Las grabaciones de células enteras Patch-clamp en rodajas de cerebro

Resumen

Este protocolo se describen los pasos básicos de procedimiento para la realización de patch-clamp grabaciones de células enteras. Esta técnica permite el estudio del comportamiento eléctrico de las neuronas, y cuando se realiza en secciones de cerebro, permite la evaluación de varias funciones neuronales de las neuronas que todavía están integrados en los circuitos cerebrales relativamente bien conservadas.

Resumen

De células enteras de grabación de patch-clamp es una técnica electrofisiológica que permite el estudio de las propiedades eléctricas de una parte sustancial de la neurona. En esta configuración, la micropipeta está en estrecho contacto con la membrana de la célula, lo que impide la fuga de corriente y por lo tanto proporciona mediciones de corriente iónica más preciso que el método de grabación electrodo afilado intracelular utilizado anteriormente. Clásicamente, la grabación de célula entera se puede realizar en las neuronas en varios tipos de preparaciones, incluidos los modelos de cultivo celular, las neuronas disociadas, neuronas en rodajas de cerebro, y en animales anestesiados o despierto intactas. En resumen, esta técnica ha contribuido enormemente a la comprensión de las propiedades biofísicas pasivos y activos de las células excitables. Una ventaja principal de esta técnica es que proporciona información sobre la forma específica manipulaciones (por ejemplo, farmacológica, experimentador inducida por plasticidad) pueden alterar las funciones neuronales específicos o channels, en tiempo real. Además, la apertura significativa de la membrana de plasma permite que la solución de la pipeta interna para difundir libremente en el citoplasma, proporcionar medios para la introducción de medicamentos, por ejemplo, agonistas o antagonistas de las proteínas intracelulares específicas, y la manipulación de estos objetivos, sin alterar sus funciones en las células vecinas. En este artículo se centrará en la grabación de células enteras a cabo en las neuronas en rodajas de cerebro, una preparación que tiene la ventaja de grabación de las neuronas en los circuitos cerebrales relativamente bien conservados, es decir, en un contexto fisiológicamente relevante. En particular, cuando se combina con la farmacología adecuada, esta técnica es una poderosa herramienta que permite la identificación de neuroadaptaciones específicos que se produjeron después de cualquier tipo de experiencias, como el aprendizaje, la exposición a drogas de abuso, y el estrés. En resumen, las grabaciones de células enteras patch-clamp en rodajas de cerebro proporcionan medios para medir ex vivo de preparación de cambios de larga duraciónen las funciones neuronales que se han desarrollado en animales despiertos intactas.

Introducción

La técnica de patch-clamp, una técnica electrofisiológica que se ha desarrollado a finales de 1970 ^{de 1,2,} es una herramienta fundamental para el estudio de las funciones de los canales iónicos individuales o múltiples en el tejido vivo. Entre las diferentes configuraciones de parches que se pueden lograr, grabaciones de células enteras patch-clamp permiten el estudio del comportamiento eléctrico de una parte sustancial de la neurona. Clásicamente, esta técnica se realiza in vitro, ya sea en rodajas de cerebro, neuronas recién disociadas, o en modelos de cultivo celular ^3. Cuando se realiza en las neuronas en rodajas de cerebro, esta técnica presenta varias ventajas. En particular: (i) las neuronas se registran en los circuitos cerebrales relativamente conservadas que hasta cierto punto, y en comparación con las preparaciones de cultivo celular, proporcionan un ambiente que es fisiológicamente relevante ^3. Esto permite la captura temprana, o incluso el seguimiento en tiempo real, los eventos celulares y moleculares que son accionados por cualquier tipo de pharmacolog agudamanipulaciones iCal - una resolución temporal que no se puede lograr usando clásica en condiciones in vivo; (ii) la capacidad para identificar visualmente las regiones del cerebro en rodajas de cerebro permite una alta especificidad regional ³ tanto para la región del cerebro estudiada y para las neuronas específicas cuando expresan marcadores fluorescentes; (iii) el acceso al espacio intracelular de la célula mediante la apertura de una parte importante de la membrana plasmática (en contraste con la punción de la membrana con una micropipeta agudo para grabaciones intracelulares) ^4. A su vez, esto permite que el contenido o concentración de iones específicos que componen la solución interna a ser modificados objetivos así moleculares o mecanismos celulares pueden estudiarse bajo diferentes condiciones. Por ejemplo, al establecer la configuración de célula completa, cualquier agente farmacológico específico (por ejemplo, antagonistas) que se puede añadir a la micropipeta de grabación (parche pipeta) solución se difundirá directamente en el citoplasma y actuar en su putative dianas intracelulares sin alterar la función objetivo en las células vecinas. Además, en comparación con la grabación micropipeta agudo, la gran abertura en la punta del electrodo de patch clamp proporciona una resistencia más baja, menos ruido de la competencia, y por lo tanto un mejor acceso eléctrico al interior de la célula ^4. Sin embargo, en cuenta que la gran abertura en la punta de la pipeta puede conducir a la diálisis de células, y por lo tanto la pérdida de la maquinaria molecular intracelular que puede ser crítica para la expresión de los fenómenos biológicos que están bajo ^5,6 estudio. En este caso, las grabaciones de electrodos afilados pueden ser más adecuados. Este tipo de grabaciones requiere micropipetas con un poro que es mucho menor que los utilizados para las grabaciones de células enteras, evitando de este modo la mayor parte del intercambio iónico entre el espacio intracelular y la solución de la pipeta interna.

