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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt grundlegende Verfahrensschritte für die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen durchführen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung des elektrischen Verhaltens von Neuronen, und wenn in Hirnschnitten durchgeführt wird, ermöglicht die Bewertung verschiedener neuronaler Funktionen von Neuronen, die in relativ gut erhalten Gehirn Schaltungen noch integriert sind.

Zusammenfassung

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufzeichnung ist eine elektrophysiologische Verfahren, das die Untersuchung der elektrischen Eigenschaften eines wesentlichen Teils des Neurons ermöglicht. In dieser Konfiguration ist der Mikropipette in engen Kontakt mit der Zellmembran, die Kriechströme verhindert und dadurch liefert genauere Ionenstrommessungen als die bisher verwendeten intrazellulärem scharfe Elektrodenaufzeichnungsverfahren. Classically können Ganzzellaufzeichnung auf Neuronen in verschiedenen Typen von Präparaten durchgeführt werden, einschließlich Zellkulturmodellen, dissoziierte Neuronen, Neuronen in Gehirnschnitten und in intakten narkotisierten oder wachen Tieren. Zusammenfassend hat diese Technik zum Verständnis der passiven und aktiven biophysikalischen Eigenschaften von erregbaren Zellen immens beigetragen. Ein wesentlicher Vorteil dieser Technik ist , dass sie Informationen darüber , wie bestimmte Manipulationen (beispielsweise pharmakologischer, Experimentator-Induced Plasticity) stellt spezifische neuronale Funktionen verändern können oder canäle e xistieren in Echtzeit. Zusätzlich wesentliche Öffnung der Plasmamembran ermöglicht die interne Pipettenlösung frei in das Zytoplasma diffundieren, Mittel zum Einführen von Medikamenten, beispielsweise Agonisten oder Antagonisten spezifischer intrazellulärer Proteine ​​Bereitstellung und diese Ziele zu manipulieren , ohne in benachbarten Zellen ihre Funktion zu verändern. Dieser Artikel wird auf Ganzzell Aufnahme konzentrieren ausgeführt auf Neuronen in Hirnschnitten, ein Präparat , das den Vorteil der Aufnahme Neuronen in relativ gut erhaltenen Schaltkreise im Gehirn, das heißt, in einem physiologisch relevanten Kontext hat. Insbesondere wenn sie mit geeigneten pharmakologischen kombiniert ist diese Technik ein leistungsfähiges Werkzeug Identifizierung spezifischer neuroadaptations ermöglicht, die folgenden jede Art von Erfahrungen, wie Lernen aufgetreten ist, Exposition gegenüber Drogen und Stress. Zusammengefasst bieten whole-cell Patch-Clamp - Aufzeichnungen in Hirnschnitten Mittel ex vivo Herstellung nachhaltige Veränderungen zu messenin neuronalen Funktionen, die bisher in intakten wach Tiere entwickelt.

Einleitung

Die Patch-Clamp - Technik, eine elektrophysiologische Technik , die in den späten 1970er Jahren 1,2 entwickelt wurde, ist ein wichtiges Werkzeug für einzelne oder mehrere Ionenkanalfunktionen in lebendem Gewebe zu studieren. Unter den verschiedenen Patch-Konfigurationen, die erreicht werden kann, lassen whole-cell patch-clamp-Aufnahmen die Untersuchung des elektrischen Verhaltens eines wesentlichen Teils des Neurons. Klassischerweise wird diese Technik in vitro entweder an Hirnschnitten durchgeführt, frisch Neuronen dissoziiert, oder Zellkulturmodellen 3. Wenn auf Neuronen in Hirnschnitten durchgeführt wird, stellt diese Technik mehrere Vorteile. Insbesondere: (i) Neuronen in relativ konserviert Gehirn Schaltungen aufgezeichnet dass zu einem gewissen Grad, und im Vergleich zu Zellkulturpräparationen, eine Umgebung bereitzustellen , die physiologisch relevant 3 ist. Dies ermöglicht die Erfassung früh, oder die Überwachung sogar in Echtzeit, zellulären und molekularen Ereignisse, die durch jede Art von akuten pharmacolog ausgelöst werdenschen Manipulationen - eine zeitliche Auflösung , die mit klassischen In - vivo - Bedingungen nicht erreicht werden kann; (ii) Fähigkeit zur visuellen Hirnregionen in Hirnschnitten identifizieren ermöglicht eine hohe regionale Spezifität 3 sowohl für die Hirnregion untersucht und für spezifische Neuronen , wenn sie zum Ausdruck bringen fluoreszierende Marker; (iii) Zugriff auf den intrazellulären Raum der Zelle durch einen wesentlichen Teil der Plasmamembran Öffnung (im Gegensatz zu der Membran mit einem scharfen Mikropipette für die intrazelluläre Aufnahme Punktierung) 4. Im Gegenzug ermöglicht dies der Inhalt oder die Konzentration bestimmter Ionen, welche die interne Lösung zu komponieren kann modifiziert werden, um molekulare Targets oder zellulären Mechanismen, die unter unterschiedlichen Bedingungen untersucht werden. Zum Beispiel bei der Gesamtzellkonfiguration, jede spezifische pharmakologische Mittel zur Festlegung (zB Antagonisten) , dass man auf die Aufnahme Mikro (Patch - Pipette) in Lösung wird in das Zytoplasma direkt diffundieren und wirken auf seine Putatintrazelluläre Ziele ive, ohne dass die Zielfunktion in benachbarten Zellen zu verändern. Zusätzlich, im Vergleich zu scharfen Mikroaufnahme, die große Öffnung an der Spitze der Patch - Clamp - Elektrode stellt einen geringeren Widerstand, weniger konkurrierenden Rauschen und damit besseren elektrischen Zugang zum Inneren der Zelle 4. Beachten Sie jedoch, daß die große Öffnung an der Pipettenspitze zu Zelle Dialyse führen kann und damit der Verlust der intrazellulären molekularen Maschinerie, die für die Expression der biologischen Phänomenen kritisch sein kann , die untersuchten 5,6 sind. In diesem Fall können scharfe Elektrode Aufnahmen besser geeignet. Diese Art von Aufnahmen erfordert Mikropipetten mit einer Pore, die viel kleiner als die für die Whole-Cell-Aufnahmen verwendet wird, wodurch die meisten der Ionenaustausch zwischen intrazellulären Raum und der inneren Pipettenlösung verhindert wird.

