לשפר את הייצור התעשייתי של L-xylulose, וכן תרכובות ערך מוסף אחרים המחייבים את השימוש קו-פקטורים בכלל.

Introduction

Biotransformation כל תא רדוקטיבי באמצעות מיקרואורגניזמים הפך שיטה נפוצה לסינתזת האנזימטית הכימותרפיה של ביומולקולות בעלי חשיבות המסחרית טיפולי ^{1 - 3.} היא מציגה מספר יתרונות על פני השימוש של אנזימים מבודדים, בעיקר החיסול של תהליכי טיהור במורד זרם עתיר עלות לבין ההפגנה של חיים מורחבים ^{4 - 7.} לקבלת מסלולים biocatalytic שבו קו-פקטורים נדרשים ליצירת מוצר, מערכות תא כולו יש פוטנציאל לספק בהתחדשות פקטור באתרו באמצעות התוספת של ^5,8,9 שיתוף מצעים לתרום אלקטרונים זולים. עם זאת, היכולת הזו היא פחתה לתגובות הדורשות ריכוז stoichiometric של מצעי שיתוף נדירים או יקרים ^{10 - 13.} יחד עם שימוש חוזר עני של תאים שלמים, זה מקשה על הקמת produ מדרגי הרציףמערכת ction. שינויים אסטרטגיים של מערכות שלמות תאים עבור biotransformations פקטור תלויי אלה נדרשים להתגבר על המגבלות הנ"ל. באופן ספציפי, שילוב של biocatalysts כל התא שפועלים בשיתוף פעולה הוכח באופן משמעותי כדי לשפר את הפרודוקטיביות ואת היציבות של האנזימים טפחו ^14. גורמים אלו, אשר לעתים קריטיים המאפשרים ייצור בקנה מידה הגדולה של מוצרים בכמות מסחרית, יכולים להיות מותאמים יותר על ידי חיידקי biocatalytic משתק שיתוף ^15. פיתחנו לאחרונה מערכת biocatalytic פשוט לשימוש חוזר כל תא המאפשר גם התחדשות פקטור וקיבוע biocatalyst לייצור L-xylulose ^16. במחקר זה, מערכת זו נוצלה כדוגמה כדי להמחיש את הפרוצדורות של במסגרתו קיימות שתי אסטרטגיות אלה תשואה ייצור biotransformation משופרת ויכולת השימוש החוזר biocatalyst.

L-xylulose שייך CLAss של מולקולות ביולוגיות שימושיות בשם סוכרים נדירים. סוכרים נדירים הם מונוסכרידים ייחודיים או נגזרי סוכר המתרחשים לעתים נדירות מאוד בטבע, אבל לשחק תפקידים מכריעים כאלמנטי הכרה במולקולות ביו ^17,18. יש להם מגוון של יישומים החל ממתיקים, מזון פונקציונלי ל ^-19 רפויות פוטנציאלי. L-xylulose יכול לשמש מעכב פוטנציאל של α-glucosidases המרובה, עשוי לשמש גם כאינדיקטור של שחמת כבד או דלקת כבד ^17,20. המרה יעילות גבוהה של קסיליטול כדי L-xylulose במערכות כל תא דווחה בעבר Pantoea ananatis ^21,22, Alcaligenes sp. ²³ 701B, pallidus Bacillus ^24,25 Y25 ו Escherichia coli ^26. בתוך א ' coli, לעומת זאת, הושג אותו באמצעות נמוכים בלבד (<67 מ"מ) ריכוזים קסיליטול ²⁶ בשל השפעתו מעכבת פוטנציאל של ריכוז קסיליטול ראשוני גבוה יותר מ 100 מ"מ על פעילות קסיליטול-4-דהידרוגנז ^21,26. שיווי המשקל התרמודינמי בין xylulose ו קסיליטול הוכח בחום להעדיף היווצרות של קסיליטול ^25,27. בנוסף, תשואת xylulose מוגבלת על ידי הכמות של קו-פקטורים יקרים כי צריך להיות מסופקים בהעדר במערכת התחדשות הפקטור באתרו. יחד, גורמים אלה מצמצמים את פוטנציאל ההתרחבות לתוך מערכות קיימא עבור ביוסינתזה L-xylulose.

