Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

Riepilogo

Questo protocollo descrive passaggi procedurali di base per l'esecuzione di cellule intere registrazioni patch-clamp. Questa tecnica consente di studiare il comportamento elettrico dei neuroni, e quando eseguito in sezioni di cervello, permette di valutare diverse funzioni neuronali da neuroni che sono ancora integrati in circuiti cerebrali relativamente ben conservati.

Abstract

Whole-cell patch-clamp registrazione è una tecnica elettrofisiologica che permette lo studio delle proprietà elettriche di una parte sostanziale del neurone. In questa configurazione, la micropipetta è a stretto contatto con la membrana cellulare, che impedisce la dispersione di corrente e quindi fornisce misure di corrente ionica più preciso del metodo di registrazione elettrodo affilato intracellulare precedentemente utilizzato. Classicamente, la registrazione a cellula intera può essere eseguita su neuroni in vari tipi di preparati, compresi i modelli di colture cellulari, i neuroni dissociate, i neuroni in fettine di cervello, e in animali anestetizzati o sveglio intatte. In sintesi, questa tecnica ha enormemente contribuito alla comprensione della passivi e attivi proprietà biofisiche di cellule eccitabili. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è che fornisce informazioni sulle modalità specifiche manipolazioni (ad esempio, farmacologico, sperimentatore indotta plasticità) possono alterare le funzioni neuronali specifici ochannels in tempo reale. Inoltre, significativa apertura della membrana plasmatica permette alla soluzione pipetta interna di diffondersi liberamente nel citoplasma, predisporre mezzi per farmaci introduzione, ad esempio, agonisti o antagonisti di specifiche proteine ​​intracellulari, e manipolare tali obiettivi senza alterare le loro funzioni in cellule vicine. Questo articolo si concentrerà sulla registrazione a cellula intera eseguita su neuroni in fettine cerebrali, una preparazione che ha il vantaggio di registrazione neuroni relativamente ben conservati circuiti cerebrali, cioè in un contesto fisiologicamente rilevanti. In particolare, quando combinato con adeguate farmacologia, questa tecnica è uno strumento potente che consente di identificare neuroadaptations specifici che si sono verificati in seguito a qualsiasi tipo di esperienze, quali l'apprendimento, l'esposizione a sostanze d'abuso, e lo stress. In sintesi, le registrazioni a cellula intera patch-clamp in fettine di cervello forniscono i mezzi per misurare in ex vivo preparazione cambiamenti duraturinelle funzioni neuronali che si sono sviluppate negli animali svegli intatti.

Introduzione

La tecnica del patch-clamp, una tecnica elettrofisiologica che è stato sviluppato alla fine del 1970 ^1,2, è uno strumento primario per studiare le funzioni di uno o più canali ionici nel tessuto vivo. Tra le diverse configurazioni di patch che si possono ottenere, registrazioni whole-cell patch-clamp permettono lo studio del comportamento elettrico di una parte sostanziale del neurone. Classicamente, questa tecnica viene eseguita in vitro sia su fettine cerebrali, neuroni appena dissociate, o su modelli di coltura cellulare ^3. Quando eseguito sui neuroni in fettine cerebrali, questa tecnica presenta diversi vantaggi. In particolare: (i) i neuroni sono registrati nei circuiti cerebrali relativamente conservate che in qualche misura, e rispetto alle preparazioni di coltura cellulare, forniscono un ambiente che è fisiologicamente rilevanti ^3. Questo permette di catturare in anticipo, o anche il monitoraggio in tempo reale, gli eventi cellulari e molecolari che sono attivati ​​da qualsiasi tipo di pharmacolog acutamanipolazioni iCal - una risoluzione temporale che non può essere raggiunto utilizzando classica in condizioni in vivo; (ii) capacità di identificare visivamente le regioni del cervello in fettine di cervello permette un'elevata specificità regionale ³ sia per la regione del cervello studiato e per i neuroni specifici quando esprimono marcatori fluorescenti; (iii) l'accesso allo spazio intracellulare della cellula aprendo una porzione significativa della membrana plasmatica (in contrasto pungere la membrana con una micropipetta tagliente per le registrazioni intracellulari) ^4. A sua volta, questo consente al contenuto o la concentrazione di ioni specifici che compongono la soluzione interna da modificare bersagli molecolari modo o meccanismi cellulari possono essere studiati in condizioni diverse. Ad esempio, su di stabilire cellula intera configurazione, qualsiasi agente farmacologico specifico (ad esempio, gli antagonisti) che si può aggiungere alla micropipetta di registrazione (patch pipetta) soluzione sarà direttamente diffondersi nel citoplasma e di agire sul suo putative bersagli intracellulari senza alterare la funzione obiettivo in cellule vicine. Inoltre, rispetto alla registrazione micropipetta tagliente, la grande apertura sulla punta dell'elettrodo patch clamp offre minore resistenza, meno rumore CONCORRENTI, e quindi un migliore accesso elettrico all'interno della cella ^4. Si noti tuttavia che l'ampia apertura sulla punta della pipetta può portare alla dialisi cellule, e quindi la perdita di macchinario molecolare intracellulare che può essere critico per l'espressione dei fenomeni biologici che sono in fase di studio ^5,6. In questo caso, le registrazioni elettrodo taglienti può essere più adatto. Questo tipo di registrazioni richiede micropipette con un poro che è molto più piccolo di quelli usati per le registrazioni cellule intere, impedendo così la maggior parte lo scambio ionico tra lo spazio intracellulare e la soluzione pipetta interna.