Jede Form von Erfahrungen (akut oder chronisch), einschließlich Lernen 7-10, Kontakt mit Drogen 11,12, Stress 13,14, etc., können verschiedene Aspekte der neuronalen Funktion in spezifischen Hirnregionen verändert. Da diese Änderungen oft Zeit benötigen zu entwickeln (Stunden bis Tage), Ganzzell-Aufzeichnungen in Gehirnschnitten von Tieren, die eine bestimmte Erfahrung durchlaufen haben es den Forschern ermöglichen, diese Veränderungen zu identifizieren. Grundsätzlich viele (wenn nicht alle) Komponenten , die in neuronalen Funktionen (zB Liganden-aktivierte Ionenkanäle, spannungsabhängige Ionenkanäle, Neurotransmitter - Transporter) und dadurch Gehirn Schaltungs Aktivität und Verhalten teilnehmen, können durch Erfahrung verändert werden (Erfahrung abhängigen Plastizität) 10,15-17. Auf neuronaler Ebene, Gehirn Schaltungsaktivität ergibt sich aus konstanten Wechselwirkungen zwischen synaptischen (zB Glutamat - Übertragung) und intrinsische zelluläre Erregbarkeit Faktoren (zB axosomato-dendritischen lonenkanäle: Natrium, Na +, Kalium, K + und Calcium, Ca 2+ ). Unter bestimmten Bedingungen whol mitE-Cell-Patch-Clamp-elektro Techniken können Änderungen Signal Ursprung speziell von Veränderungen der synaptischen vs. intrinsische Erregbarkeit isoliert werden.

In den meisten Fällen wird synaptischen Erregbarkeit beurteilt die Ganzzellspannung-clamp - Technik. Dieser Aufzeichnungsmodus ermöglicht die Messung von Ionenströmen [eg, vermittelt durch α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure - Rezeptoren ( AMPA-Rezeptoren) und N-Methyl-D-Asparaginsäure-Rezeptoren (NMDA-Rezeptoren)] durch die neuronale Plasmamembran, während die Potentialspannung bei einer festgelegten Membran hält. Hier Experimentatoren verwenden interne Mikro Lösungen , die Cäsium (Cs +), eine breite Blocker der K + -Kanäle (key intrinsische Erregbarkeit Faktoren) enthalten. Bei Herstellung von Ganzzellkonfiguration, wird die Diffusion von Cs + im intrazellulären Raum Block K + -Kanälen und damit ermöglicht sowohl eine relativ effiziente Raum-clamp und preLüftungs Einfluss der intrinsischen Erregbarkeit Faktoren auf andere Messungen. Raum-Clamp - Fragen, das heißt, die Schwierigkeit zu Voltage-Clamp die ganze Zelle, entstehen , wenn unregelmäßig geformte Zellen der Aufnahme (zB Neuronen) und insbesondere Neuronen mit einer großen und komplexen dendritischen Dorn 18,19. Da somatischen voltage clamp schlecht Kontrollen im Dendritenbaum von Neuronen, die verschiedenen Aspekte der dendritischen elektrische Signale zu unter Spannung werden in einer dendritischen entfernungsabhängigen Weise verzerrt. In Verbindung mit pharmakologischer Werkzeuge wie Picrotoxin (gamma-Aminobuttersäure, GABA A -Rezeptor - Antagonist) oder Kynurensäure (broad Blocker der Glutamat - Rezeptoren) , gelöst in der extrazellulären Lösung (künstliche Cerebrospinalflüssigkeit, ACSF), erlaubt diese Technik die Messung des Glutamats Rezeptor- und GABA A Strömen , die jeweils-R vermittelt.

Im Gegensatz dazu wird intrinsische Erregbarkeit üblicherweise in Current-Clamp-Aufnahme-Modus überprüft.Hinsichtlich Voltage-Clamp-Aufzeichnung gegenüber, ermöglicht diese Aufzeichnungsmodus die Messung von Änderungen in Potentialen Membran durch Ionenströme induziert durch die neuronale Plasmamembran fließt. Typischerweise wird Veränderung intrinsische Erregbarkeit durch Veränderungen in der Fähigkeit beurteilt für Neuronen Aktionspotentiale zu erzeugen, die sowohl Na + und K + Kanäle erfordert. Deshalb wird , wenn Strom-Clamp - Aufnahmen durchführen, werden Mikro mit einer internen Lösung gefüllt , die K + anstelle von Cs + enthält. In Verbindung mit pharmakologischen Mitteln , die Glutamat und GABA A - Rezeptor-vermittelten Ströme in dem ACSF gelöst blockieren, diese Versuchsanordnung ermöglicht die Messung des Beitrags der intrinsischen Faktoren (zB K + Kanäle) auf neuronale Feuern ohne durch mögliche Änderungen in der synaptischen Erregbarkeit kontaminiert Faktoren.

In diesem Artikel werden die grundlegenden notwendigen Verfahrensschritte beschreiben to (i) bereiten gesunde Gehirnscheiben; (Ii) erreichen whole-cell-Konfiguration ist, und (iii) Überwachen Eckwerte synaptischen und intrinsische Erregbarkeit zu beurteilen.