כדי להתגבר על המגבלות האלה ולשפר את תשואת biotransformation L-xylulose, האסטרטגיה של התחדשות פקטור הועסקה לראשונה על ידי הקמת מערך biocatalytic כל תא מצמיד. באופן ספציפי, L-Arabinitol 4-dehydrogenase (EC 1.1.1.12) מ Hypocrea jecorina (HjLAD), אנזים במסלול קטבולי L-arabinose של פטריות, נבחרה לזרז את ההמרה של L-arabinitol לתוך L-xylulose ^28,29 . כמו אנזימי biosynthetic רבים, limitatio גדולהn של HjLAD הוא שזה דורש כמות stoichiometric של פקטור אדנין dinucleotide nicotinamide היקר (NAD ^+, בצורת החמצון של NADH) לבצע המרה זו. מונואמין מצאו NADH ב pyogenes סטרפטוקוקוס (SpNox) הוכח להציג-התחדשות-פקטור גבוה פעילות ^30,31. ניצול של תכונה זו של SpNox, E. קולי תאים המבטאים HjLAD לייצור-xylulose L היו מצמידים עם E. קולי תאי מבטאי SpNox להתחדשות של NAD ⁺ כדי להגביר את ייצור L-xylulose מתואר על ידי התגובה המצמידה מוצגת באיור 1 א. בתנאים אופטימליים ושימוש בריכוז ההתחלתי של 150 מ"מ L- arabinitol, התשואה L-xylulose מקסימלי הגיעו 96%, מה שהופך את המערכת הרבה יותר יעיל מאלו שדווחו בספרות.

האסטרטגיה של חוסר תנועה כל התא הועסקה הבאה לשפר עוד יותר את השימוש החוזר של biocatalyt מצמידמערכת IC. בדרך כלל שיטות המשמשות וקיבוע כל תא כוללות ספיחה / קוולנטיים מקשרים מטריצות מוצקות, cross-linking / מלכוד אנקפסולציה ברשתות פולימריים ^32. בין גישות אלה, בשיטה המתאימה ביותר עבור קיבוע התא הוא אנקפסולציה בחרוזים אלגינט סידן. נכסי gelation הקלים שלהם, מטריקס מימית אינרטי נקבובית גבוה לעזור לשמר את המאפיינים פיסיולוגיים ופונקציונלית של הביולוגיות במארז ^33. לכן, מערכת biocatalyst מצמידים המכילה הוא E. קולי תאים מחסה HjLAD או SpNox היה משותק חרוזים אלגינט סידן לאפשר מחזורים רבים של ייצור L-xylulose (איור 2) .the מערכת biocatalyst משותקת הפגינו יציבות תפעולית טובה, שמירה 65% מהתשואה המרה של המחזור הראשון אחרי 7 מחזורים של שימוש חוזר רצוף, בעוד מערכת תא חינם כמעט לחלוטין אבדה הפעילות הקטליטית שלו.

Protocol

1. Whole-cell biocatalysts הכנה

הערה: א רקומביננטי קולי תאים מחסה pET28a- SpNox ³¹ או pET28a- HjLAD ²⁸ להלן מכונים E. coli _SpNox וא coli _HjLAD, בהתאמה.

1. לחסן מושבה אחת של E. coli _HjLAD ב 3 מ"ל של לוריא- Bertani (LB) בינוני בתוספת kanamycin (50 מיקרוגרם / מ"ל) ו דגירה ב- O שייקר אינקובטור / N ב 37 ^מעלות צלסיוס, 250 סל"ד.
2. לדלל את התרבות על ידי 1: 100 ב 200 מ"ל של LB טרי המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin ו לדגור על 37 ^מעלות צלסיוס, 250 סל"ד עד ₆₀₀ OD מגיע ~ 0.6.
3. להשרות ביטוי החלבון HjLAD ידי הוספת 0.1 מ"מ איזופרופיל β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) עד בינוני התרבות לדגור על 16 ^מעלות צלסיוס, 180 סל"ד במשך 16 שעות.
   1. לחלופין, לבצע אינדוקציה ב- 25 ^מעלות צלסיוס, 200 RPמ 'עבור 6 שעות אם ביוסינתזה L-xylulose (שלב 2 להלן) מבוצע באותו יום.
4. קציר מושרה E. coli _HjLAD התאים על ידי צנטריפוגה ב 3200 XG במשך 20 דקות ב 4 ^מעלות צלסיוס בטל supernatant והמשך לשלב 2 לעבד את התא גלולה.
5. במקביל, לבצע צעדים 1.1 - 1.4 עבור E. coli _SpNox.

