Bir roman<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Yapıştırma Tekniği bir Embriyonik tavuk Sistemde İntrakardiyak hemodinamiği Alter

Özet

For the first time we present here a reproducible banding procedure to alter hemodynamics in the developing heart ex ovo. This is achieved by partially constricting the outflow tract (OFT).

Özet

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and molecular level. To alter intracardiac hemodynamics, fertilized chicken eggs are incubated in a humidified chamber to obtain embryos of the desired stage (HH17). Once this developmental stage is achieved, the embryo is maintained ex ovo and hemodynamics in the embryonic heart are altered by partially constricting the outflow tract (OFT) with a surgical suture at the junction of the OFT and ventricle (OVJ). Control embryos are also cultured ex ovo but are not subjected to the surgical intervention. Banded and control embryos are then incubated in a humidified incubator for the desired period of time, after which 2D ultrasound is employed to analyze the change in blood flow velocity at the OVJ as a result of OFT banding. Once embryos are maintained ex ovo, it is important to ensure adequate hydration in the incubation chamber so as to prevent drying and eventually embryo death. Using this new banded model, it is now possible to perform analyses of changes in the expression of key players involved in valve development and to understand the role of hemodynamics on cellular responses in vivo, which could not be achieved previously.

Giriş

Abnormally formed outflow valves are the most common type of congenital heart defects ¹. However, defective cardiac valve structure and function, even though present at birth, may become symptomatic only in adulthood. In fact, several adult valve diseases can be attributed to a congenital origin. Treatment of such patients often involves replacing defective valves, and, importantly, replaced aortic valves have been shown to have congenital anomalies ². Given the fact that critical processes involved in valve development begin early during embryogenesis, the importance of better understanding the mechanisms that regulate these events is highlighted.

The primitive heart tube, which is the first functioning organ in an embryo, exhibits two distinct layers - an endothelial endocardium surrounded by myocardium - separated by extracellular matrix (cardiac jelly) which is mostly produced and secreted by the myocardium ^3-5. As development continues, valve primordia (endocardial cushions) are formed, after rightward looping of the embryonic heart, by local expansion of the cardiac jelly at the atrioventricular (AV) canal and the outflow tract (OFT) ^4,6. This expansion is mediated by the highly regulated process of epithelial-mesenchymal transition (EMT), during which the cardiac jelly becomes populated by endocardially-derived mesenchymal cells ⁶. In addition to the mesenchymal population derived through EMT, neural crest cells are also involved in valvulogenesis of the OFT ³.

Hemodynamic stimuli, such as shear stress, are important epigenetic factors that regulate heart development in the embryo ^7,8. Using a 3D in vitro system, we have previously shown shear stress to be a factor influencing the expression and deposition of fibrous extracellular matrix (ECM) proteins in AV and OFT cushions ^9,10. Moreover, studies carried out by several researchers have demonstrated that altered blood flow leads to improper valves and septa formation ^11-16. Recently, using the novel banding procedure presented here, we have shown that changing hemodynamics in the embryonic chick heart affects the early processes involved in OFT valve formation ¹⁷.

The technique described here provides a novel model for altering hemodynamics in the developing chick heart by partially constricting the OFT ex ovo. This reproducible procedure is relatively quick and allows researchers to obtain a sufficient number of embryos/whole hearts/OFT tissue, etc. for downstream analyses including gene expression studies. Moreover, this new model can be used to study 'chronic' effects of altered hemodynamics on OFT valve development.

Protokol

Kuş embriyolar IUCAC yönetmelikleri uyarınca omurgalı hayvanlar olarak kabul edilmez.

1. Cerrahi Embriyolar Alınması

1. 80 inkübe - Hamilton ve Hamburger (HH) aşamasında embriyolar elde etmek için yaklaşık 72 saat boyunca 40 ° C'de bir nemlendirilmiş (% 60) rocker inkübatör 90 döllenmiş Bovan tavuk yumurtası (kör uç yukarı) 17. dayalı yumurta sayısını tam olarak belirlemek güç analizi ve embriyoların ¹⁷ sağkalım oranı. yeterli hava dolaşımı sağlamak için inkübasyon için plastik yumurta tepsileri kullanın.
2. Bu istenilen gelişimsel aşamada elde edildikten sonra, 100 mm x 26 mm Petri kabı içine yaklaşık 20 ml (sodyum bikarbonat (1 g / L) ile desteklenmiş) Sıcak (37 ° C), Tyrode tampon dökün.
3. % 70 etanol ile bir yumurta kabuğu sterilize edin.
4. Yavaşça neşter sapı ile kabuk çatlak ve dikkatle Tyrode tampon içeren çanak içine içeriğini bırakın. onlar görsel görünür eğer embriyolar (i) atın anormal (ii)Sağ gelişim aşamasında (iii) yanlış sarısı ve / veya (iv) herhangi bir kanama meydana üzerine odaklı değil. Hemen gelişimi uzlaşma şekilde 40 ° C 'de ex ovo yerleştirildikten sonra cerrahi tabi herhangi bir embriyolar saklayın.
   Not: Takma Hamilton ve Hamburger ¹⁸ dayanarak yapılır. civciv embriyo anormallik çıplak gözle ve diseksiyon kapsamında belirlenir. Embriyo, uygun katlama ve büküm ve damarsal olduğundan emin olun.