Protokoll

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Protokollen von der UT Southwestern Institutional Animal Care und Use Committee und wurden so gewählt, dass zu minimieren Stress, Beschwerden und Schmerzen erfahren von den Versuchstieren genehmigt durchgeführt.

1. Lösungen

Hinweis: Bereiten Mikro interne Lösungen im Voraus. Für die meisten grundlegenden experimentellen Zwecken sollten zwei Arten von Lösungen genügen: Cs + -basierte und K + basierten Lösungen.

  1. Verwenden Cs + -basierte Lösungen (zB Cs + Gluconatlösung, siehe Materialien) für Voltage-Clamp - Experimente. Bereiten Sie bei RT.
    1. Bereiten 117 mM Cs-Gluconate Lösung von 4,62 g D-Gluconsäure Mischen (~ 3.696 ml) mit 3,54 g CsOH (~ 2,01 ml).
    2. In ddH 2 O auf 90 ml und lassen Sie es 30 Minuten lang ins Gleichgewicht.
    3. Fügen Sie die festen Bestandteile (20 mM HEPES = 0,476 g; 0,4 mM EGTA = 15,2 mg; 2,8 mM NaCl = 16,4 mg; 5 mM Tetraethylammonium (TEA) Chlorid = 83 mg).
    4. In ddH 2 O auf ~ 97 ml.
    5. Der pH-Wert der Lösung mit 50% CsOH auf 7,2-7,3.
    6. Überprüfen Sie die Osmolarität und richtig , wenn nötig mit ddH 2 O.
      Hinweis: Eine gute Auswahl von ~ 280-285 mOsm. 20 mOsm unterhalb der Osmolarität von Standard ACSF - Optimale Osmolarität sollte 15 sein (in der Regel 300 bis 310 mOsm, 300 mOsm in unserem Labor). Osmolarität können je nach Lösungen spezielle Zusammensetzungen abhängig.
    7. Aliquotieren bis 1000 ul und bei -20 ° C oder darunter.
    8. Vorbereiten, aliquoten, einfrieren, und fügen Sie ATP / GTP an die interne Lösung am Tag der Aufnahme.
      1. In 64,63 mg ATP zu 10 mg GTP und lösen sich in 637,11 ul ddH 2 O.
      2. Bereiten Sie 10 ul Aliquots und bei -20 ° C oder darunter. Mischen jedes 100x Aliquot mit 1000 & mgr; l interne Lösung am Tag des Experiments. Sobald ATP / GTP an die interne Lösung hinzugefügt wird, halten es auf Eis ATP / GTP degradati zu verhindernauf.
  2. Verwenden K + -basierte Lösungen (zB K-Gluconatlösung, Materialien sehen) sowohl für Strom- und Spannungs-Clamp - Experimenten , bei denen K + Leitwerte funktionsfähig bleiben , so dass neuronale Aktivität beurteilt werden kann. Bereiten Sie bei RT.
    1. Wiegen Sie alle Materialien entsprechend dem gewünschten Endvolumen. 90 ml der Lösung hergestellt, 120 mM K-Gluconate = 2,81 g; 20 mM KCl = 0,149 g; 10 mM HEPES = 0,238 g; 0,2 mM EGTA = 0,008 g; 2 mM MgCl & sub2 ; = 0,021 g.
    2. Verwenden Sie genug ddH 2 O 90% der endgültigen Lösungsvolumen zu erreichen. Dies sollte, dass genügend Platz gelassen für pH-Wert und Osmolarität Einstellung zu gewährleisten.
    3. Nach dem Hinzufügen und alle Zutaten mischen, stellen Sie sicher, dass die Lösung vor der Messung des pH-Wertes ist klar.
    4. Während ständig Rühren der Lösung, pH - Wert auf 7,2 bis 7,3 K + Hydroxid (KOH) verwendet wird .
    5. Nach Einstellung des pH, verwenden Sie das Osmometer und Anzeigenur Osmolarität auf 280-285 mOsm.
      Hinweis: Die optimale Osmolarität 15 sein sollte - 20 mOsm unterhalb der Osmolarität von Standard ACSF (in der Regel 300 bis 310 mOsm, 300 mOsm in unserem Labor). Osmolarität können je nach Lösungen spezielle Zusammensetzungen abhängig.
    6. Aliquotieren bis 1000 ul und bei -20 ° C oder darunter.
    7. Vorbereiten, aliquoten, einfrieren, und fügen Sie ATP / GTP an die interne Lösung am Tag der Aufnahme (siehe Schritt 1.1.8).
  3. Bereiten Sie 1 l Standard ACSF (siehe Materialien).
    Hinweis: Wir verwenden dieses Rezept in unserem Labor bei mittelgroßen Projektionsneuronen Aufnahme (MSNs) in Hirnschnitten, jedoch Rezepte zwischen Laboratorien unterscheiden können, und daher empfehlen wir den Experimentator ein Rezept verwenden, die routinemäßig verwendet wird, wenn die Hirnregion von Interesse Aufnahme .
  4. Bereiten Sie die Dissektion ACSF (Slicing Lösung, ~ 125 ml. Hinweis: Exact Volume auf der Größe der Slicing Kammer abhängen, da sie vollständig in das Gehirn überschwemmen soll) für die Verwendung inSchritte 2,2-2,8.
    1. Bereiten Sie 5 mM Kynureninsäure (zu blockieren Glutamat-Rezeptor-induzierte excitotoxischen Prozesse) in Standard-ACSF in einem ausreichenden Volumen, das Gehirn zu versenken während des Schneidens. Verwenden Sie ein Beschallungsgerät, um die Kynureninsäure aufzulösen.
      Anmerkung: Die Länge der Beschallung kann je nach Volumen und die Menge an Feststoffen in der Lösung. (- 2 min in unseren Bedingungen um 1) Die Lösungen sind bis zum Ende des Prozesses klar sein.
    2. Cool down , während mit 95% O 2, 5% CO 2 -Gas in einem Eimer mit Eis sprudeln , bis die Temperatur erreicht 0 - 2 ° C.
  5. Bereiten Sie ACSF für die Aufnahme.
    1. Nehmen Sie 1 l Standard ACSF (oder was auch immer aus der Lösung in Schritt 1.3 vorbereitet links), auf die entsprechende pharmakologische Wirkstoffe hinzugefügt je nach geplanten Experimente werden kann.
      1. Fügen Sie zum Beispiel 100 & mgr; M Picrotoxin wenn exzitatorischen postsynaptischen Ströme oder Potentiale (EPSCs oder EPSPe) Aufnahme, Glutamat-Rezeptor-Antagonisten (kynurenic Säure, 2 mM; oder eine Kombination von D-APV 50 uM mit CNQX 10 uM), wenn hemmende postsynaptische Ströme oder Potentialen Aufnahme (IPSCs oder IPSPs) und beide Picrotoxin und Glutamat-Rezeptor-Antagonisten, wenn sie in Abwesenheit jeglicher Einfluss von synaptischen Ereignisse neuronale Feuern zu beurteilen.