2. ביוסינתזה של L-xylulose ידי צימוד E. coli _HjLAD וא coli _SpNox להתחדשות פקטור

1. Resuspend את כדורי תא של E. coli _HjLAD וא coli _SpNox בנפרד 50 mM Tris-HCl חיץ (pH 8.0) בשעה צפיפות התאים של משקל התא 5.0 גרם יבש (gDCW) / L.
   הערה: מתאם בין gDCW ואת הצפיפות האופטית נמדדה ב 600 ננומטר (OD ₆₀₀₎ ניתן להקים כדי להקל על הניסוי. הנוסחה המשמשת בפרוטוקול זה הוא 1 gDCW / L = 0.722 * OD ₆₀₀ - 0,0965, אשר יכול להשתנות בין ספקטרומטרים שונים.
2. מערבבים 600 μl של 5.0 gDCW / L א coli _HjLAD, 600 μl של 5.0 gDCW / L א coli _SpNox, 100 μl של 20 מ"מ NAD ^+, ו -150 μl של 2 M L-arabinitol בתוך 14 מ"ל צינור מסביב לתחתית ולהביא את עוצמת התגובה 2 מ"ל על ידי הוספת 550 μl של 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) .
   הערה: היחס בין שני כמות biocatalysts כל תא יכול להיות מותאם על מנת לשפר את ביוסינתזה של המוצר. עבור המערכת המתוארת, יחס של E. coli _SpNox: E. coli _HjLAD = 1: 1 נמצאה להיות אופטימלי עבור ביוסינתזה L-xylulose (איור 1B).
3. דגירת תערובת התגובה ב C 30 ^o, 200 סל"ד במשך 8 שעות.
4. אסוף את supernatant לאחר צנטריפוגה ב 4 ^מעלות צלסיוס, 3,200 XG במשך 10 מינימליnd להמשיך לכמת את הייצור L-xylulose כמתואר שלב 3 להלן.

3. Assay מדד-צבע עבור כימות L-xylulose

1. לשאוב 100 μl של supernatant התגובה שנאספו בשלב 2.4 לתוך צינור 1.5 מ"ל.
2. הוסף 50 μl של ציסטאין 1.5%, 900 μl של חומצה גופרתית 70%, ו -50 μl של 0.1% carbazole מומס באתנול ומערבבים בעדינות על ידי צינור היפוך 3 פעמים.
3. דגירת תערובת התגובה ב C 37 ^o, 200 סל"ד במשך 20 דקות.
4. מדוד את הספיגה האופטית של תערובת התגובה ב 560 ננומטר (א ₅₆₀₎ באמצעות ספקטרופוטומטר.
   1. לדלל את תערובת התגובה אם קריאת ₅₆₀ תהיה מעל ל -1.

