Um romance<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Técnica Banding para Alter intracardíaca Hemodinâmica em um sistema embrionário de galinha

Resumo

For the first time we present here a reproducible banding procedure to alter hemodynamics in the developing heart ex ovo. This is achieved by partially constricting the outflow tract (OFT).

Resumo

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and molecular level. To alter intracardiac hemodynamics, fertilized chicken eggs are incubated in a humidified chamber to obtain embryos of the desired stage (HH17). Once this developmental stage is achieved, the embryo is maintained ex ovo and hemodynamics in the embryonic heart are altered by partially constricting the outflow tract (OFT) with a surgical suture at the junction of the OFT and ventricle (OVJ). Control embryos are also cultured ex ovo but are not subjected to the surgical intervention. Banded and control embryos are then incubated in a humidified incubator for the desired period of time, after which 2D ultrasound is employed to analyze the change in blood flow velocity at the OVJ as a result of OFT banding. Once embryos are maintained ex ovo, it is important to ensure adequate hydration in the incubation chamber so as to prevent drying and eventually embryo death. Using this new banded model, it is now possible to perform analyses of changes in the expression of key players involved in valve development and to understand the role of hemodynamics on cellular responses in vivo, which could not be achieved previously.

Introdução

Abnormally formed outflow valves are the most common type of congenital heart defects ¹. However, defective cardiac valve structure and function, even though present at birth, may become symptomatic only in adulthood. In fact, several adult valve diseases can be attributed to a congenital origin. Treatment of such patients often involves replacing defective valves, and, importantly, replaced aortic valves have been shown to have congenital anomalies ². Given the fact that critical processes involved in valve development begin early during embryogenesis, the importance of better understanding the mechanisms that regulate these events is highlighted.

The primitive heart tube, which is the first functioning organ in an embryo, exhibits two distinct layers - an endothelial endocardium surrounded by myocardium - separated by extracellular matrix (cardiac jelly) which is mostly produced and secreted by the myocardium ^3-5. As development continues, valve primordia (endocardial cushions) are formed, after rightward looping of the embryonic heart, by local expansion of the cardiac jelly at the atrioventricular (AV) canal and the outflow tract (OFT) ^4,6. This expansion is mediated by the highly regulated process of epithelial-mesenchymal transition (EMT), during which the cardiac jelly becomes populated by endocardially-derived mesenchymal cells ⁶. In addition to the mesenchymal population derived through EMT, neural crest cells are also involved in valvulogenesis of the OFT ³.

Hemodynamic stimuli, such as shear stress, are important epigenetic factors that regulate heart development in the embryo ^7,8. Using a 3D in vitro system, we have previously shown shear stress to be a factor influencing the expression and deposition of fibrous extracellular matrix (ECM) proteins in AV and OFT cushions ^9,10. Moreover, studies carried out by several researchers have demonstrated that altered blood flow leads to improper valves and septa formation ^11-16. Recently, using the novel banding procedure presented here, we have shown that changing hemodynamics in the embryonic chick heart affects the early processes involved in OFT valve formation ¹⁷.

The technique described here provides a novel model for altering hemodynamics in the developing chick heart by partially constricting the OFT ex ovo. This reproducible procedure is relatively quick and allows researchers to obtain a sufficient number of embryos/whole hearts/OFT tissue, etc. for downstream analyses including gene expression studies. Moreover, this new model can be used to study 'chronic' effects of altered hemodynamics on OFT valve development.

Protocolo

embriões de aves não são considerados animais vertebrados nos termos da regulamentação IUCAC.

1. A obtenção de embriões para Cirurgia

1. Incubar 80 - 90 ovos de galinha fertilizados Bovan (sem corte final para cima) em um umidificado (60%) incubadora roqueiro a 40 ° C durante aproximadamente 72 horas para se obter embriões em Hamilton e Hamburger (HH) estágio 17. Determinar o número exato de ovos com base em análise de poder e taxa de sobrevivência de embriões ^17. Use bandejas de ovos de plástico para a incubação para permitir a circulação de ar adequada.
2. Uma vez que esta fase de desenvolvimento desejado é atingido, coloque aproximadamente 20 ml de tampão quente (37 ° C) de Tyrode (suplementado com bicarbonato de sódio (1 g / L)) em 100 mm x 26 mm de placa de petri.
3. Esterilizar uma casca de ovo com 70% de etanol.
4. Suavemente quebrar a casca com um cabo de bisturi e solte cuidadosamente o seu conteúdo para o prato contendo tampão de Tyrode. Descartar embriões se (i) que visualmente parece anormal (ii)não estão na fase de desenvolvimento direita (iii) forem mal orientados sobre a gema e / ou (iv) ocorre o sangramento. Reter quaisquer embriões não sujeitos a cirurgia imediatamente após ser colocado ex ovo a 40 ° C de modo a não comprometer o desenvolvimento.
   Nota: Staging é realizada com base em Hamilton e Hamburger ^18. A anormalidade de embriões de galinha é determinada a olho nu e sob o escopo de dissecação. Certifique-se que o embrião tem dobragem apropriada e flexão e vasculatura.