Cualquier forma de experiencia (aguda o crónica), incluyendo el aprendizaje de ^7-10, la exposición a drogas de abuso ^11,12, el estrés ^13,14, etc., puede alterar diversos aspectos de la función neuronal en regiones específicas del cerebro. Debido a que estas alteraciones a menudo requieren tiempo para desarrollarse (horas o días), conjunto de células grabaciones en secciones de cerebro de animales que han sido sometidos a una experiencia específica permiten a los investigadores a identificar estos cambios. Básicamente, muchos (si no todos) los componentes que participan en funciones neuronales (por ejemplo, canales iónicos activados por ligando, canales de iones dependientes de voltaje, transportadores de neurotransmisores), y así la actividad y el comportamiento del circuito cerebro, puede ser alterado por la experiencia (dependiente de la experiencia plasticidad) ^10,15-17. A nivel neuronal, la actividad circuito cerebral emerge de constantes interacciones entre sináptica (por ejemplo, la transmisión del glutamato) y los factores de excitabilidad celular intrínsecos (por ejemplo, canales de iones axosomato-dendríticas: sodio, Na ^+, potasio, K ^+, y calcio, Ca ²⁺ ). En condiciones específicas utilizando whole-células patch-clamp técnicas electrofisiológicas, alteraciones señal que se origina en concreto de los cambios en la excitabilidad intrínseca vs sináptica se puede aislar.

En la mayoría de los casos, la excitabilidad sináptica se evalúa mediante la técnica de fijación de voltaje de células enteras. Este modo de grabación permite la medición de las corrientes de iones [por ejemplo, mediada por los receptores del ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico ( receptores de AMPA) y los receptores de N-metil-D-aspártico (NMDA)] receptores a través de la membrana plasmática neuronal mientras se mantiene el potencial de membrana a una tensión de consigna. Aquí, los experimentadores utilizan las soluciones internas de micropipeta que contienen cesio (Cs ^+), un amplio bloqueantes de los canales de K ⁺ (factores intrínsecos excitabilidad clave). Al establecimiento de configuración de célula completa, la difusión de Cs ⁺ en el espacio intracelular bloqueará los canales de K ^+, y por lo tanto permitirá que tanto un relativamente eficiente espacio-clamp y preventilar influencia de los factores intrínsecos de excitabilidad en otras mediciones. Problemas de espacio-clamp, es decir, la dificultad de fijación de voltaje de células enteras, surgen cuando se graban las células de forma irregular (por ejemplo, neuronas), y en particular de neuronas con una vasta y compleja dendríticas cenador ^18,19. Dado que los controles mal de fijación de voltaje somática voltaje en el árbol dendrítico de las neuronas, diversos aspectos de las señales eléctricas dendríticas en estudio se distorsionan de forma dendrítica dependiente de la distancia. Combinado con herramientas farmacológicas tales como la picrotoxina (ácido gamma-aminobutírico, GABA _Un antagonista _del receptor) o ácido quinurénico (amplio bloqueador de receptores de glutamato) disuelto en la solución extracelular (líquido cefalorraquídeo artificial, ACSF), esta técnica permite la medición de glutamato receptor-y corrientes de GABA _A R-mediada respectivamente.

Por el contrario, la excitabilidad intrínseca se evalúa por lo general en el modo de grabación actual-clamp.A diferencia de la grabación de fijación de voltaje, este modo de grabación permite la medición de las variaciones en los potenciales de membrana inducidos por las corrientes de iones que fluyen a través de la membrana plasmática neuronal. Por lo general, la alteración de la excitabilidad intrínseca se evalúa a través de cambios en la capacidad de las neuronas para generar potenciales de acción, lo que requiere tanto de Na ⁺ y K ⁺ canales. Por lo tanto, al realizar grabaciones de corriente-clamp, micropipetas se llenan con una solución interna que contiene K ⁺ en lugar de Cs ^+. En combinación con los agentes farmacológicos que bloquean glutamato y GABA _A las corrientes mediadas por el receptor disueltos en el ACSF, este diseño experimental permite la medición de la contribución de los factores intrínsecos (por ejemplo, los canales de K ⁺⁾ para la descarga neuronal sin ser contaminada por los posibles cambios en la excitabilidad sináptica factores.

En este artículo se describen los pasos básicos de procedimiento necesarias to (i) preparar rodajas de cerebro sanas; (Ii) lograr configuración de célula completa, y (iii) controlar parámetros básicos para evaluar sináptica y la excitabilidad intrínseca.