Ogni forma di esperienza (acuta o cronica), compreso l'apprendimento ^7-10, l'esposizione a sostanze d'abuso ^11,12, lo stress ^13,14, ecc, possono alterare i vari aspetti della funzione neuronale in regioni specifiche del cervello. Poiché queste alterazioni spesso richiedono tempo per svilupparsi (ore o giorni), le registrazioni integrali delle cellule in fettine di cervello da animali che sono stati sottoposti a una specifica esperienza permettono ai ricercatori di identificare questi cambiamenti. In sostanza, molti (se non tutti) i componenti che partecipano nelle funzioni neuronali (per esempio, ligando-attivato canali ionici, canali ionici voltaggio-dipendenti, trasportatori neurotrasmettitori), e in tal modo l'attività del circuito del cervello e del comportamento, può essere alterato da esperienza (l'esperienza-dipendente plasticità) ^10,15-17. A livello neuronale, l'attività circuito cerebrale emerge dalle interazioni costanti tra sinaptica (ad esempio, trasmissione glutammato) e fattori intrinseci eccitabilità cellulare (per esempio, canali ionici axosomato-dendritica: sodio, Na ^+, potassio, K ^+, e di calcio, Ca ²⁺ ). In condizioni specifiche che utilizzano da tE-CELL patch-clamp tecniche elettrofisiologiche, alterazioni di segnale provenienti in particolare da variazioni sinaptica vs. eccitabilità intrinseca può essere isolato.

Nella maggior parte dei casi, l'eccitabilità sinaptica è valutato utilizzando la tecnica voltage-clamp whole-cell. Questa modalità di registrazione permette la misura di correnti ioniche [ad esempio, mediati dai recettori di acido α-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isoxazolepropionic ( recettori AMPA) e recettori N-metil-D-aspartico (NMDA)] attraverso la membrana plasmatica neuronale, mentre tengono il potenziale di membrana ad una tensione impostata. Qui, sperimentatori utilizzano le soluzioni interne micropipetta contenenti cesio (Cs ^+), una vasta bloccanti di canali K ⁺ (chiave fattori intrinseci eccitabilità). Su creazione di cellula intera configurazione, la diffusione di Cs ⁺ nello spazio intracellulare bloccherà canali K ^+, e quindi permetterà sia relativamente efficiente spazio-clamp e presfogare influenza dei fattori intrinseci eccitabilità su altre misure. Problemi di spazio-clamp, cioè, la difficoltà di tensione-clamp tutta la cella, sorgono quando si registra cellule di forma irregolare (ad esempio, neuroni), e in particolare neuroni con un vasto e complesso dendritic arbor ^18,19. Poiché morsetto tensione somatica controlli scarsamente voltaggio nella struttura dendritica dei neuroni, vari aspetti dei segnali elettrici dendritiche in esame sono distorti in maniera dendritica distanza-dipendente. Combinato con strumenti farmacologici come picrotoxin (acido gamma-aminobutirrico, GABA _A antagonista del recettore) o acido kinurenico (ampio bloccante dei recettori del glutammato) disciolti nella soluzione extracellulare (fluido cerebro-spinale artificiale, ACSF), questa tecnica permette di misurare glutammato recettore e le correnti GABA _A R-mediata, rispettivamente.

