Роман<em&gt; Ex Ово</em&gt; Кольцевание Техника Альтер внутрисердечной гемодинамики в системе Эмбриональные Chicken

Резюме

For the first time we present here a reproducible banding procedure to alter hemodynamics in the developing heart ex ovo. This is achieved by partially constricting the outflow tract (OFT).

Аннотация

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and molecular level. To alter intracardiac hemodynamics, fertilized chicken eggs are incubated in a humidified chamber to obtain embryos of the desired stage (HH17). Once this developmental stage is achieved, the embryo is maintained ex ovo and hemodynamics in the embryonic heart are altered by partially constricting the outflow tract (OFT) with a surgical suture at the junction of the OFT and ventricle (OVJ). Control embryos are also cultured ex ovo but are not subjected to the surgical intervention. Banded and control embryos are then incubated in a humidified incubator for the desired period of time, after which 2D ultrasound is employed to analyze the change in blood flow velocity at the OVJ as a result of OFT banding. Once embryos are maintained ex ovo, it is important to ensure adequate hydration in the incubation chamber so as to prevent drying and eventually embryo death. Using this new banded model, it is now possible to perform analyses of changes in the expression of key players involved in valve development and to understand the role of hemodynamics on cellular responses in vivo, which could not be achieved previously.

Введение

Abnormally formed outflow valves are the most common type of congenital heart defects ¹. However, defective cardiac valve structure and function, even though present at birth, may become symptomatic only in adulthood. In fact, several adult valve diseases can be attributed to a congenital origin. Treatment of such patients often involves replacing defective valves, and, importantly, replaced aortic valves have been shown to have congenital anomalies ². Given the fact that critical processes involved in valve development begin early during embryogenesis, the importance of better understanding the mechanisms that regulate these events is highlighted.

The primitive heart tube, which is the first functioning organ in an embryo, exhibits two distinct layers - an endothelial endocardium surrounded by myocardium - separated by extracellular matrix (cardiac jelly) which is mostly produced and secreted by the myocardium ^3-5. As development continues, valve primordia (endocardial cushions) are formed, after rightward looping of the embryonic heart, by local expansion of the cardiac jelly at the atrioventricular (AV) canal and the outflow tract (OFT) ^4,6. This expansion is mediated by the highly regulated process of epithelial-mesenchymal transition (EMT), during which the cardiac jelly becomes populated by endocardially-derived mesenchymal cells ⁶. In addition to the mesenchymal population derived through EMT, neural crest cells are also involved in valvulogenesis of the OFT ³.

Hemodynamic stimuli, such as shear stress, are important epigenetic factors that regulate heart development in the embryo ^7,8. Using a 3D in vitro system, we have previously shown shear stress to be a factor influencing the expression and deposition of fibrous extracellular matrix (ECM) proteins in AV and OFT cushions ^9,10. Moreover, studies carried out by several researchers have demonstrated that altered blood flow leads to improper valves and septa formation ^11-16. Recently, using the novel banding procedure presented here, we have shown that changing hemodynamics in the embryonic chick heart affects the early processes involved in OFT valve formation ¹⁷.

The technique described here provides a novel model for altering hemodynamics in the developing chick heart by partially constricting the OFT ex ovo. This reproducible procedure is relatively quick and allows researchers to obtain a sufficient number of embryos/whole hearts/OFT tissue, etc. for downstream analyses including gene expression studies. Moreover, this new model can be used to study 'chronic' effects of altered hemodynamics on OFT valve development.

протокол

Эмбрионов птиц не считаются позвоночных животных согласно правилам IUCAC.

1. Получение зародыши для хирургии

1. Выдержите 80 - 90 оплодотворенные куриные яйца Bovan (тупым концом вверх) в увлажненной (60%) качающегося инкубаторе при 40 ° С в течение примерно 72 часов, чтобы получить эмбрионы в Гамильтон и Гамбургский (HH) этап 17. Определить точное количество яиц, основанных на анализ мощности и выживаемость эмбрионов ^17. Используйте пластиковые лотки яиц для инкубации, чтобы обеспечить достаточную циркуляцию воздуха.
2. После того, как это желательно стадии развития достигается, влить приблизительно 20 мл теплой (37 ° С) буфера Тирода (дополненной раствором бикарбоната натрия (1 г / л)) в 100 мм х 26 мм чашках Петри.
3. Стерилизовать яичную скорлупу с 70% этанола.
4. Аккуратно взломать оболочку с скальпелем и осторожно освободить его содержимое в чашку, содержащую буфер Тирода. Откажитесь эмбрионов, если (I) они визуально появляются аномальные (II) онине на правой стадии развития (III) они неправильно ориентированы на желток и / или (IV) любое кровотечение происходит. Удержания любых эмбрионов не подвергнутых операции сразу после размещения экс ово при 40 ° С с тем, чтобы не поставить под угрозу развитие.
   Примечание: Балетмейстер выполняется на основе Гамильтон и гамбургер ^18. Аномалии куриных эмбрионов определяется невооруженным глазом и под сферу рассечение. Убедитесь в том, что эмбрион имеет соответствующую складывание и изгиб и сосудистая сеть.