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales UT Southwestern, y se eligieron a fin de minimizar el estrés, molestias y dolor experimentado por los animales de experimentación.

1. Soluciones

Nota: Se preparan soluciones internas de micropipetas con antelación. Para la mayoría de los propósitos experimentales básicos, dos tipos de soluciones deben ser suficientes: las soluciones basadas en Cs ⁺ y K ⁺ con base.

1. Las soluciones basadas en el uso de Cs ⁺ (por ejemplo, solución de gluconato de Cs ^+, ver Materiales) para los experimentos de fijación de voltaje. Preparar a TA.
   1. Preparar la solución de Cs-Gluconato 117 mM mediante la mezcla de ácido D-glucónico 4,62 g (~ 3.696 ml) con 3,54 g CsOH (~ 2,01 ml).
   2. Añadir _ddH2O a 90 ml y dejar reposar y estabilizar durante 30 minutos.
   3. Añadir los ingredientes sólidos (HEPES 20 = 0,476 g; 0,4 mM EGTA = 15,2 mg; 2,8 mM NaCl = 16,4 mg; 5 mM de tetraetilamonio (TEA) De cloruro de = 83 mg).
   4. Añadir _ddH2O a ~ 97 ml.
   5. Ajustar el pH de la solución con 50% de CsOH a 7.2 a 7.3.
   6. Compruebe osmolaridad y correcta, si es necesario con _ddH2O
      Nota: Un buen rango es de ~ 280 - 285 mOsm. osmolaridad óptima debería ser 15 a 20 mOsm por debajo de la osmolaridad de ACSF estándar (por lo general 300 a 310 mOsm, 300 mOsm en nuestro laboratorio). Osmolaridad puede variar dependiendo de las soluciones de composiciones específicas.
   7. Alícuota de 1.000 l y se almacena a -20 ° C o menos.
   8. Preparar, alícuota, congelar, y añadir ATP / GTP a la solución interna en el día de la grabación.
      1. Añadir 64.63 mg a 10 mg de ATP y GTP disolverse en 637.11 l de _ddH2O
      2. Preparar 10 ml de alícuotas y se almacena a -20 ° C o menos. Mezcle cada 100x alícuota con 1.000 l de solución interna en el día del experimento. Una vez que se añade ATP / GTP a la solución interna, mantener en hielo para evitar degradati ATP / GTPen.
2. Las soluciones basadas en el uso de K ⁺ (por ejemplo, solución de K-gluconato, ver Materiales) para ambos experimentos intensidad y tensión-clamp, donde las conductancias de K ⁺ permanecen funcional para que la descarga neuronal se puede evaluar. Preparar a TA.
   1. Pesar todos los materiales de acuerdo con el volumen final deseado. Para preparar 90 ml de solución, 120 mM de K-gluconato = 2,81 g; KCl 20 mM = 0,149 g; mM HEPES 10 = 0.238 g; mM EGTA 0,2 = 0,008 g; 2 mM de MgCl ₂ = 0,021 _g.
   2. Use suficiente ddH ₂ O para alcanzar 90% del volumen de solución final. Esto debería garantizar que suficiente espacio se deja para el ajuste del pH y osmolaridad.
   3. Después de añadir y mezclar todos los ingredientes, asegúrese de que la solución es clara antes de medir el pH.
   4. Mientras que constantemente se agitaba la solución, ajustar el pH a 7.2 a 7.3 usando hidróxido de K ⁺ (KOH).
   5. Después de ajustar el pH, utilice el osmómetro y adsimplemente osmolaridad a 280 - 285 mOsm.
      Nota: osmolaridad óptima debería ser 15 - 20 mOsm por debajo de la osmolaridad de ACSF estándar (por lo general 300 - 310 mOsm, 300 mOsm en nuestro laboratorio). Osmolaridad puede variar dependiendo de las soluciones de composiciones específicas.
   6. Alícuota de 1.000 l y se almacena a -20 ° C o menos.
   7. Prepare, alícuota, congelar, y añadir ATP / GTP a la solución interna en el día de la grabación (véase la etapa 1.1.8).
3. Preparar 1 litro de ACSF estándar (ver Materiales).
   NOTA: Nosotros usamos esta receta en nuestro laboratorio durante la grabación de las neuronas espinosas medias (MSN) en rodajas de cerebro, sin embargo, las recetas pueden diferir entre laboratorios, y por lo tanto, se recomienda que el experimentador utilizar una receta que se utiliza de forma rutinaria durante la grabación de la región del cerebro de interés .
4. Preparar la ACSF disección (solución rebanar, ~ 125 ml Nota:. Volumen exacto dependerá del tamaño de la cámara de corte en lonchas como debe sumergir completamente el cerebro) para su uso enlos pasos 2.2 a 2.8.
   1. Preparar 5 mM de ácido quinurénico (para bloquear los receptores de los procesos de excitotoxicidad inducida por glutamato) en ACSF estándar en un volumen suficiente para sumergir el cerebro durante el rebanado. Use un aparato de ultrasonidos para ayudar a disolver el ácido quinurénico.
      Nota: La longitud de la sonicación puede variar dependiendo del volumen y la cantidad de sólidos en la solución. Las soluciones deben ser claros por el final del proceso (alrededor de 1 - 2 min en nuestras condiciones).
   2. Enfríe mientras se burbujeaba con un 95% de _O2, 5% de gas CO ₂ en un cubo de hielo hasta que la temperatura llegue a 0 - 2 ° C.
5. Preparar ACSF para la grabación.
   1. Tome 1 L de estándar ACSF (o lo que queda de la solución preparada en la etapa 1.3) a la que pueden añadirse agentes farmacológicos apropiados dependiendo de experimentos planificados.
      1. Por ejemplo, añadir 100 picrotoxin M durante la grabación de las corrientes postsinápticas excitatorias o potenciales (EPSCs o EPSPS), antagonistas de los receptores de glutamato (kynureácido nic, 2 mM; o una combinación de D-APV 50 mM con CNQX 10 M) al grabar inhibitoria corrientes postsinápticas o potenciales (IPSCs o IPSPs), y ambos antagonistas del receptor de picrotoxina y el glutamato en la evaluación de la descarga neuronal en ausencia de cualquier influencia de eventos sinápticas.