Al contrario, l'eccitabilità intrinseca viene generalmente valutato in modalità di registrazione corrente-clamp.Al contrario di registrazione voltage-clamp, questa modalità di registrazione permette la misura delle variazioni potenziali di membrana indotte da correnti ioniche che fluisce attraverso la membrana plasmatica neuronale. Tipicamente, alterazione dell'eccitabilità intrinseca è valutata attraverso cambiamenti nella capacità di neuroni di generare potenziali d'azione, che richiede sia Na ⁺ e canali del K ^+. Pertanto, quando si eseguono registrazioni corrente-clamp, micropipette sono riempiti con una soluzione interna che contiene K ⁺ anziché Cs ^+. In combinazione con agenti farmacologici che bloccano glutammato e GABA _A correnti recettoriali disciolti nel ACSF, questo disegno sperimentale permette la misura del contributo di fattori intrinseci (ad esempio, K ⁺ canali) a neuronale senza essere contaminati da potenziali variazioni dell'eccitabilità sinaptica fattori.

Questo articolo descrive i passi procedurali necessari di base to (i) prepara fette di cervello sane; (Ii) ottenere cellula intera configurazione, e (iii) monitorare i parametri fondamentali per valutare sinaptica e l'eccitabilità intrinseca.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con i protocolli approvati dalla Institutional Animal Care e Usa Comitato UT Southwestern, e sono stati scelti in modo da minimizzare lo stress, disagio e dolore provato da animali da esperimento.

1. Soluzioni

Nota: Preparare le soluzioni interne micropipetta in anticipo. Per la maggior parte degli scopi sperimentali di base, due tipi di soluzioni dovrebbero bastare: le soluzioni basate Cs ⁺ -based e K ^+.

1. Le soluzioni basate su Usa CS ⁺ (ad esempio, la soluzione Cs ⁺ gluconato, vedi Materiali) per esperimenti di voltage-clamp. Preparare a temperatura ambiente.
   1. Preparare 117 mm soluzione Cs-gluconato miscelando 4,62 g di acido D-gluconico (~ 3.696 ml), con 3,54 g CsOH (~ 2,01 ml).
   2. Aggiungere DDH ₂ O a 90 ml e lasciar riposare e stabilizzare per 30 min.
   3. Aggiungere gli ingredienti solidi (20 mm Hepes = 0,476 g; 0,4 mm EGTA = 15,2 mg; 2,8 mm NaCl = 16,4 mg; 5 mM tetraetilammonio (TEA) Cloruro = 83 mg).
   4. Aggiungere DDH ₂ O per ~ 97 ml.
   5. Regolare il pH della soluzione con 50% CsOH a 7,2 - 7.3.
   6. Controllare osmolarità e correggere, se necessario, con DDH ₂ O.
      Nota: Una buona gamma è ~ 280-285 mOsm. osmolarità ottimale dovrebbe essere 15 - 20 mOsm sotto l'osmolarità di ACSF standard (di solito 300-310 mOsm, 300 mOsm nel nostro laboratorio). Osmolarità può variare a seconda soluzioni composizioni specifiche.
   7. Aliquota da 1.000 ml e conservare a -20 ° C o al di sotto.
   8. Preparare, un'aliquota, congelamento, e aggiungere ATP / GTP alla soluzione interna del giorno di registrazione.
      1. Aggiungere 64.63 mg ATP a 10 mg GTP e sciogliere in 637.11 ml di DDH ₂ O.
      2. Preparare 10 aliquote microlitri e conservare a -20 ° C o al di sotto. Mescolare ogni 100x aliquota con 1000 ml di soluzione interna il giorno dell'esperimento. Una volta ATP / GTP viene aggiunto alla soluzione interna, mantenere in ghiaccio per evitare degradati ATP / GTPsopra.