2. Scheibe Vorbereitung

  1. Konstruieren oder eine Scheibe Wiedergewinnungskammer erhalten.
    Hinweis: Das Prinzip für eine Rückgewinnungskammer ist unkompliziert und kann im Labor (Abbildung 1) erfolgen. Kurz gesagt, ist die Kammer ein Behälter, in dem ein Korb eingesetzt wird, um die Gehirnscheiben auf einem Niveau zu halten, die niedriger als die Oberfläche des ACSF ist. Verschiedene wissenschaftliche Unternehmen verkaufen auch in Scheiben schneiden Erholung Kammern.
    1. Als Beispiel erhalten vier Ringe (4 - 6 mm hoch) (1A, Seitenansicht; B, Ansicht von oben) durch einen 30 - ml - Spritze zu schneiden. Dann kleben gestreckt Netze (zB ausgeschnitten aus einem Nylon hose) auf einer Seite der Ringe die Gehirnscheiben (1B) und verkleben die Ringe zusammenzuhalten.
      Hinweis: Eine Klebepistole verwendet werden kann.
    2. Sobald die vier Ringen verklebt sind, kleben ein gekrümmtes gleichschenklig trapezförmigen Kunststoffwand an zwei der Ringe (1A und B) , um Sauerstoffblasen von der Rückgewinnungshirnschnitten (1C und D) abzulenken. Wie in 1D gezeigt, ein Sauerstoff Diffundieren System einzufügen (hier ein Gasdispersionsrohr) auf der gleichen Seite wie die Kunststoffwände.
  2. Vor dem Schneiden, oxygenate (95% O 2/5% CO 2) und die Slicing - Lösung abkühlen (siehe Schritt 1.4) auf 0 - 2 ° C.
  3. Füllen Sie die benutzerdefinierten Wiederherstellungsraum mit Standard-ACSF bei RT. Stellen Sie sicher, dass das ACSF ist gut mit Sauerstoff angereichert (20 - 30 min, kann die Zeit variieren entsprechend der Kammervolumen), bevor Scheiben in der Rückgewinnungskammer platzieren. Stellen Sie sicher, dass Gasblasen kommen nicht in direkten conKontakt mit den Scheiben oder sie stören.
  4. Linie die Vibratom Eisbehälter mit Eis und mit kaltem Wasser füllen, so dass ein Drittel bis die Hälfte der Schneidekammer eingetaucht ist. Vorsichtig ein Sauerstoffzufuhrsystem (zB Gas diffundieren Stein) und eine Temperatursonde in der Schneidekammer so weder Element mit der Messerbewegung oder Slice Manipulation stört.
  5. Bereiten Sie die Dissektion Bereich und Werkzeuge notwendig, um das Gehirn zu extrahieren und die gewünschte Region des Gehirns zu sezieren.
    Hinweis: Die durchgeführte genaue Präparation von der spezifischen Gehirnregion abhängen wird untersucht , wie verschiedene Hirnstrukturen bei verschiedenen Ebenen erfordern Schneiden (zB koronalen, sagittalen oder horizontale Schnitte.).
    1. Setzen Sie die folgenden Werkzeuge auf einer Unterlage: Enthauptung Schere, Skalpell, kleine gerade scharfe Spitze Schere, Schiff Kanülierung Zange (oder jedes chirurgische Werkzeug mit einer breiten Spitze, wie rongeurs, die für Rattenschädel mehr geeignet ist), gebogene Arterienklemmen, tweezers, Spachtel, Schöpf Spachtel, Filterpapier, Petrischale, einzelne Rasierklinge und Sekundenkleber.
  6. Wenn die Temperatur 0 erreicht - 2 ° C, übertragen Sie die Slicing-Lösung für das Schneiden Kammer (Pufferwanne).
  7. Anesthetize die Maus in einer Austrocknungs Kammer Isofluran verwendet wird. Genaue Menge kann entsprechend der Größe der Kammer variieren verwendet, aber für ein kleines Schuhkarton Käfig verwenden einige Tropfen (~ 3-4). Lassen Sie die Maus in den Käfig, bis gemacht unbeweglich (nicht reagiert Reize taktile; etwa 15 sec für die hier beschriebenen Bedingungen). Führen Sie Schwanz und Fuß Prise Tests das Tier, um sicherzustellen, ist tief anästhesiert, dann enthaupten, bevor das Herz aufhört zu schlagen (verbessert die Lebensfähigkeit der Zellen).