2. Preparación de la rebanada

1. Construir u obtener una cámara de recuperación rebanada.
   Nota: El principio de una cámara de recuperación es sencillo y se puede producir en el laboratorio (Figura 1). Brevemente, la cámara es un receptáculo en el que se inserta una cesta para contener los cortes de cerebro en un nivel que es más bajo que la superficie de ACSF. Varias compañías científicos también venden cámaras de recuperación de la rebanada.
   1. A modo de ejemplo, obtener cuatro anillos (4 - 6 mm de altura) (Figura 1A, vista lateral; B, vista desde arriba) cortando una jeringa de 30 cc. A continuación, la cola se extendía redes (por ejemplo, un corte de nylon hose) a un lado de los anillos para sujetar las secciones de cerebro (Figura 1B) y la cola de los anillos juntos.
      Nota: Una pistola de pegamento se puede utilizar.
   2. Una vez que los cuatro anillos se pegan, pegar una pared de plástico en forma de trapecio isósceles curvada para dos de los anillos (Figura 1A y B) para desviar burbujas de oxígeno a partir de los cortes de cerebro en recuperación (Figura 1C y D). Como se muestra en la Figura 1D, insertar un sistema de difusión de oxígeno (aquí, un tubo de dispersión de gas) en el mismo lado que las paredes de plástico.
2. Antes de cortar, compuestos oxigenados (95% de _O2 / 5% de CO ₂₎ y enfriar la solución de corte (véase el paso 1.4) a 0 - 2 ° C.
3. Llenar la cámara de recuperación personalizada con ACSF estándar a temperatura ambiente. Asegúrese de que la ACSF está bien oxigenada (20 - 30 min, el tiempo puede variar de acuerdo con el volumen de la cámara) antes de colocar las rebanadas en la cámara de recuperación. Asegúrese de que las burbujas de gas no vienen en con directatacto con las rodajas o interrumpir ellos.
4. Línea de la bandeja de hielo vibratome con hielo y rellenar con agua fría para que entre un tercio y la mitad de la cámara de corte está sumergido. Con cuidado, coloque un sistema de suministro de oxígeno (por ejemplo, piedra gas de difusión) y una sonda de temperatura en la cámara de corte por lo que ni elemento interfiere con el movimiento de la cuchilla o la manipulación rebanada.
5. Preparar el área de disección y las herramientas necesarias para extraer el cerebro y disección de la región cerebral deseada.
   Nota: La disección exacta se realice dependerá de la región específica del cerebro estudiada como diferentes estructuras cerebrales se requieren cortar en diferentes planos (por ejemplo,,, o rebanadas horizontales sagital coronal.).
   1. Coloque las siguientes herramientas en una almohadilla inferior: tijeras de decapitación, bisturí, pequeños rectos tijeras punta afilada, fórceps de canulación recipiente (o cualquier herramienta quirúrgica con una punta ancha, tales como pinzas gubias, lo que es más adecuado para los cráneos de rata), pinzas hemostáticas curvas, tweezers, espátula, pala espátula, papel de filtro, placa de Petri, cuchilla de afeitar sola punta, y el pegamento de cianoacrilato.
6. Cuando la temperatura llega a 0 - 2 ° C, transferir la solución de corte a la cámara de corte (baño tampón).
7. Anestesiar el ratón en una cámara de desecación utilizando isoflurano. La cantidad exacta puede variar de acuerdo con el tamaño de la cámara utilizada, pero para una pequeña jaula caja de zapatos utilizar unas gotas (~ 3-4). Deje el ratón en la jaula hasta inmóviles prestados (que no responden a los estímulos táctiles; alrededor de 15 segundos para las condiciones descritas aquí). Realizar pruebas de arrastre de la cola y los pies para asegurarse de que el animal está profundamente anestesiado, y luego decapitar antes de que el corazón deja de latir (mejora la viabilidad celular).