2. Le soluzioni basate su l'uso K ⁺ (ad esempio, la soluzione K-gluconato, vedi Materiali) per entrambi gli esperimenti current- e la tensione-clamp dove K ⁺ conduttanze rimangono funzionale in modo che scarica neuronale può essere valutata. Preparare a temperatura ambiente.
   1. Pesare tutti i materiali secondo il volume finale desiderato. Per la preparazione di 90 ml di soluzione, 120 mm K-gluconato = 2.81 g; 20 mM KCl = 0,149 g; 10 mM HEPES = 0,238 g; 0,2 mM EGTA = 0,008 g; 2 mM MgCl ₂ = 0,021 _g.
   2. Usi abbastanza DDH ₂ O a raggiungere il 90% del volume soluzione finale. Ciò dovrebbe garantire che abbastanza spazio è lasciato per il pH e la regolazione osmolarità.
   3. Dopo aver aggiunto e mescolando tutti gli ingredienti, assicurarsi che la soluzione è chiara prima di misurare il pH.
   4. Mentre mescolando la soluzione, aggiustare il pH a 7,2-7,3 usando K ⁺ idrossido (KOH).
   5. Dopo aver regolato il pH, utilizzare la osmometer e annunciosolo osmolarità di 280-285 mOsm.
      Nota: osmolarità ottimale dovrebbe essere 15 - 20 mOsm sotto l'osmolarità di ACSF standard (di solito 300-310 mOsm, 300 mOsm nel nostro laboratorio). Osmolarità può variare a seconda soluzioni composizioni specifiche.
   6. Aliquota da 1.000 ml e conservare a -20 ° C o al di sotto.
   7. Preparare, aliquota, congelare, e aggiungere ATP / GTP alla soluzione interna, al momento della registrazione (vedere il punto 1.1.8).
3. Preparare 1 l di ACSF standard (vedi Materiali).
   Nota: Usiamo questa ricetta nel nostro laboratorio per la registrazione di neuroni spinosi medi (MSN) in fettine di cervello, tuttavia, le ricette possono differire tra i laboratori, e di conseguenza, si consiglia lo sperimentatore usare una ricetta che viene utilizzato di routine quando si registra la regione del cervello di interesse .
4. Preparare la ACSF dissezione (soluzione affettare, ~ 125 ml Nota:. Volume esatta dipenderà dalle dimensioni della camera di affettatura come dovrebbe immergere completamente il cervello) per l'uso inpassi 2,2-2,8.
   1. Preparare 5 mm di acido kinurenico (per bloccare glutammato processi eccitotossici recettore indotta) in serie ACSF in un volume sufficiente per immergere il cervello durante affettare. Utilizzare un sonicatore per aiutare a sciogliere l'acido kinurenico.
      Nota: La lunghezza della sonicazione può variare a seconda del volume e la quantità di solidi nella soluzione. Le soluzioni devono essere chiari dalla fine del processo (circa 1 - 2 min nelle nostre condizioni).
   2. Raffreddare mentre ribolle con il 95% O _2, 5% di gas CO ₂ in un secchio di ghiaccio finché la temperatura raggiunge i 0-2 ° C.
5. Preparare ACSF per la registrazione.
   1. Prendere 1 L standard ACSF (o qualunque lasciato dalla soluzione preparata al punto 1.3) a cui possono essere aggiunti opportuni agenti farmacologici seconda esperimenti pianificati.
      1. Ad esempio, aggiungere 100 micron picrotoxin quando si registrano le correnti post-sinaptica eccitatoria o potenziali (EPSCs o EPSPS), antagonisti dei recettori del glutammato (kynureL'acido nic, 2 mm; o una combinazione di D-APV 50 mM con CNQX 10 pM) durante la registrazione correnti inibitorie post-sinaptici o potenziali (iPSCs o IPSPs), ed entrambi Picrotoxin e glutammato antagonisti del recettore per valutare neuronale in assenza di qualsiasi influenza di eventi sinaptici.