    Hinweis: Bei entsprechender Begründung, einige Laboratorien die Genehmigung erhalten, um Live-Enthauptung durchzuführen, so viel wie möglich excitotoxischen Prozesse zu minimieren und die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern.
  8. Führen Sie die Präparation.
    Hinweis: Das Gehirn muss seinschnell (<45 sec) extrahiert.
    1. das Skalpell schneiden die oberflächliche Haut auf der Oberseite des Schädels von rostral nach kaudal.
    2. Ziehen Sie die Kopfhaut auf jeder Seite des Kopfes.
    3. Mit Hilfe von kleinen geraden scharfen Spitze Schere, schneiden Sie die interparietal Platte entlang der Lambdanaht des Kleinhirns zu entfernen. Entfernen Sie die Hinterhauptsbein.
    4. Unter Verwendung der gleichen Schere, schneiden Sie die Pfeilnaht.
    5. Schieben Sie die Behälter Kanülierung Zange (oder rongeurs wenn eine Ratte Schädel brechen) unter jedem Scheitelbeine und ziehen Sie das Gehirn zu belichten.
    6. Mit den gekrümmten Arterienklemmen, kneifen die frontale Knochen, sie zu brechen, dann Pinzette oder das Gefäß Kanülierung Zange die gebrochenen Knochen zu entfernen. Schneiden Sie und entfernen Sie so schonend wie möglich die Dura mater, wie es mit der Präparation stören können.
    7. Schieben Sie den Spachtel unter dem Gehirn und ziehen Sie vorsichtig das Gehirn aus dem Schädel in der Schneidekammer zu platzieren (Pufferwanne), die zuvor mit eiskaltem ACSF gefüllt. Lassen Sie das Gehirnabkühlen mit 1 - 2 Min.
    8. Bereiten Sie die Dissektion Plattform durch eine Petrischale mit Eis füllen und etwas Eis, damit das Wasser größeren Oberflächenkontakt, bedecken Sie es mit dem Deckel und legen Sie eine Filterpapier an der Spitze. Befeuchten Sie das Filterpapier mit kaltem ACSF.
    9. Sobald das Gehirn abgekühlt wird, legen Sie das Gehirn auf dem Eis gefüllten Petrischale, und schnell die geeignete Präparation durchführen, um die gewünschte Ebene des Schneidens zu erhalten.
    10. Zur Erzielung sagittal Nucleus accumbens (NAC) enthält, verwenden einen einzigen Rasierklinge zu schneiden und entfernen Sie die olfaktorischen Tuberkel und das Kleinhirn, wenn sie noch vorhanden sind. Dann einen sagittalen Schnitt von 2 durchführen - 3 mm von der seitlichen Rand der rechten Hemisphäre die flache Oberfläche zu erhalten, die auf die Probe geklebt werden Halteplatte (siehe Schritt 2.8.11).
      Hinweis: Schneiden nur 2 - 3 mm von der seitlichen Rand der Hemisphäre wird die Sammlung von Scheiben mit dem NAK von beiden Hemisphären ermöglichen. Die geeignete Präparation hängtauf der Hirnregion, die untersucht wird. Hier wird die Dissektion durchgeführt, so NAc Neuronen in Hirnschnitten sagittal aufgezeichnet werden.
    11. Schnell Kleber (mit Sekundenkleber auf die Objekthalteplatte aufgebracht), um die flache Schnittfläche des Gehirns auf die Platte nach der gewünschten Ebene des Schneidens. Zur Erzielung sagittalen Hirnschnitten siehe Schritt 2.8.10.
    12. Unmittelbar platzieren und die Probe sichern Platte in der Schneidekammer hält, so wird das Gehirn rostro-kaudal in Scheiben geschnitten (Sicherheit, richten Sie den Klingenhalter nur, wenn die Probenplatte befestigt ist).
    13. Stellen Sie die Vibratom mit geeigneten Slicing - Parameter (Parameter im Labor für die in der Material erwähnt Vibratom verwendet: Geschwindigkeit 3 bis 4, Vibration 9-10 und Schichtdicke 250 & mgr; m).
    14. Beim Schneiden, mit einem Kunststoff-getrimmten Transferpipette die Gehirnscheiben auf die Rückgewinnungskammer zu übertragen (bei RT) (siehe Schritt 2.3). Die Erholungszeit kann abhängig von der neuronalen Typ abhängig, die im Studium(Typischerweise 30 bis 90 min).