   Nota: Con la debida justificación, algunos laboratorios obtener la autorización para llevar a cabo la decapitación en vivo con el fin de minimizar en lo posible los procesos de excitotoxicidad y mejorar la viabilidad celular.
8. Realizar la disección.
   Nota: El cerebro debe serextraída rápidamente (<45 s).
   1. Utilizando el bisturí corta la piel superficial en la parte superior del cráneo de rostral a caudal.
   2. Pelar el cuero cabelludo en cada lado de la cabeza.
   3. El uso de pequeñas tijeras de punta aguda directamente, cortar la placa interparietal lo largo de esta sutura para eliminar el cerebelo. Quitar el hueso occipital.
   4. Utilizando las mismas tijeras, cortar la sutura sagital.
   5. Deslice la pinza de canulación recipiente (o gubia si se rompen un cráneo de rata) debajo de cada huesos parietales y tire para exponer el cerebro.
   6. Usando las pinzas hemostáticas curvas, una pizca de los huesos frontales para romperlos, a continuación, utilizar pinzas o fórceps canulación recipiente para eliminar los huesos rotos. Corte y retire la duramadre lo más suavemente posible, ya que puede interferir con la disección.
   7. Deslizar la espátula por debajo del cerebro y tirar suavemente el cerebro fuera del cráneo para colocarlo en la cámara de corte (baño tampón) previamente lleno de ACSF enfriado con hielo. Dejar que el cerebroenfriar durante 1 - 2 min.
   8. Preparar la plataforma disección rellenando una cápsula de Petri con hielo y un poco de agua de hielo para permitir una mayor superficie de contacto, cubrirlo con su tapa y coloque un papel de filtro en la parte superior. Mojar el papel de filtro con ACSF frío.
   9. Una vez que el cerebro se enfría, coloque el cerebro en la placa de Petri llena de hielo, y realizar rápidamente la disección adecuado para obtener el plano deseado de corte.
   10. Para obtener cortes sagitales que contienen el núcleo accumbens (NAC), utilizar una sola hoja de afeitar borde para cortar y retirar los tubérculos olfatorios y el cerebelo si todavía están presentes. Después, realice un corte sagital de 2 - 3 mm del borde lateral del hemisferio derecho para obtener la superficie plana que se pega en la muestra de la placa de sujeción (consulte el paso 2.8.11).
       Nota: sólo el corte 2 - 3 mm del borde lateral del hemisferio permitirá la recogida de las rebanadas contienen el NAC de ambos hemisferios. La disección apropiado dependeráen la región del cerebro que se investiga. Aquí, la disección se realiza de manera neuronas NAC se pueden grabar en rodajas de cerebro sagital.
   11. Rápidamente pegamento (utilizando pegamento de cianoacrilato aplicada a la placa de muestras de retención) la superficie de corte plana del cerebro en la placa de acuerdo con el plano deseado de corte. Para obtener cortes de cerebro sagital ver el paso 2.8.10.
   12. Inmediatamente colocar y fijar la muestra de placa de sujeción en la cámara de corte para que el cerebro se corta rostro-caudal (por seguridad, configurar el soporte de la cuchilla sólo cuando se fija la placa de la muestra).
   13. Ajuste el vibratome con parámetros adecuados de rebanado (parámetros utilizados en el laboratorio para la vibratome mencionado en Materiales: velocidad 3 - 4, 9-10 de vibración, y rebanada espesor de 250 micras).
   14. Tras el corte, utilice una pipeta de transferencia de plástico recortado para transferir los cortes de cerebro a la cámara de recuperación (a temperatura ambiente) (véase el paso 2.3). El tiempo de recuperación puede variar dependiendo del tipo neuronal que está bajo estudio(Típicamente 30 a 90 min).