2. Preparazione Slice

1. Costruire o di ottenere una camera di recupero fetta.
   Nota: Il principio di una camera di recupero è semplice e può essere effettuata in laboratorio (Figura 1). Brevemente, la camera è un contenitore nel quale è inserito un cestello per contenere le fette di cervello ad un livello che è inferiore alla superficie ACSF. Diverse società scientifiche vendono anche le camere di recupero fetta.
   1. A titolo di esempio, ottenere quattro anelli (4 - alti 6 millimetri) (Figura 1A, vista laterale, b, vista superiore) dal taglio di una siringa da 30 cc. Poi, colla reti allungato (ad esempio, tagliato da un hos nylone) ad un lato degli anelli per tenere le fette di cervello (Figura 1B) e incollare gli anelli insieme.
      Nota: Una pistola colla può essere utilizzato.
   2. Una volta che i quattro anelli sono incollati, incollare una parete di plastica a forma di trapezio isoscele curvo a due degli anelli (Figura 1A e B) per deviare bolle di ossigeno dalle fette di cervello recupero (Figura 1C e D). Come mostrato nella Figura 1D, inserire un sistema ad ossigeno diffondente (qui, un tubo di dispersione di gas) sullo stesso lato delle pareti di plastica.
2. Prima di affettare, ossigenare (95% O _2/5% di CO ₂₎ e raffreddare la soluzione per affettare (vedi punto 1.4) per 0-2 ° C.
3. Riempire la camera di recupero personalizzato con ACSF di serie a temperatura ambiente. Assicurarsi che il ACSF è ben ossigenato (20 - 30 min, tempo può variare a seconda del volume della camera) prima di posizionare le fette nella camera di recupero. Assicurarsi che le bolle di gas non vengano a con direttatatto con le fette o interrompere.
4. Linea la vaschetta del ghiaccio vibratome con ghiaccio e riempire con acqua fredda in modo che un terzo alla metà della camera di taglio è sommerso. Posizionare accuratamente un sistema di erogazione di ossigeno (ad esempio, gas diffondente pietra) ed una sonda di temperatura nella camera di affettatura così non oggetto interferisce con il movimento della lama o manipolazione slice.
5. Preparare l'area dissezione e gli strumenti necessari per estrarre il cervello e sezionare la regione del cervello desiderato.
   Nota: La dissezione esatta eseguita dipenderà regione specifica del cervello studiato come diverse strutture cerebrali richiederanno affettare in piani diversi (ad esempio, coronali, sagittali, o fette orizzontali.).
   1. Posizionare i seguenti strumenti su un underpad: forbici la decapitazione, bisturi, piccole dritte forbici punta acuminata, pinze nave incannulamento (o qualsiasi strumento chirurgico con una punta larga, come rongeurs, che è più adatto per crani di ratto), curve pinze emostatiche, TWeezers, spatola, scavare spatola, carta da filtro, piastra di Petri, lama di singolo bordo di rasoio, e colla cianoacrilato.
6. Quando la temperatura raggiunge 0 - 2 ° C, trasferire la soluzione affettare alla camera affettatrice (vasca del buffer).
7. Anestetizzare il mouse in una camera di essiccazione con isoflurano. quantità esatta può variare a seconda delle dimensioni della camera utilizzata, ma per una piccola gabbia shoebox utilizzare alcune gocce (~ 3 - 4). Lasciare il mouse nella gabbia fino immobile reso (non risponde a stimoli tattili; circa 15 sec per le condizioni descritte qui). Eseguire test di coda e pinch piede per garantire che l'animale è profondamente anestetizzato, poi decapitarlo prima che il cuore smette di battere (migliora la vitalità cellulare).