3. Aufnahme Pipetten und Rig Vorbereitung

  1. Wenden Sie sich an die konkreten Vorgaben der Bedienungsanleitung des Puller Benutzer die gewünschten Mikro Eigenschaften zu erhalten.
    Hinweis: Für die MSNs, haben wir eine Pipette Widerstandsbereich von 3,2 bis 4,0 M & Omega; verwenden.
  2. Oxydieren das ACSF und stellen Sie den Durchfluss auf 2 ml / min. Vakuum-ACSF eine peristaltische Pumpe oder Vakuumleitungen in der Anlage installiert ist.
  3. Schalten Sie den Perfusions - Heizungssteuerung und stellen Sie die Temperatureinstellungen , um die gewünschte Temperatur zu erhalten (zB 31,8-32,2 ° C).
    Hinweis: Die Temperaturstabilität hängt davon ab, mit sowohl einer konstanten ACSF und konstanter Strömungsgeschwindigkeit in der Kammer. Da mehrere biophysikalischen Eigenschaften von Neuronen (beispielsweise Eingangswiderstand R i, die auch als Membranwiderstand, R m) sind temperaturempfindlich, um eine stabile Temperatur zu halten ist wichtig.
  4. Schalten Sie Computer gesteuerten Verstärker, Kamera, Mikromanipulator, und Mikroskop Hintergrundlicht. Wenn ein Experiment durchführen, die elektrische Stimulation des Gewebes erfordert, schalten Sie Stimulus-Controller und der Isolationseinheit.
    Hinweis: Einige Verstärker von anderen ein "Warm-up" vor dem Gebrauch herstellt empfehlen, so empfiehlt es sich das Handbuch für die genaue Arbeitsweise zu beraten.
  5. Starten Kameraerfassung, Signalerfassung und Verstärker-Software.
  6. Slice - Platzierung und Visualisierung:
    1. Unter Verwendung eines Kunststoff-getrimmten-Spitze Transferpipette, ziehen sanft in einem Hirnschnitt aus der Rückgewinnungskammer.
    2. Legen Sie die Transferpipette in die Aufnahmekammer und drücken Sie vorsichtig die Scheibe aus der Pipette auf die Deck den Boden der Kammer auskleiden.
      Hinweis: Solange kein Überlauf auftritt, ist es unschädlich ist, einige ACSF aus der Wiedergewinnungskammer zu haben, in das Bad zu verschütten.
    3. Verwenden einer Pinzette, um die Position der Scheibe s zu änderno der gewünschte Bereich wird genau in der Mitte der Aufnahme Kammer platziert werden. Verwenden Sie das Mikroskop geringer Leistung (4X) Objektivlinse und das Okular zur Unterstützung bei der Positionierung.
    4. Nachdem die gewünschte Position erreicht ist, sichern Sie den Hirnschnittposition mit einer Scheibe Niederhalte in der Kammer (auch als "Harfe" genannt).
    5. Wechseln Sie zu hoher Leistung (40X) Objektivlinse und senken Sie es sanft bis zum Kontakt mit dem ACSF in der Kammer gebildet wird.
    6. Verwenden Sie die Feineinstellung Rad das Gewebe in den Fokus zu bringen. Während in Kontakt mit dem ACSF, nicht die Grobeinstellung Rad am Mikroskop verwenden, da die Objektivlinse Senkung übermäßig die Scheibe zerschlagen oder sogar das Deckglas brechen den Boden der Kammer Futter, die ACSF verursachen kann auf den Kondensator zu verschütten und beschädigen.
    7. Wenn der Fokus auf Gewebeebene ist, beobachten Zellen in der Zielregion für Form. Tote Zellen sind leicht erkennbar durch ihre schwoll Plasmamembran und Kern ( Abbildung 1E). Gesunde Zellen sollen so rund, eiförmig oder elliptisch homogene Strukturen (Abbildung 1E) erscheinen.
    8. Suchen Sie nach einer Zielzelle. Markieren Sie es auf dem Computerbildschirm, um zu helfen, die Aufnahme Mikro führen. Wenn Software wie QCapture, ein Quadrat um die Zielzelle zeichnen, indem Sie die linke Maustaste zu halten.
    9. Heben Sie die Objektivlinse so wird es ausreichend Platz in der mit dem ACSF in Kontakt durch die Objektivlinse gebildet Kegel zu platzieren und die Aufnahme Mikro bewegen.
  7. Mikro Platzierung und Positionierung
    1. Unter Verwendung einer 1 - ml - Spritze, eine nichtmetallische Mikro Nadel und ein spezielles Filter, füllen Sie ein Mikro mit der internen Lösung im Voraus hergestellt nach dem geplanten Experiment (K + -basierten oder Cs + -basierte interne Lösung finden Sie in Schritt 1.1., 1.2 und Materialien für die Zusammensetzung). Verwenden Sie genug Lösung, so dass die interneLösung kommt in Kontakt mit dem Chlorid-beschichteten Silberdrahtelektrode innerhalb des Mikropipettenhalter.
      Hinweis: Die Silberdrahtelektrode chloriert werden kann es in Haushaltsbleiche durch Einweichen. Nukleosidtriphosphate (ATP & GTP) kann vor der internen Lösung zugesetzt werden zu können. Halten Sie die Spritze, um die Lösung auf Eis enthält ATP / GTP-Abbau zu verhindern.
    2. Stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen in der Mikropipette sind, wie sie kommen können, während die Mikropipette in das Gewebe und die Scheibe verschleiern.
    3. Platzieren der Mikropipette in den Elektrodenhalter so die Lösung in Kontakt mit dem Silberchlorid beschichteten Drahtelektrode kommt.
    4. Ziehen Sie die Pipette Kappe so dass der Kegelscheibe wird rund um die Mikropipette eine Dichtung bilden.
    5. Bewerben Überdruck vor der Mikropipette in der ACSF Eintauchens Schutt zu verhindern, dass die Pipette eingeben.
    6. Legen Sie die heads in der verriegelten Position (gegenüber der Kammer), und mit dem Mikromanipulator, guide sie in Richtung der Kammer nach unten, so dass es etwa unter der Mitte des eintauch Ziel.
    7. Während der Mikropipette mit dem Mikromanipulator zu bewegen (eingestellt bei mittlerer bis hoher Geschwindigkeit), verwenden Sie den Bildschirm, um die Mikropipette zu lokalisieren und sie in Richtung der Position der Zelle auf der XY-Achse führen.
    8. Messen Sie die Mikropipette Widerstand durch einen Spannungsaufbringungsschritt (beispielsweise 4 mV für 100 ms), die manuell oder automatisch über spezifische Software wie "Bad" Modus durchgeführt werden kann , wenn "Membrane Test" in Clampex Software (siehe Schritt 4) . Um die Mikro keine Luftblasen oder andere Fremdkörper , um sicherzustellen , blockieren, gelten Überdruck unter Verwendung des mit Luft gefüllten Spritze (zB 30 - ml - Spritze) , verbunden mit dem Mikrohalter mit Polyethylenschlauch.
    9. Nachdem der Mikropipette Löschen führen eine Offsetspannung Pipettenstrom auf Null zu reduzieren, was manuell oder mittels spezifischer Software erreicht werden kann, wie beispielsweise & #39; Pipetten Offset 'auf der computergesteuerten Verstärker commander.
      Hinweis: Diese Funktion ist für jede Spannung , die durch Konzentrationsunterschiede zwischen dem Bad und den Mikro Lösungen (dh Flüssigkeit Gangspotential 20) verursacht kompensieren.