3. Micropipetas de grabación y preparación del aparejo

1. Consulte las directrices específicas del manual del usuario del extractor para obtener las propiedades deseadas de micropipeta.
   Nota: Para MSN, se utiliza un rango de resistencia de la pipeta de 3,2-4,0 mO.
2. Oxigenar la ACSF y ajustar el flujo a 2 ml / min. ACSF vacío usando una bomba de vacío o peristálticos líneas instaladas en la instalación.
3. Encienda el controlador del aparato de perfusión y ajustar los ajustes de temperatura con el fin de obtener la temperatura deseada (por ejemplo, 31,8 - 32,2ºC).
   Nota: Estabilidad de la temperatura depende de tener tanto a nivel ACSF constante y velocidad de flujo constante en la cámara. Desde varias propiedades biofísicas de las neuronas (por ejemplo, la resistencia de entrada, _Ri, también llamada resistencia de la membrana, R _m) son sensibles a la temperatura, se mantiene una temperatura estable es importante.
4. Encienda compuamplificador de ter-controlado, cámara, micromanipulador, y la luz de fondo microscopio. Si se realiza un experimento que requiere la estimulación eléctrica del tejido, active el controlador de estímulo y la unidad de aislamiento.
   Nota: Algunos amplificadores de otros fabricantes recomiendan un "calentamiento" antes de su uso, por lo que se recomienda consultar el manual para el procedimiento de operación exacta.
5. Iniciar la captura de la cámara, la adquisición de señales y el software de amplificador.
6. Rebanada de Colocación y Visualización:
   1. Con una pipeta de transferencia de plástico con punta recortada, dibujar suavemente en una corte de cerebro de la cámara de recuperación.
   2. Coloque la pipeta de transferencia en la cámara de registro y apretar suavemente la rebanada de la pipeta en el cubreobjetos que recubre el fondo de la cámara.
      Nota: Mientras se está produciendo ningún desbordamiento, es inofensivo para tener algo de ACSF de la cámara de recuperación de desembocar en el baño.
   3. El uso de fórceps para alterar la posición de la rebanada so el área deseada será colocado exactamente en el centro de la cámara de grabación. Utilizar el microscopio de baja potencia (4X) lente objetivo y el ocular para la ayuda en el posicionamiento.
   4. Después de que se ha alcanzado la posición deseada, asegurar la posición de cortes de cerebro con una rebanada de sujeción (también conocido como un "arpa") en la cámara.
   5. Cambiar a alta potencia (40X) de lente de objetivo y bajar suavemente hasta que el contacto se forma con la ACSF en la cámara.
   6. Utilice la rueda de ajuste fino para llevar el tejido en el foco. Mientras que en contacto con el ACSF, no utilice la rueda de ajuste grueso en el microscopio como la reducción de la lente del objetivo en exceso puede aplastar en la división o incluso romper la hoja de la cubierta que recubre el fondo de la cámara, lo que puede causar ACSF que se derrame sobre el condensador y dañarlo.
   7. Cuando la atención se centra en el nivel de los tejidos, células observar en la región diana para la forma. Las células muertas son fácilmente identificables por su membrana plasmática y el núcleo hinchado ( Figura 1E). Las células sanas deben aparecer como redonda, ovoide o elíptica estructuras homogéneas (Figura 1E).
   8. Busque una célula diana. Marcarlo en la pantalla del ordenador con el fin de ayudar a guiar la micropipeta grabación. Si se utiliza el software como QCapture, dibujar un cuadrado alrededor de la célula diana mediante la celebración el clic izquierdo del ratón.
   9. Elevar la lente del objetivo por lo que habrá espacio suficiente en el cono formado por la lente de objetivo está en contacto con la ACSF para colocar y mover la micropipeta de grabación.
7. Micropipeta Colocación y Posicionamiento
   1. Usando una jeringa de 1 ml, una aguja microjeringa no metálico, y un filtro dedicado, llenar una micropipeta con la solución interna preparada de antemano de acuerdo con el experimento planificada (K ⁺ con base o Cs ⁺ -basado solución interna, consulte los pasos 1.1., 1.2 y materiales para la composición). Use suficiente solución para el interiorsolución entra en contacto con el electrodo de alambre de plata cloruro recubierto dentro del soporte micropipeta.
      Nota: El electrodo de alambre de plata puede ser clorada al sumergirlo en el blanqueo de la casa. nucleósidos trifosfato (ATP y GTP) se pueden añadir a la solución interna antes de su uso. Mantener la jeringa que contiene la solución en hielo para evitar la degradación de ATP / GTP.
   2. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la micropipeta, ya que pueden salir mientras que la micropipeta es en el tejido y oscurecen la rebanada.
   3. Coloque la micropipeta en el soporte de electrodo de modo que la solución entra en contacto con el electrodo de alambre cloruro de plata recubierto.
   4. Apriete la tapa de la pipeta de manera que la arandela de cono se forma un sello alrededor de la micropipeta.
   5. Aplicar presión positiva antes de sumergir la micropipeta en el ACSF para evitar que los desechos entren en la pipeta.
   6. Coloque el cabezal de la platina en la posición bloqueada (de cara a la cámara), y utilizando el micromanipulador, guía hacia abajo hacia la cámara por lo que es más o menos bajo el centro del objetivo sumergido.
   7. Mientras se mueve la micropipeta con el micromanipulador (fijado en media a alta velocidad), utilice la pantalla del ordenador para localizar la micropipeta y guiarla hacia la ubicación de la celda en el eje XY.
   8. Medir la resistencia micropipeta mediante la aplicación de un escalón de tensión (por ejemplo, 4 mV para 100 ms), que se puede lograr de forma manual o automáticamente a través de software específico, como el modo de "baño 'si se utiliza" Test de membrana "en software Clampex (véase también el paso 4) . Con el fin de asegurarse de que no hay burbujas de aire o cualquier otro objeto extraño bloquean la micropipeta, aplicar presión positiva utilizando la jeringa llena de aire (por ejemplo, la jeringa 30 cc) conectado al soporte micropipeta con tubo de polietileno.
   9. Después de la limpieza de la micropipeta, lleve a cabo un desplazamiento para reducir la corriente de la pipeta a cero de tensión, que se puede lograr de forma manual o por medio de software específico, como & #39, compensado 'en el control del amplificador controlado por ordenador pipeta.
      Nota: Esta función compensará toda la tensión causada por las diferencias de concentración entre el baño y las soluciones de micropipeta (es decir, el potencial de unión líquida ^20).