2. OFT Banding

1. Tweeze out individuais tópicos de 1 cm de comprimento de um único 11/0 nylon sutura cirúrgica e formar um nó frouxo. UV esterilizar todos nós pré-formados.
2. Sob um microscópio de dissecção, visualmente assegurar que o coração está a bater, a uma taxa normal (~ 120 batimentos / min). Se não, descartar o embrião.
3. Imediatamente antes da cirurgia, aplica 5 - 6 ml de tampão quente (37 ° C) de Tyrode à superfície do embrião utilizando uma pipeta de transferência.
4. Passe uma extremidade livre do nó pré-formada sob o OFT, posicione a sutura na junção OFT / ventrículo (OVJ) (ou local desejado), e passar a extremidade livre para o nó contraindo assim o OFT incluindo as membranas que envolvem o coração.
5. Após a cirurgia, molhar a superfície da gema com 5 - 6 mL de água morna (37 ° C) utilizando tampão de Tyrode uma pipeta de transferência.
6. Manter embriões de controlo ex ovo como os embriões faixas; no entanto, não submetê-las com o procedimento cirúrgico.
7. Incubar os embriões, durante o período de tempo desejado, a 40 ° C em um (60%) incubador humidificado.
8. Uma vez que o ponto de tempo desejado seja alcançado, extirpar o embrião da gema com uma tesoura reta. Dissecar o coração com uma pinça fina e usar para diversos estudos a jusante, tais como alterações na morfologia cardíaca devido a hemodinâmica alterada ^17.

3. Afirmar que a intervenção Banding provoca uma mudança na Hemodinâmica

Nota: A constrição parcial causado pela intervenção bandas leva a um aumento da velocidade do fluxo sanguíneo na OVJ. Este parâmetro hemodinâmico é convenientemente avaliada utilizando ecografia 2D de imagem, a qual é realizada no ponto de tempo desejado do experimento.

1. Uma vez que apenas um único embrião pode ser trabalhada ao mesmo tempo, manter todas as outras embriões designados para imagiologia de ultra-sons numa incubadora a 40 ° C.
2. Colocar a placa de petri contendo o embrião a ser trabalhada sobre uma almofada de aquecimento para 40 ° C.
3. Encha o prato, até a borda, com tampão quente (37 ° C) de Tyrode. Lentamente, deitar a solução de tampão para o prato de modo a manter a gema intacta. Se, no entanto, a integridade da gema seja comprometida durante este passo, descartar o embrião.
4. Oriente o embrião de tal modo que o eixo central do embrião é perpendicular à sonda de ultra-sons, que está suspensa a partir de um suporte ajustável.
5. Com a ópera máquina de ultra-somting no modo B, obter uma imagem 2D do coração batendo na tela e mover o palco (almofada de aquecimento) de tal forma que o OFT, ventrículo e OVJ são claramente visíveis.
6. Mudar para o modo pulsado de ondas (PW), com a frequência de repetição do pulso desejado (por exemplo, 20 kHz) e obter dados de velocidade exatamente no OVJ. Uma imagem em modo B do batimento cardíaco é obtido na tela.
   1. Mova o palco para ver o OFT, ventrículo e da OVJ. Usando o software da máquina de ultra-som, obter medições de velocidade exatamente no OVJ.

Nota: Se a frequência cardíaca de um embrião diminui durante a imagem, dados de velocidade assim obtidos não devem ser utilizados para a análise. Todos os embriões utilizados para medições de velocidade devem, preferencialmente, ser utilizados para quaisquer outros experimentos após ultra-sonografia.

Resultados

Mostrado na Figura 1 são os instrumentos necessários para OFT banding recomendado. A placa de petri (Figura 1A), contendo o embrião ex ovo deve ser suficientemente profundo, de forma a não destruir o embrião quando coberta com a tampa. As placas de Petri profundas (Figura 1C) também deve ser utilizado para imagiologia de ultra-sons para permitir um volume adequado de tampão de Tyrode para ser derramado sobre a gema.

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Discussão

Esta técnica é relativamente rápido e fácil de executar, no entanto alguns pontos essenciais precisam ser mantidos em mente, de modo a obter resultados a jusante precisos. Os embriões deve ser mantido ex ovo numa placa de Petri que contém tampão de Tyrode para proporcionar re-hidratação adequada. Também é importante para hidratar a gema de pós-operatório com tampão de Tyrode e para garantir que a câmara de incubação é adequadamente hidratado. Cirurgias não deve ser realizada em um embrião se...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fertilized Bovan chicken eggs	Clemson University, Clemson, SC
11 / 0 Nylon suture	Ashaway	S30001	UV sterilize knots before surgery
100 x 26 mm petri dish	VWR	25387-030
Transfer pipettes	Thermo Scientific	232-20S
Scalpel handle #3	Fine Science Tools	91003-12
Straight scissor	Roboz	RS-6702
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools	11254-20
Tyrodes buffer	Sigma-Aldrich	2145-10L	Filter sterlize before use
Sodium bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500
Vevo 770 Ultrasound Imaging system	VisualSonics, Inc.	VS-11392
708 Ultrasound transducer	VisualSonics, Inc.	VS-11171