   Nota: Con adeguata giustificazione, alcuni laboratori ottenere l'autorizzazione per eseguire la decapitazione in diretta al fine di minimizzare il più possibile i processi eccitotossici e migliorare la vitalità cellulare.
8. Eseguire la dissezione.
   Nota: Il cervello deve essereestratto rapidamente (<45 sec).
   1. Usando il bisturi tagliare la pelle superficiale, sulla parte superiore del cranio da rostrale a caudale.
   2. Peel cuoio capelluto su ciascun lato della testa.
   3. Utilizzando piccole forbici rette punta affilata, tagliare la piastra interparietale lungo la sutura lambdoidea per rimuovere il cervelletto. Rimuovere l'osso occipitale.
   4. Utilizzando le stesse forbici, tagliare la sutura sagittale.
   5. Far scorrere la pinza nave incannulamento (o Rongeurs se rompere un teschio topo) sotto ogni ossa parietali e tirare per esporre il cervello.
   6. Utilizzando le pinze emostatiche curve, stringere le ossa frontali per rompere loro, quindi utilizzare pinzette o le pinze nave incannulamento per rimuovere le ossa rotte. Tagliare e rimuovere la dura madre il più delicatamente possibile in quanto si può interferire con la dissezione.
   7. Far scorrere la spatola sotto il cervello e tirare delicatamente il cervello fuori dal cranio per posizionarlo nella camera di taglio (vassoio buffer) precedentemente riempito con ACSF ghiacciata. Lasciate che il cervelloraffreddare per 1 - 2 min.
   8. Preparare la piattaforma di dissezione riempiendo una capsula di Petri con ghiaccio e acqua di ghiaccio per consentire una maggiore superficie di contatto, coprire con il coperchio e mettere un filtro di carta sulla parte superiore. Bagnare la carta da filtro con ACSF freddo.
   9. Una volta che il cervello è raffreddato, collocare il cervello sul piatto Petri piena di ghiaccio, ed eseguire rapidamente la dissezione appropriata per ottenere il piano desiderato di affettatura.
   10. Per ottenere fette sagittali contenenti nucleus accumbens (NAC), utilizzare un unico filo della lama di rasoio per tagliare e rimuovere i tubercoli olfattive e il cervelletto se sono ancora presenti. Quindi, eseguire un taglio sagittale di 2 - 3 mm dal bordo laterale dell'emisfero destro per ottenere la superficie piana che sarà incollato sul campione in possesso di piastra (vedere il punto 2.8.11).
       Nota: taglio solo 2 - 3 mm dal bordo laterale dell'emisfero permetterà la raccolta di fette contenenti NAc da entrambi gli emisferi. La dissezione appropriata dipenderàsulla regione del cervello che è indagato. Qui, la dissezione viene eseguita neuroni in modo NAC può essere registrati in fettine di cervello sagittali.
   11. Rapidamente colla (con colla cianoacrilato applicata al piatto portacampione tiene) la superficie tagliata piatta del cervello sulla piastra secondo il piano desiderato di affettatura. Per ottenere fettine di cervello sagittali vedere passo 2.8.10.
   12. Immediatamente posizionare e fissare il campione in possesso di placca nella camera di taglio in modo che il cervello è affettato rostro-caudale (per la sicurezza, ha istituito il supporto della lama solo quando la piastra del campione è assicurato).
   13. Impostare la vibratome con i parametri appropriati affettatrici (parametri utilizzati in laboratorio per la vibratome cui Materiali: velocità 3-4, 9-10 vibrazioni, e fetta dello spessore di 250 micron).
   14. Al taglio, utilizzare una pipetta di trasferimento di plastica bordato di trasferire le fette di cervello alla camera di recupero (a temperatura ambiente) (vedi punto 2.3). Il tempo di recupero può variare a seconda del tipo neuronale che è allo studio(Tipicamente 30 - 90 min).

