Una novela<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Banda Técnica para alterar intracardiaca Hemodinámica en un sistema embrionario de pollo

Resumen

For the first time we present here a reproducible banding procedure to alter hemodynamics in the developing heart ex ovo. This is achieved by partially constricting the outflow tract (OFT).

Resumen

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and molecular level. To alter intracardiac hemodynamics, fertilized chicken eggs are incubated in a humidified chamber to obtain embryos of the desired stage (HH17). Once this developmental stage is achieved, the embryo is maintained ex ovo and hemodynamics in the embryonic heart are altered by partially constricting the outflow tract (OFT) with a surgical suture at the junction of the OFT and ventricle (OVJ). Control embryos are also cultured ex ovo but are not subjected to the surgical intervention. Banded and control embryos are then incubated in a humidified incubator for the desired period of time, after which 2D ultrasound is employed to analyze the change in blood flow velocity at the OVJ as a result of OFT banding. Once embryos are maintained ex ovo, it is important to ensure adequate hydration in the incubation chamber so as to prevent drying and eventually embryo death. Using this new banded model, it is now possible to perform analyses of changes in the expression of key players involved in valve development and to understand the role of hemodynamics on cellular responses in vivo, which could not be achieved previously.

Introducción

Abnormally formed outflow valves are the most common type of congenital heart defects ¹. However, defective cardiac valve structure and function, even though present at birth, may become symptomatic only in adulthood. In fact, several adult valve diseases can be attributed to a congenital origin. Treatment of such patients often involves replacing defective valves, and, importantly, replaced aortic valves have been shown to have congenital anomalies ². Given the fact that critical processes involved in valve development begin early during embryogenesis, the importance of better understanding the mechanisms that regulate these events is highlighted.

The primitive heart tube, which is the first functioning organ in an embryo, exhibits two distinct layers - an endothelial endocardium surrounded by myocardium - separated by extracellular matrix (cardiac jelly) which is mostly produced and secreted by the myocardium ^3-5. As development continues, valve primordia (endocardial cushions) are formed, after rightward looping of the embryonic heart, by local expansion of the cardiac jelly at the atrioventricular (AV) canal and the outflow tract (OFT) ^4,6. This expansion is mediated by the highly regulated process of epithelial-mesenchymal transition (EMT), during which the cardiac jelly becomes populated by endocardially-derived mesenchymal cells ⁶. In addition to the mesenchymal population derived through EMT, neural crest cells are also involved in valvulogenesis of the OFT ³.

Hemodynamic stimuli, such as shear stress, are important epigenetic factors that regulate heart development in the embryo ^7,8. Using a 3D in vitro system, we have previously shown shear stress to be a factor influencing the expression and deposition of fibrous extracellular matrix (ECM) proteins in AV and OFT cushions ^9,10. Moreover, studies carried out by several researchers have demonstrated that altered blood flow leads to improper valves and septa formation ^11-16. Recently, using the novel banding procedure presented here, we have shown that changing hemodynamics in the embryonic chick heart affects the early processes involved in OFT valve formation ¹⁷.

The technique described here provides a novel model for altering hemodynamics in the developing chick heart by partially constricting the OFT ex ovo. This reproducible procedure is relatively quick and allows researchers to obtain a sufficient number of embryos/whole hearts/OFT tissue, etc. for downstream analyses including gene expression studies. Moreover, this new model can be used to study 'chronic' effects of altered hemodynamics on OFT valve development.

Protocolo

embriones de aves no se consideran animales vertebrados bajo las regulaciones IUCAC.

1. La obtención de embriones para la cirugía

1. Incubar 80 - 90 huevos de gallina fertilizados Bovan (romo) terminan en un humidificado (60%) del eje de balancín incubadora a 40 ° C durante aproximadamente 72 h para obtener embriones a Hamilton y Hamburger (HH) etapa 17. Determinar el número exacto de los huevos sobre la base de el análisis del poder y la tasa de supervivencia de los embriones ^17. Use bandejas de huevos de plástico para la incubación para permitir la circulación de aire adecuada.
2. Una vez que se alcanza esta etapa de desarrollo deseada, vierta aproximadamente 20 ml de (37 ° C) de tampón caliente de Tyrode (suplementado con bicarbonato de sodio (1 g / L)) en un 100 mm x 26 mm placa de Petri.
3. Esterilizar una cáscara de huevo con un 70% de etanol.
4. Suavemente romper la cáscara con un mango de bisturí y liberar cuidadosamente su contenido en el plato que contiene tampón de Tyrode. Desechar los embriones si (i) que aparecen visualmente anormal (ii)No están en fase de desarrollo a la derecha (iii) que están orientadas incorrectamente sobre la yema y / o (iv) se produce cualquier sangrado. Retener cualquier embriones no sometidos a cirugía inmediatamente después de ser colocado ex ovo a 40 ° C con el fin de no comprometer el desarrollo.
   Nota: La estadificación se realiza en base a Hamilton y Hamburger ^18. Anormalidad de embriones de pollo se determina por el ojo desnudo y en el ámbito de la disección. Asegúrese de que el embrión tiene plegamiento apropiado y flexión y la vasculatura.