4. Membrantest

Anmerkung: Dieser Schritt ist mit dem Verstärker gilt in den genannten Materialien.

  1. Bei Verwendung eines computergesteuerten Verstärker Kommandant verwenden, stellen Sie es immer auf Voltage-Clamp-Modus, um die Membran-Test durchzuführen.
    Hinweis: Bei der Membrantest in "Bath" -Modus eingestellt ist, die Membran Test die Messung der Mikropipette Beständigkeit ermöglicht und die Dichtungsfestigkeit, wenn die Dichtung gebildet wird.
  2. Sobald die Membran zerstört wird (siehe Schritt 5.8), schalten Sie die Membran - Test auf "Cell" Modus , so dass die Serienwiderstand (R s) (auch Zugangswiderstand genannt, R a), R i und Membrankapazität (C p)erhalten werden.

5. Endanflug, Seal Bildung und Gewinnung der Gesamtzellkonfiguration

  1. Mit dem Feinfokus-Rad, beginnen nach unten konzentriert, während die Mikropipette allmählich zu senken. konzentrieren sich immer zuerst nach unten und dann die Mikropipette weiter unten auf der Fokusebene. Dadurch wird sichergestellt, dass die Mikropipettenspitze nicht abrupt in die Scheibe durchdringen wird.
  2. Wenn die Mikropipette mit der Oberfläche der Scheibe in Berührung kommt, verlangsamen die Geschwindigkeit Mikromanipulator auf mittel-niedrig-Modus nach unten.
  3. Anwendung vorsichtig Licht positiven Druck mit der luftgefüllten Spritze mit dem Pipettenhalter verbunden jeglichen Schmutz von der Einflugschneise zu löschen.
  4. Nähern sich die Zelle entweder durch den XYZ Steuerknöpfe alternierende oder diagonal durch Annäherung (wenn der Mikromanipulators Modell erlaubt es), wobei beide XZ Achsen sind mit der Drehung der Z-Achse Knopfes verändert. Das letztere Verfahren wird vertikalen Kompression von Gewebe zu verhindern.
    Anmerkung: Hier ist das Ziel,die Zelle durch Zufügen minimalen Schaden an der Scheibe zu nähern. Wenn die Mikropipette nahe genug an die Zelle ein Grübchen (eine runde Verfärben der Zelloberfläche durch den positiven Druck ausgeübt durch die Spitze der Mikropipette verursacht werden ) (Figur 2) erscheint.
  5. Wenn die Grübchen (Bild 2-1) angezeigt wird , eine schwache und kurze Saugen durch das Rohr anzuwenden , die an den Pipettenhalter Saugrohr verbunden ist , um die Dichtung (Bild 2-2) zu erzeugen. Halten Sie die Membran-Test überwacht.
    Hinweis: Wenn eine Teildichtung gebildet wird (<1 GOhm), Injektion negativer Ströme, die durch die Haltepotential senken (auf dem Computer-gesteuerten Verstärker Kommandant) kann Dichtung Bildung erleichtern und erreichen Gigaohm Widerstand ( "Gigaohm Dichtung" oder "Giga"> 1 - 5 GOhm). Der hohe Widerstand der Dichtung (> 1 G & OHgr;) werden beide Grenzrauschkontamination zu dem aufgezeichneten Signal und trägt zur mechanischen Stabilität derPatch.
  6. Während eine undurchlässige bildet, verwenden Sie den computergesteuerten Verstärker Kommandant der Zelle Haltepotential möglichst nahe zu bringen Potential (V rest) , um physiologische Ruhe plötzliche Veränderungen zu verhindern , sobald die Membran zerstört wird. Zum Beispiel sind in der Regel MSNs spannungs geklemmt bei -70 oder -80 mV (physiologische V Rest: -70 bis -90 mV).
  7. Nachdem der Gigaseals gebildet hat, kompensieren manuell oder automatisch für schnelle und langsame Kapazität. Wenn ein computergesteuerter Verstärker Commander wie Multiclamp Kommandant, drücken Sie "Auto" für "Cp Fast 'und' Cp Slow".
  8. Wenn die Dichtung bleibt stabil und über 1 G & Omega; (oder Injektion von weniger als 10 - 20 pA die Zelle an der gewünschten Membranpotential zu halten), einen kurzen und starken Sog durch das gleiche Rohr gelten wie in 5.5 die Plasmamembran zum Bruch (Abbildung 2 -3).
    Hinweis: Dieser Vorgang kann einige Versuche nehmen. Eine gute Membranruptur erreicht wHenne Sog stark genug durchgeführt , so dass geplatzten Membran nicht die Mikro nicht verstopft (die während der Aufnahme zu einem Anstieg der R s führen kann), aber schwach genug , um in einem großen Teil der Membran oder der Zelle nicht ziehen.
  9. eine erfolgreiche Gesamtzellkonfiguration, überwachen regelmäßig die Mikro Lage zu bewerten und zu korrigieren signifikante Drift Nach dem Erreichen der, wie es zum Verlust des Patch führen kann. Drift Amplitude kann nach verschiedenen Faktoren variieren, beispielsweise die Qualität der rig Installation und Zugkräfte auf den heads. Im Idealfall sollte Drift fast nicht existent sein.
  10. In "Cell" Modus in der Membran Test anzuzeigen verschiedene Parameter der Zelle wie R i, R s und C p durch Umschalten. Überwachen Sie diese Parameter während der Aufnahme.
    Hinweis: Alle diese Parameter anfänglichen Gesundheitszustand der Zellen und Zelltypen zu überprüfen helfen können (siehe "Membrantest" Abschnitt, Schritt 4).
  11. Sobald the obigen Schritte abgeschlossen sind, bleiben in Voltage-Clamp - Modus Ströme (zB EPSCs, IPSCs), oder wechseln Sie zu Current-Clamp - Modus zu messen , wenn Planungsänderungen in der Membranspannung zu messen (zB Aktionspotential Brand). Für letztere injizieren entweder positive oder negative Strom die Zelle an der gewünschten Membranspannung zu halten (um diesen Schritt auszuführen, siehe Handbuch Anleitung zum Verstärker).