4. קיבוע של זרזי Whole-cell רקומביננטי חרוזי אלגינט סידן

1. ממיסים אלגינט נתרן 4 גרם ב 100 מ"ל של מים מזוקקים. כן פתרון אלגינט על ידי הוספת sאלגינט למי גינות כדי למנוע היווצרות גושים. מחממים את התערובת במידת הצורך.
2. להוסיף 600 μl של 5.0 gDCW / L א coli _HjLAD ו -600 μl של 5.0 gDCW / L א coli _SpNox ב 1.2 מ"ל 4% אלגינט מוכן בשלב 4.1 ומערבבים התאים אלגינט על ידי pipetting עדין כדי למנוע היווצרות בועה.
3. לשאוב את ההשעיה אלגינט / תא לתוך מזרק באמצעות מחט ומוסיפים את תערובת טיפה חכם לתוך כלוריד 0.3 M סידן ₍₂ CaCl) פתרון בכוס 100 מ"ל עם בחישה מתמדת.
   הערה: היקף הפתרון CaCl ₂ המשמש היווצרות חרוז אלגינט בהחלט יספיק הטיפות אלגינט להיות שקוע לחלוטין. בנוסף, המרחק בין מחט המזרק ואת השטח של פתרון כלוריד סידן חייב להישמר בתוך טווח אופטימלי כדי להבטיח היווצרות של חרוזים כדוריים אחיד. טווח המרחק האופטימלי ניתן לקבוע ניסויברית ותלוי הקוטר הפנימי של המחט. כאומדן, מרחק של ~ 15 ± 5 ס"מ נמצאה להיות אופטימלי עבור 0.6 ס"מ מחט המזרק (פנימי קוטר).
4. השאירו את החרוזים הפתרון CaCl ₂ עבור 2 - 3 שעות ב RT ללא ערבוב כדי לאפשר היווצרות חרוזים crosslinking וג'ל.
5. למזוג את הפתרון CaCl ₂ מבלי להפריע את החרוזים על ידי שפיכת בזהירות הפתרון CaCl ₂ לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל, ולהעביר את החרוזים הנותרים בתמיסה CaCl ₂ לתוך צינור אחר 50 מ"ל חרוטי.
6. שטוף את החרוזים עם 10 מיליליטר של 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) חיץ שלוש פעמים כדי להסיר תאים מופרזים CaCl ₂ ובטלו כמוסים.
   הערה: בכל צעד נתון, לא בצנטריפוגה חרוזים מכיוון שהדבר יהיה קרע אותם. כדי להפריד את החרוזים מן הפתרון, לאפשר ההשעיה לעמוד באין מפריע במשך 3 - 5 דקות. החרוזים יישבו בתחתית ואת החיץ לשטוף ניתן יצקלתוך מיכל אחר.
   1. אל תמחק למאגר לשטוף בשימוש. פינת למאגר לשטוף Tris-HCl בשימוש (30 מ"ל) עם הפתרון CaCl ₂ משומשים שנאספו שלב 4.5.
7. גלולה בלתי משותק E. קולי תאים על ידי צנטריפוגה של הפתרון Tris-HCl CaCl ₂ ונקווה שנאספו שלב 4.6 ב 3,200 XG במשך 20 דקות. כדי לקבוע את היעילות וקיבוע, לחשב את הצפיפות של תאים בלתי-כמוס pelleted ב gDCW / L כמתואר בשלב 2.1.
8. מעביר את חרוזי שטף משלב 4.6 לתוך צינור. בצע את השלבים 2.2 - 3.4 להעריך את ביוסינתזה L-xylulose באמצעות כל החרוזים שטף במקום כדורי תא.

5. Assay יציבות המשותק biocatalysts עבור הפקת L-xylulose

1. לאסוף את החרוזים משלב 4.8 ולשטוף פעמיים עם 10 מ"ל של 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) חיץ ללא צנטריפוגה (כמתואר שלב 4.6).
2. השתמש בכלשל חרוזים שטף לבצע את התגובה כמתואר בשלבים 2.2 - 3.4.
3. חזור על שלבים 5.1 - 5.2 המספר הרצוי של מחזורי ייצור למדוד את כמות L-xylulose המיוצר supernatant התגובה בכל מחזור.

תוצאות

כדי לאפשר התחדשות פקטור, סינתזת L-xylulose בוצעה במערכת biocatalytic כל תא מצמידים המכילה E. coli _HjLAD וא תאי _SpNox coli. בעקבות אופטימיזציה של פרמטרים שונים, השימוש החוזר של מערכת זו שופר על ידי משתק אותו חרוזי אלגינט סידן (איור ...

Discussion

פיתוחים טכנולוגיים אחרונים אפשרו התפרצות של המסחור של Biotherapeutics רקומביננטי, וכתוצאה מכך עלייה הדרגתית בשווי השוק שלהן בתעשיית הביוטכנולוגיה. קידום אחת כזו הוא כניסתו של הנדסת מטבולית מיקרואורגניזמים רקומביננטי, אשר הוכיחה הבטחה גדולה בהקמת ³⁸ מערכות תעשייתיות...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB broth	Sigma Aldrich	L3022-6X1KG
Kanamycin	Fisher	BP906-5
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758-10G
Tris base	Fisher	BP1521
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate	Sigma Aldrich	N7004-1G
L-Arabinitol	Sigma Aldrich	A3506-10G
L-Cysteine	Sigma Aldrich	168149
Sulfuric acid	Sigma Aldrich	320501-500ML
Carbazole	Sigma Aldrich	C5132
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Sodium alginate	Sigma Aldrich	W201502
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	223506-500G
Excella E24 shaker incubator	New Brunswick Scientific
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer	Agilent Technologies
Centrifuge 5810R	Eppendrof
Beakers	Fisher
Syringe	Fisher
Needle	Fisher
Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance	Ohaus