2. OFT Bandas

1. Con pinzas individuales hilos de 1 cm de largo de una sola sutura quirúrgica 11/0 de nylon y formar un nudo flojo. UV esterilizar todos los nudos preformados.
2. Bajo un microscopio de disección, asegurar visualmente que el corazón late a un ritmo normal (~ 120 latidos / min). Si no es así, desechar el embrión.
3. Justo antes de la cirugía, aplique 5 - 6 ml de (C 37 °) tampón de Tyrode caliente a la superficie del embrión utilizando una pipeta de transferencia.
4. Pase un extremo libre del nudo preformado bajo la OFT, la posición de la sutura en el OFT / unión ventrículo (OVJ) (o la ubicación deseada), y pasar el extremo libre en el nudo de la constricción de este modo la OFT incluyendo las membranas que rodean el corazón.
5. Después de la cirugía, mojar la superficie de la yema con 5 - 6 ml de tibia (37 ° C) tampón de Tyrode utilizando una pipeta de transferencia.
6. Mantener el control de embriones ex ovo ya que los embriones en bandas; Sin embargo no someterlas al procedimiento quirúrgico.
7. Incubar los embriones, por la cantidad deseada de tiempo, a 40 ° C en un incubador humidificado (60%).
8. Una vez que se alcanza el punto de tiempo deseado, escindir el embrión a partir de la yema de huevo con unas tijeras rectas. Diseccionar el corazón con unas pinzas finas y el uso de varios estudios posteriores, tales como cambios en la morfología cardiaca debido a la alteración hemodinámica ^17.

3. Confirmación de que la intervención de las bandas provoca un cambio en Hemodinámica

Nota: La constricción parcial causada por la intervención de bandas conduce a un aumento de la velocidad del flujo sanguíneo en el OVJ. Este parámetro hemodinámico se evalúa convenientemente usando imágenes por ultrasonido 2D, que se realiza en el punto de tiempo deseado del experimento.

1. Dado que sólo un único embrión se pueden obtener imágenes a la vez, mantener todos los otros embriones designados para formación de imágenes de ultrasonidos en un 40 ° C incubadora.
2. Coloque la placa de Petri que contiene el embrión para formar una imagen sobre una almohadilla térmica a 40 ° C.
3. Llenar el recipiente, hasta el borde, con tampón caliente (37 ° C) de Tyrode. Verter lentamente la solución tampón en el plato con el fin de mantener intacta la yema. Si, sin embargo, la integridad de la yema se ve comprometida durante este paso, desechar el embrión.
4. Orient el embrión de manera que el eje central del embrión es perpendicular a la sonda de ultrasonido que está suspendido de un soporte ajustable.
5. Con la ópera máquina de ultrasonidoting en modo B, la obtención de una imagen 2D del corazón que late en la pantalla y mover la etapa (almohadilla térmica) de tal manera que la OFT, ventrículo y OVJ son claramente visibles.
6. Cambiar al modo de onda pulsada (PW), en la frecuencia de repetición de impulsos deseada (por ejemplo, 20 kHz) y obtener datos de velocidad exactamente en el OVJ. Una imagen en modo B de los latidos del corazón se obtiene en la pantalla.
   1. Mover el escenario para ver la OFT, ventrículo y la OVJ. Usando el software de la máquina de ultrasonido, obtener mediciones de la velocidad exactamente en el OVJ.

Nota: Si la frecuencia cardíaca de un embrión disminuye durante la proyección de imagen, datos de velocidad así obtenidos no deben ser utilizados para el análisis. Todos los embriones utilizados para mediciones de velocidad no deberían preferentemente ser utilizados para ningún otro experimentos después de la ecografía.

Resultados

Se muestra en la Figura 1 son instrumentos necesarios para bandas OFT recomendado. La placa de Petri (Figura 1A) que contiene el embrión ex ovo debe ser lo suficientemente profunda como para no destruir el embrión cuando se cubre con la tapa. Placas de petri profundas (Figura 1C) también deberían utilizarse para obtener imágenes de ultrasonido para permitir un volumen adecuado de tampón de Tyrode que se vierte encima de la...

Discusión

Esta técnica es relativamente rápida y fácil de realizar, sin embargo ciertos puntos clave deben ser tenidos en cuenta a fin de obtener resultados precisos aguas abajo. Los embriones deben mantenerse ex ovo en una placa de Petri que contiene tampón de Tyrode para proporcionar una adecuada rehidratación. También es importante para hidratar la yema después de la cirugía con tampón de Tyrode y para asegurarse de que la cámara de incubación se hidrata adecuadamente. Las cirugías no deben realizarse en u...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fertilized Bovan chicken eggs	Clemson University, Clemson, SC
11 / 0 Nylon suture	Ashaway	S30001	UV sterilize knots before surgery
100 x 26 mm petri dish	VWR	25387-030
Transfer pipettes	Thermo Scientific	232-20S
Scalpel handle #3	Fine Science Tools	91003-12
Straight scissor	Roboz	RS-6702
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools	11254-20
Tyrodes buffer	Sigma-Aldrich	2145-10L	Filter sterlize before use
Sodium bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500
Vevo 770 Ultrasound Imaging system	VisualSonics, Inc.	VS-11392
708 Ultrasound transducer	VisualSonics, Inc.	VS-11171