3. Registrazione Micropipette e Preparazione Rig

1. Fare riferimento alle linee guida specifiche del manuale d'uso estrattore per ottenere le caratteristiche desiderate micropipetta.
   Nota: Per MSN, utilizziamo una serie di resistenza pipetta di 3,2-4,0 MW.
2. Ossigenare il ACSF e regolare il flusso di 2 ml / min. ACSF vuoto utilizzando un peristaltiche linee pompa o per vuoto installate nella struttura.
3. Accendere il controller di riscaldamento perfusione e regolare le impostazioni di temperatura per ottenere la temperatura desiderata (ad esempio, il 31,8 - 32.2 ° C).
   Nota: Stabilità di temperatura dipende da avere sia un livello ACSF costante e velocità del flusso costante nella camera. Poiché diverse proprietà biofisiche dei neuroni (ad esempio, la resistenza di ingresso, R _i, chiamato anche la resistenza della membrana, R _m) sono sensibili alla temperatura, mantenendo una temperatura stabile è importante.
4. Accendere compuAmplificatore ter-controllato, macchina fotografica, micromanipolatore, e la luce del microscopio sfondo. Se si esegue un esperimento che richiede la stimolazione elettrica del tessuto, accendere controllore stimolo e l'unità di isolamento.
   Nota: Alcuni amplificatori da altri produttori di raccomandare un "warm-up" prima dell'uso, quindi si raccomanda di consultare il manuale per la procedura operativa esatto.
5. Inizia cattura macchina fotografica, l'acquisizione del segnale e il software dell'amplificatore.
6. Fetta posizionamento e visualizzazione:
   1. Usando una pipetta di trasferimento di plastica tagliata a punta, aspirare lentamente in una fetta del cervello dalla camera di recupero.
   2. Posizionare la pipetta di trasferimento nella camera di registrazione e premere delicatamente la fetta dalla pipetta sul vetrino coprioggetti rivestono il fondo della camera.
      Nota: Finché non troppo pieno è in corso, è innocuo per avere qualche ACSF dalla camera di recupero versare nella vasca.
   3. Utilizzare pinze per modificare la posizione della fetta so l'area desiderata sarà posizionato esattamente al centro della camera di registrazione. Utilizzare il microscopio a bassa potenza (4X) lente obiettivo e l'oculare per l'assistenza nel posizionamento.
   4. Dopo la posizione desiderata è stata raggiunta, fissare la posizione fetta cervello con una fetta hold-down (noto anche come "arpa") nella camera.
   5. Passare a elevata potenza (40X) lente dell'obiettivo e abbassarlo delicatamente fino a quando il contatto è formata con il ACSF nella camera.
   6. Usare la ruota di regolazione fine per portare il tessuto a fuoco. Mentre in contatto con il ACSF, non utilizzare la rotella di regolazione grossolana sul microscopio ad abbassare la lente obiettiva eccessivamente può schiacciare la fetta o addirittura rompere il vetrino che costeggiano il fondo della camera, che può causare ACSF versare sul condensatore e danneggiarlo.
   7. Quando il focus è a livello dei tessuti, osservare le cellule nella regione di destinazione per la forma. Le cellule morte sono facilmente identificabili per la loro membrana plasmatica gonfiato e il nucleo ( Figura 1E). Le cellule sane dovrebbero apparire come rotonda, ovoidale, o strutture omogenee ellittica (Figura 1E).
   8. Cercare una cellula bersaglio. Segnare sullo schermo del computer, al fine di aiutare a guidare la micropipetta registrazione. Se si utilizza software come QCapture, disegnare un quadrato attorno alla cella di destinazione tenendo premuto il tasto sinistro del mouse.
   9. Sollevare la lente obiettivo così ci sarà spazio sufficiente nel cono formato dalla lente obiettivo essendo in contatto con il ACSF per posizionare e spostare la micropipetta registrazione.
7. Micropipetta Placement e Posizionamento
   1. Usando una siringa da 1 ml, un ago microsiringa non metallico, ed un filtro dedicato, riempire una micropipetta con la soluzione interna preparata in anticipo secondo l'esperimento pianificata (K ⁺ sede o Cs ⁺ -based soluzione interna, vedere i passi 1.1., 1.2 e materie per la composizione). Utilizzare abbastanza soluzione in modo che il internasoluzione viene a contatto con l'elettrodo a filo di argento cloruro rivestite all'interno del supporto micropipetta.
      Nota: L'elettrodo filo d'argento può essere clorata immergendola in candeggina. trifosfati nucleosidici (ATP e GTP) possono essere aggiunti alla soluzione interna prima dell'uso. Tenere la siringa contenente la soluzione in ghiaccio per evitare il degrado ATP / GTP.
   2. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nel micropipetta in quanto possono venire fuori mentre la micropipetta è nel tessuto e oscurano la fetta.
   3. Posizionare la micropipetta nel supporto dell'elettrodo per cui la soluzione viene a contatto con l'elettrodo a filo cloruro d'argento rivestito.
   4. Serrare il tappo pipetta in modo che la rondella cono formerà un sigillo intorno alla micropipetta.
   5. Applicare una pressione positiva prima di immergere la micropipetta nel ACSF per evitare che i detriti di entrare nella pipetta.
   6. Posizionare headstage in posizione di blocco (verso la camera), e utilizzando il micromanipolatore, guide giù verso la camera in modo che è approssimativamente sotto il centro dell'obiettivo immersa.
   7. Durante lo spostamento della micropipetta con micromanipolatore (fissato a media ad alta velocità), utilizzare lo schermo del computer per individuare la micropipetta e guidarlo verso la posizione della cella sull'asse XY.
   8. Misurare la resistenza micropipetta applicando un gradino di tensione (per esempio, 4 mV per 100 msec), che può essere eseguita manualmente o automaticamente mediante software specifico come la modalità 'vasca' se utilizza "Test membrana" nel software Clampex (vedi anche punto 4) . Per assicurarsi che non bolle d'aria o di altri corpi estranei bloccano la micropipetta, applicare pressione positiva usando la siringa piena d'aria (ad esempio, 30 cc siringa) collegato al supporto micropipetta con tubo in polietilene.
   9. Dopo aver eliminato la micropipetta, eseguire un offset per ridurre la corrente pipetta a zero tensione, che può essere eseguita manualmente o tramite software specifico come & #39; compensato 'sul comandante amplificatore controllato dal computer pipetta.
      Nota: Questa funzione di compensare qualsiasi tensione causata da differenze di concentrazione tra la vasca e le soluzioni micropipetta (cioè, liquido potenziale svincolo ^20).