4. Prueba de membrana

Nota: Este paso se aplica al amplificador mencionado en los Materiales.

1. Cuando se utiliza un comandante amplificador controlado por ordenador, siempre lo puso en el modo de fijación de voltaje para realizar la prueba de la membrana.
   Nota: Cuando la prueba de la membrana se encuentra en el modo "Bath", la prueba de la membrana permite la medición de la resistencia de la micropipeta y la resistencia del sello cuando se forma la junta.
2. Una vez que se rompe la membrana (véase el paso 5.8), cambiar la prueba de la membrana a modo de "célula" de modo que la resistencia en serie (R _s) (también llamada resistencia _acceso, Ra), _Ri y capacitancia de la membrana (C _p) puedeSer obtenido.

5. Final Approach, sello de Formación, y obtener la configuración de célula completa

1. El uso de la rueda de enfoque fino, empezar a centrarse hacia abajo al tiempo que reduce la micropipeta gradualmente. Siempre se centran abajo primero y luego baje la micropipeta hasta el plano de enfoque. Esto asegurará que la punta de la micropipeta no penetra bruscamente en la división.
2. Cuando la micropipeta entra en contacto con la superficie de la loncha, reducir la velocidad de micromanipulador a modo de medio-bajo.
3. aplicar suavemente presión positiva ligera con la jeringa llena de aire conectado al soporte de pipetas para limpiar toda la suciedad de la trayectoria de aproximación.
4. El enfoque de la célula, ya sea por la alternancia con los mandos de control de XYZ, o por acercarse diagonal (si el modelo micromanipulador permite) donde ambos ejes XZ se cambian con la rotación de la perilla de eje Z. El último método evitará la compresión vertical de tejido.
   Nota: En este caso, el objetivo esacercarse a la célula por infligir un daño mínimo a la división. Cuando la micropipeta está lo suficientemente cerca a la célula aparece un hoyuelo (una decoloración ronda de la superficie celular causada por la presión positiva aplicada a través de la punta de la micropipeta) (Figura 2).
5. Cuando el hoyuelo (Figura 2-1), aplicar una aspiración débil y breve a través del tubo que está conectado al tubo de succión soporte de pipeta con el fin de crear la junta (Figura 2-2). Mantener el seguimiento de la prueba de la membrana.
   Nota: Si se forma un sellado parcial (<1 GΩ), la inyección de corrientes negativas al bajar el potencial de mantenimiento (en el control del amplificador controlado por ordenador) puede facilitar la formación del sello y llegar a gigaohms resistencia ( "sello gigaohmio" o "gigaseal"> 1 - 5 GΩ). La alta resistencia de la junta (> 1 GΩ) será tanto la contaminación de ruido límite a la señal grabada y contribuir a la estabilidad mecánica de laparche.
6. Mientras que un gigaseal se está formando, utilizar el mando amplificador controlado por ordenador para llevar el potencial de retención de la célula lo más cerca posible a fisiológica potencial de reposo (V _resto) con el fin de evitar cambios repentinos una vez que se rompe la membrana. Por ejemplo, los MSN son generalmente tensión sujeta a -70 o -80 mV (V fisiológica _resto: -70 a la -90 mV).
7. Después de la gigaseal ha formado, compensar la capacitancia rápido y lento manual o automáticamente. Si se utiliza un comandante amplificador controlado por ordenador, tales como comandante Multiclamp, pulse 'Auto' para 'Cp Fast' y 'Cp es lento ".
8. Si el sello se mantiene estable y por encima de 1 GΩ (o la inyección de menos de 10 a 20 pA para mantener la célula en el potencial de membrana se desea), aplicar una breve y fuerte succión a través del mismo tubo como en 5.5 a la ruptura de la membrana plasmática (Figura 2 -3).
   Nota: Esta operación puede tardar varios ensayos. Una buena ruptura de la membrana se logra wsucción gallina se realiza con suficiente fuerza para que la ruptura de membrana no obstruye la micropipeta (que puede conducir a un aumento en R _s durante la grabación), pero lo suficientemente débil con el fin de no dibujar en una gran parte de la membrana o de la célula.
9. Después de alcanzar una configuración de célula completa con éxito, el seguimiento periódico del lugar micropipeta para evaluar y corregir la deriva significativa, ya que puede conducir a la pérdida del parche. Amplitud Drift puede variar de acuerdo a varios factores, por ejemplo, la calidad de la instalación de equipo de perforación y fuerzas de tracción en el cabezal de la platina. Idealmente, la deriva debe ser casi inexistente.
10. Al cambiar al modo de "célula" en la prueba de la membrana, ver diferentes parámetros de la celda como _Ri, R _s y C _p. Seguimiento de estos parámetros durante la grabación.
    Nota: Todos estos parámetros pueden ayudar a evaluar el estado de salud inicial de las células y tipos celulares (ver "Prueba de membrana" sección, paso 4).
11. Una vez THe los pasos anteriores se han completado, permanecen en el modo de fijación de voltaje para medir corrientes (por ejemplo, EPSCs, IPSC), o cambiar a modo de corriente-clamp si la planificación para medir los cambios en la tensión de la membrana (por ejemplo, potencial de acción disparando). Para esta última, se inyecta corriente positiva o negativa para mantener la célula en el voltaje de la membrana deseada (para llevar a cabo este paso, consulte la guía del amplificador manual).