2. OFT Bantlama

1. Tek 11/0 naylon cerrahi dikiş tek tek 1 cm uzunluğunda konuları dışarı tweeze ve gevşek bir düğüm oluşturur. Tüm önceden oluşturulmuş knot sterilize UV.
2. Diseksiyon mikroskobu altında, görsel kalp normal hızında (~ 120 atım / dk) yenerek emin olun. Değilse, embriyo atın.
3. Bir transfer pipet kullanarak embriyo yüzeyine sıcak (37 ° C) Tyrode tampon 6 ml - Sadece ameliyattan önce, 5 uygulayın.
4. , OFT altında önceden düğüm bir serbest ucunu geçirin OFT / ventrikül kavşak (OVJ) (ya da istenilen yere) at dikiş yerleştirin ve böylece kalbi çevreleyen zarların dahil OFT daraltıcı düğüme serbest ucunu geçmektedir.
5. Sıcak 6 ml (37 ° C) Tyrode tampon bir transfer pipet kullanarak - Ameliyattan sonra 5 ile sarısının yüzeyini ıslak.
6. Kontrol embriyolar bantlı embriyolar olarak ex ovo korumak; Ancak cerrahi onları maruz bırakmayın.
7. nemlendirilmiş (% 60) kuluçka makinesi içinde 40 ° C 'de, arzu edilen bir zaman miktarı için, embriyolar inkübe edin.
8. İstenilen zaman noktası ulaşıldığında, düz makas kullanarak sarısından embriyo tüketim. Ince forseps ile kalbi incelemek ve bu nedeniyle değişmiş hemodinami ¹⁷ kardiyak morfoloji değişiklikleri gibi birçok aşağı çalışmalar için kullanın.

3. Yapıştırma Müdahale Hemodinamiğin bir değişikliğe neden olduğunu onaylama

Not: bantlama müdahalesiyle kısmen daralma OVJ kan akış hızında bir artışa neden olur. Bu parametrelerden uygun deney istenen bir zaman noktasında gerçekleştirilir 2D ultrason görüntüleme kullanılarak değerlendirilir.

1. yalnızca tek bir embriyo, bir zaman görüntülenebilir için, 40 ° C kuluçka makinesi içinde ultrason görüntüleme için belirlenmiş diğer embriyolar korur.
2. embriyolu petri 40 ° C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığı görüntülenmek üzere yerleştirin.
3. Sıcak (37 ° C) Tyrode tampon ile, ağzına kadar, çanak doldurun. sağlam yumurta sarısı tutmak için çok yavaş çanak içine tampon çözelti dökün. Bununla birlikte, yumurta sarısı bütünlüğü, bu adım sırasında tehlikeye, embriyo atın.
4. embriyonun merkezi ekseni ayarlanabilir bir standdan süspansiyon haline ultrason probu dik olacak Orient embriyo gibi.
5. ultrason makinesi opera ileting B-modunda, ekranda kalpte bir 2D görüntü elde ve OFT, ventrikül ve OVJ açıkça görülebilir şekilde aşama (ısıtma yastığı) hareket ettirin.
6. İstenilen darbe tekrarlama frekansı (örneğin, 20 kHz) de, darbeli dalga (PW) moduna geçmek ve OVJ tam olarak hız verileri elde. kalpte bir B-mod görüntü ekranda elde edilir.
   1. OFT, ventrikül ve OVJ görmek için sahne taşıyın. ultrason makinesi yazılımı kullanarak, tam OVJ de hız ölçümleri elde edin.

Not: embriyonun kalp hızı görüntüleme sırasında azalırsa, bu şekilde elde edilen hız veri analizi için kullanılmamalıdır. Hız ölçümleri için kullanılan tüm embriyolar, tercihen ultrason görüntüleme ile başka deneyler için kullanılmamalıdır.

Sonuçlar

Şekil 1'de gösterildiği OFT bantlama için gerekli araçları tavsiye edilir. Kapakla kapatıldı embriyo yok etmeyecek şekilde embriyo eski ihtiva eden petri (Şekil 1A) ovo yeterince derin olması gerekmektedir. Derin Petri kutuları (Şekil 1C), aynı zamanda Tyrode tamponu yeterli miktarda sarısı üstüne döküldü izin vermek için, ultrason görüntüleme için kullanılmalıdır.

Tartışmalar

Bu teknik nispeten hızlı ve kolay uygulanabilir olması, ancak bazı önemli noktaları doğru aşağı sonuçlar elde edecek şekilde akılda tutulması gerekir. Embriyolar, yeterli rehidrasyon sağlamak Tyrode tamponu ihtiva eden bir petri tabağına ovo ex muhafaza edilmelidir. Tyrode tamponu ile yumurta sarısı sonrası ameliyat hidrat ve inkübasyon odası yeterince hidrate emin olmak için de önemlidir. Herhangi bir kanama görülebilir veya sarısı hatta biraz kırık ise ameliyatları bir embriyo ?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fertilized Bovan chicken eggs	Clemson University, Clemson, SC
11 / 0 Nylon suture	Ashaway	S30001	UV sterilize knots before surgery
100 x 26 mm petri dish	VWR	25387-030
Transfer pipettes	Thermo Scientific	232-20S
Scalpel handle #3	Fine Science Tools	91003-12
Straight scissor	Roboz	RS-6702
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools	11254-20
Tyrodes buffer	Sigma-Aldrich	2145-10L	Filter sterlize before use
Sodium bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500
Vevo 770 Ultrasound Imaging system	VisualSonics, Inc.	VS-11392
708 Ultrasound transducer	VisualSonics, Inc.	VS-11171