2. OFT кольцевание

1. Выщипывать индивидуальные 1 см длиной нити из одного 11/0 нейлоновой хирургического шва и образуют свободный узел. UV стерилизовать все узлы предварительно образованные.
2. Под микроскопом рассечение, визуально убедиться, что сердце бьется с нормальной скоростью (~ 120 уд / мин). Если нет, то отказаться от эмбриона.
3. Непосредственно перед операцией, нанесите 5 - 6 мл теплой (37 ° С) буфере Тирода к поверхности эмбриона с помощью пипетки передачи.
4. Пропустите один свободный конец узла отформованной под OFT, установите шовный на OFT / желудочек перехода (OVJ) (или желаемое место нахождения), и передать свободный конец в узел, тем самым сужая OFT в том числе мембран, окружающих сердце.
5. После операции, смачивают поверхность желтка с 5 - 6 мл теплого (37 ° С), буфер Тирода с использованием передачи пипетки.
6. Сохранить контроль над эмбрионами ех ово как полосчатых эмбрионов; однако не подвергать их хирургической процедуры.
7. Инкубируйте эмбрионов в течение требуемого количества времени, при 40 ° C в увлажненной (60%) инкубаторе.
8. После того, как желаемый момент времени достигается, акцизного эмбриона от желтка, используя прямые ножницы. Рассеките сердце с тонким пинцетом и использовать в течение нескольких последующих исследований , таких как изменения в сердечной морфологии из - за измененной гемодинамики ^17.

3. подтверждая, что кольцевание вмешательство вызывает изменение в гемодинамику

Примечание: Частичное сужение, вызванное вмешательством обвязочной приводит к увеличению скорости кровотока в OVJ. Этот параметр гемодинамический удобно оценены с использованием 2D ультразвукового изображения, которая выполняется в нужной точке времени эксперимента.

1. Так как только один эмбрион может быть отображены в то время, поддерживать все остальные эмбрионы, предназначенные для ультразвуковой визуализации в 40 ° С инкубатор.
2. Поместите чашку Петри, содержащую зародыш быть отображены на грелку, установленной при 40 ° C.
3. Заполните блюдо, до краев, с теплым (37 ° С) буфера Тирода. Медленно влить буферный раствор в сосуде с тем, чтобы сохранить желток нетронутыми. Если, тем не менее, целостность желтка под угрозу в течение этого шага, отказаться от эмбриона.
4. Orient эмбрион таким образом, что центральная ось эмбриона перпендикулярна к ультразвуковым зондом, который подвешен с регулируемой подставкой.
5. С машиной ультразвука оперытин в B-режиме, получить 2D-изображение бьющегося сердца на экране и переместите ступени (грелку) таким образом, что OFT, желудочек и OVJ отчетливо видны.
6. Переключение в режим импульсно-волнового (PW), на частоте повторения импульсов желательно (например, 20 кГц) и получить данные по скорости точно в OVJ. B-режим изображение бьющегося сердца получается на экране.
   1. Переместить сцену, чтобы увидеть OFT, желудочек и OVJ. С помощью программного обеспечения ультразвукового аппарата, получить измерения скорости именно на OVJ.

Примечание: Если частота сердечных сокращений эмбриона уменьшается во время формирования изображения, данные скорости, полученные таким образом, не следует использовать для анализа. Все эмбрионы, используемые для измерения скорости предпочтительно не следует использовать для других экспериментов после ультразвуковой визуализации.

Результаты

Показанный на рисунке 1 рекомендуются инструменты , необходимые для OFT полосатость. Чашки Петри (Фигура 1А) , содержащий зародыш ех ово должно быть достаточно глубоким , чтобы не разрушать эмбрион , когда покрыта крышкой. Глубокие чашки Петри (?...

Обсуждение

Этот метод является относительно быстро и легко выполнить, однако некоторые ключевые моменты, необходимо иметь в виду, таким образом, чтобы получить точные результаты вниз по течению. Эмбрионы следует поддерживать ех ово в чашке Петри, содержащей буфер Тирода , чтобы обеспечить ад...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fertilized Bovan chicken eggs	Clemson University, Clemson, SC
11 / 0 Nylon suture	Ashaway	S30001	UV sterilize knots before surgery
100 x 26 mm petri dish	VWR	25387-030
Transfer pipettes	Thermo Scientific	232-20S
Scalpel handle #3	Fine Science Tools	91003-12
Straight scissor	Roboz	RS-6702
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools	11254-20
Tyrodes buffer	Sigma-Aldrich	2145-10L	Filter sterlize before use
Sodium bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500
Vevo 770 Ultrasound Imaging system	VisualSonics, Inc.	VS-11392
708 Ultrasound transducer	VisualSonics, Inc.	VS-11171