Resultados

Temperatura, un factor que se controla fácilmente por el experimentador, influye en las propiedades biofísicas de los canales iónicos y los receptores, y por lo tanto la forma de onda de las corrientes post-sinápticos (PSC) (EPSC y IPSCs) y la capacidad de las neuronas por obtener picos. Figura 3 y la Figura 4 muestran el efecto de la temperatura sobre la descarga neuronal y la pendiente de EPSCs evocados (eEPSCs), respectivamente. El patrón de disp...

Discusión

Este protocolo describe el procedimiento básico para la realización de experimentos de células enteras patch-clamp en las neuronas en rodajas de cerebro. Sin embargo, la complejidad, el potencial y sensibilidad de esta técnica no pueden ser completamente descritos en este artículo. Aquí, hemos tratado de delinear los pasos más básicos y ponen de relieve los parámetros importantes que deben ser controlados para lograr conjunto de células grabaciones exitosas y rigurosos. Para el aprendizaje teórico, muchos lib...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolated pulse stimulus generator	A.M.P.I	Master-8
Isolation unit (ISO-Flex)	A.M.P.I	ISO-Flex
Computer controlled Amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
Digital Acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1500
Microscope	Olympus	BX-51
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200
Chamber and in-line Heater	Warner Instruments	TC-344B
Vibratome Slicer	Leica	VT1000 S
Micropipette Puller	Narishige	PC-10
Imaging Camera	Q Imaging	QIClick-F-M-12
Narishige pipette puller PC-10	Narishige	PC-10
Glass capillaries	WPI	TW150F-3
Slice hold-down (harp)	Warner Instruments	64-0255
Slice Chamber	Warner Instruments	RC-26
Nonmetallic syringe needle	World Precision Instruments	MF28G67-5
Syringe filters	Nalgene	176-0045
Glue Gun	Home Depot	various
Gas dispersion tube	Ace Glass Inc.	various
Decapitation scissors	Home Depot	100649198
Scalpel Handle #3	World Precision Instruments	500236
Small straight sharp tips scissors	World Precision Instruments	14218
Vessel canulation forceps	World Precision Instruments	500453
Curved hemostatic forceps	World Precision Instruments	501288
Economy Tweezers #3	World Precision Instruments	501976-6
Spatula	Fisher Scientific	14357Q
Scooping spatula	Fisher Scientific	14-357Q
Petri dish	Fisher Scientific	08-747B
Filter paper	Lab Depot	CFP1-110
Solutions
Cs-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm)
D-gluconic acid 50%	Sigma Aldrich/various	G1951
Cesium-OH (CsOH) 50%	Sigma Aldrich/various	232041
NaCl, 2.8 mM	Sigma Aldrich/various	S7653
HEPES, 20 mM	Sigma Aldrich/various	H3375
EGTA, 0.4 mM	Sigma Aldrich/various	E4378
tetraethylammonium-Cl, 5 mM	Sigma Aldrich/various	T2265
Na2GTP, 0.3 mM	Sigma Aldrich/various	G8877
MgATP, 2 mM	Sigma Aldrich/various	A9187
K-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm)
K D-gluconate, 120 mM	Sigma Aldrich/various	G4500
KCl, 20 mM	Sigma Aldrich/various	P3911
HEPES, 10 mM	Sigma Aldrich/various	H3375
EGTA, 0.2 mM	Sigma Aldrich/various	E4378
MgCl2	Sigma Aldrich/various	M8266
Na2GTP, 0.3 mM	Sigma Aldrich/various	G8877
MgATP, 2 mM	Sigma Aldrich/various	A9187
Standard artificial cerebrospinal fluid (ACSF, osmolarity ≈ 300-310 mOsm)
KCl, 2.5 mM	Sigma Aldrich/various	P3911
NaCl, 119 mM	Sigma Aldrich/various	S7653
NaH2PO4•H2O, 1 mM	Sigma Aldrich/various	S9638
NaHCO3, 26.2 mM	Sigma Aldrich/various	S8875
Glucose, 11 mM	Sigma Aldrich/various	G8270
MgSO4-7H2O, 1.3 mM	Sigma Aldrich/various	230391
CaCl2-2H2O, 2.5 mM	Sigma Aldrich/various	C3881
Additional compounds used for solutions preparation
KOH	various
Kynurenic acid	Sigma Aldrich/various	K3375