Ergebnisse

Temperatur, ein Faktor, der leicht durch den Experimentator gesteuert wird, beeinflusst die biophysikalischen Eigenschaften von Ionenkanälen und Rezeptoren und dadurch die Wellenform des postsynaptischen Ströme (PSCs) (EPSC und IPSCs) und die Fähigkeit von Neuronen Spitzen hervorzurufen. Abbildung 3 und Figur 4 zeigen die Wirkung der Temperatur auf die neuronale Aktivität und die Steigung der evozierten EPSCs (eEPSCs) sind. Die Brennmuster (3...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt das grundlegende Verfahren für whole-cell Patch-Clamp-Experimente an Neuronen in Hirnschnitten durchgeführt wird. Jedoch kann die Komplexität, Potential und Empfindlichkeit dieser Technik nicht vollständig in diesem Artikel beschrieben. Hier haben wir versucht, die grundlegenden Schritte zur Abgrenzung und wichtige Parameter unterstreichen, die für das Erreichen erfolgreiche und rigorosen Ganzzellaufnahmen kontrolliert werden muss. Für weitere theoretische Lernen haben viele Bücher und...

Offenlegungen

Keiner der Autoren haben konkurrierenden Interessen oder widerstreitenden Interessen.

Danksagungen

Diese Forschung wurde von UT Southwestern-Startfonds (SK) unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Isolated pulse stimulus generatorA.M.P.IMaster-8
Isolation unit (ISO-Flex)A.M.P.IISO-Flex
Computer controlled Amplifier Molecular DevicesMulticlamp 700B
Digital Acquisition systemMolecular DevicesDigidata 1500
MicroscopeOlympusBX-51
MicromanipulatorSutter InstrumentsMPC-200
Chamber and in-line HeaterWarner InstrumentsTC-344B
Vibratome SlicerLeica VT1000 S
Micropipette PullerNarishigePC-10
Imaging CameraQ ImagingQIClick-F-M-12
Narishige pipette puller PC-10NarishigePC-10
Glass capillariesWPITW150F-3
Slice hold-down (harp)Warner Instruments64-0255
Slice ChamberWarner InstrumentsRC-26
Nonmetallic syringe needleWorld Precision InstrumentsMF28G67-5
Syringe filtersNalgene176-0045
Glue GunHome Depotvarious
Gas dispersion tubeAce Glass Inc.various
Decapitation scissorsHome Depot100649198
Scalpel Handle #3World Precision Instruments500236
Small straight sharp tips scissorsWorld Precision Instruments14218
Vessel canulation forceps World Precision Instruments500453
Curved hemostatic forcepsWorld Precision Instruments501288
Economy Tweezers #3World Precision Instruments501976-6
SpatulaFisher Scientific14357Q
Scooping spatulaFisher Scientific14-357Q
Petri dishFisher Scientific08-747B
Filter paperLab DepotCFP1-110
Solutions
Cs-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm)
D-gluconic acid 50% Sigma Aldrich/variousG1951
Cesium-OH (CsOH) 50% Sigma Aldrich/various232041
NaCl, 2.8 mMSigma Aldrich/variousS7653
HEPES, 20 mMSigma Aldrich/variousH3375
EGTA, 0.4 mMSigma Aldrich/variousE4378
tetraethylammonium-Cl, 5 mMSigma Aldrich/variousT2265
Na2GTP, 0.3 mMSigma Aldrich/variousG8877
MgATP, 2 mMSigma Aldrich/variousA9187
K-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm)
K D-gluconate, 120 mMSigma Aldrich/variousG4500
KCl, 20 mMSigma Aldrich/variousP3911
HEPES, 10 mMSigma Aldrich/variousH3375
EGTA, 0.2 mMSigma Aldrich/variousE4378
MgCl2Sigma Aldrich/variousM8266
Na2GTP, 0.3 mMSigma Aldrich/variousG8877
MgATP, 2 mMSigma Aldrich/variousA9187
Standard artificial cerebrospinal fluid (ACSF, osmolarity ≈ 300-310 mOsm)
KCl, 2.5 mMSigma Aldrich/variousP3911
NaCl, 119 mMSigma Aldrich/variousS7653
NaH2PO4•H2O, 1 mMSigma Aldrich/variousS9638
NaHCO3, 26.2 mMSigma Aldrich/variousS8875
Glucose, 11 mMSigma Aldrich/variousG8270
MgSO4-7H2O, 1.3 mMSigma Aldrich/various230391
CaCl2-2H2O, 2.5 mMSigma Aldrich/variousC3881
Additional compounds used for solutions preparation
KOHvarious
Kynurenic acidSigma Aldrich/variousK3375

Referenzen

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