4. Prova a membrana

Nota: Questo passaggio si applica all'amplificatore menzionato nei Materiali.

1. Quando si utilizza un computer controllato comandante amplificatore, impostare sempre su modalità tensione-clamp per eseguire il test della membrana.
   Nota: Quando la prova membrana è impostato in modalità "bagno", il test membrana consente la misurazione della resistenza micropipetta e la resistenza tenuta quando si forma il sigillo.
2. Una volta che la membrana si rompe (vedi passo 5.8), passa il test membrana modalità "Cell", in modo che la resistenza serie (R _s) (chiamato anche resistenza di accesso, R _a), R _i e capacità di membrana (C _p) puòessere ottenuto.

5. Final Approach, Formazione Seal, e ottenere la cellula intera configurazione

1. Utilizzando la ruota messa a fuoco fine, iniziare a concentrarsi verso il basso, riducendo al contempo la micropipetta a poco a poco. Sempre concentrarsi verso il basso e poi abbassare la micropipetta verso il basso rispetto al piano di messa a fuoco. Questo farà sì che la punta micropipetta non bruscamente penetrare nella fetta.
2. Quando la micropipetta viene a contatto con la superficie della fetta, rallentare la velocità micromanipolatore nella modalità a medio-bassa.
3. applicare una leggera pressione positiva leggera con la siringa piena d'aria collegato al titolare pipetta per eliminare tutti i residui dal percorso di avvicinamento.
4. Approccio cella sia con tensione alternata con le manopole XYZ, o avvicinandosi diagonale (se il modello micromanipolatore consente) in cui entrambi gli assi XZ vengono modificate con la rotazione della manopola dell'asse Z. Quest'ultimo metodo impedirà compressione verticale di tessuto.
   Nota: Qui, l'obiettivo èavvicinare la cella infliggendo danno minimo per la fetta. Quando la micropipetta è abbastanza vicino alla cella appare una fossetta (a scolorimento giro di superficie cellulare causata dalla pressione positiva applicata attraverso la punta della micropipetta) (Figura 2).
5. Quando la fossetta (Figura 2-1), applicare una aspirazione debole e breve attraverso il tubo che è collegato al tubo di aspirazione titolare pipetta in modo da creare la guarnizione (Figura 2-2). Continuare a monitorare il test della membrana.
   Nota: Se si forma una tenuta parziale (<1 G), l'iniezione di correnti negative abbassando il potenziale tenendo (il comandante amplificatore controllato dal computer) può facilitare la formazione di tenuta e raggiungere gigaohms resistenza ( "sigillo gigaohm" o "gigaseal"> 1 - 5 GΩ). L'elevata resistenza della guarnizione (> 1 G) saranno entrambi contaminazione rumore limite al segnale registrato e contribuire alla stabilità meccanica delpatch.
6. Mentre un gigaseal sta formando, utilizzare il telecomando dell'amplificatore controllato dal computer per portare partecipazione potenziale della cella più vicino possibile fisiologici potenziale di riposo (V _riposo) al fine di evitare variazioni repentine volta la membrana si rompe. Ad esempio, MSN sono di solito tensione bloccato a -70 o -80 mV (fisiologica V _riposo: -70 a -90 mV).
7. Dopo il gigaseal ha formato, compensare capacitanza veloce e lento manualmente o automaticamente. Se si utilizza un computer controllato comandante amplificatore come Multiclamp comandante, premere 'Auto' per 'Cp Fast' e 'Cp lento ".
8. Se la guarnizione rimane stabile e sopra 1 G (o parenterale meno di 10 - 20 pA per tenere la cella nel potenziale di membrana desiderata), applicare una breve e forte aspirazione attraverso il tubo stesso come in 5.5 a rompere la membrana plasmatica (Figura 2 -3).
   Nota: Questa operazione potrebbe richiedere diversi studi. Un buon rottura della membrana si ottiene wgallina aspirazione viene eseguita abbastanza forte in modo che la membrana rottura non intasare la micropipetta (che può portare ad un aumento della R _s durante la registrazione), ma abbastanza debole per non disegnare in una grande porzione della membrana e la cella.
9. Dopo aver raggiunto una cellula intera configurazione di successo, controllare regolarmente la posizione micropipetta per valutare e correggere la deriva significativo in quanto può portare alla perdita della patch. Drift ampiezza può variare in funzione di diversi fattori, ad esempio, la qualità dell'installazione rig e forze di trazione sul headstage. Idealmente, la deriva dovrebbe essere quasi inesistente.
10. Passando alla modalità "Cell" nel test a membrana, visualizzare diversi parametri della cella come _R, R _s e C _p. Monitorare questi parametri durante la registrazione.
    Nota: Tutti questi parametri possono aiutare a valutare lo stato di salute iniziale delle cellule e tipi di cellule (sezione vedere "prova a membrana", punto 4).
11. Una volta esimoe sopra passaggi sono stati completati, rimane in modalità di tensione-clamp per misurare le correnti (ad esempio, EPSCs, IPSCs), o passare alla modalità corrente-clamp se la pianificazione per misurare variazioni del potenziale di membrana (ad esempio, del potenziale d'azione di tiro). Per questi ultimi, iniettare corrente positiva o negativa per tenere la cella nel potenziale di membrana desiderata (per eseguire questa operazione, fare riferimento all'amplificatore guida manuale).

Risultati

Temperatura, un fattore che è facilmente controllato dallo sperimentatore, influenza le proprietà biofisiche di canali ionici e recettori, e quindi la forma d'onda delle correnti post-sinaptiche (PSC) (EPSC e iPSCs) e la capacità dei neuroni di suscitare picchi. Figura 3 la figura 4 mostra l'effetto della temperatura sulla neuronale e la pendenza della EPSCs evocati (eEPSCs) rispettivamente. Il pattern di cottura (Figura 3)

Discussione

Questo protocollo descrive la procedura di base per l'esecuzione di cellule intere esperimenti di patch-clamp su neuroni in fettine di cervello. Tuttavia, la complessità, il potenziale e la sensibilità di questa tecnica non possono essere completamente descritti in questo articolo. Qui, abbiamo cercato di delineare i passaggi più elementari e sottolineare parametri importanti che devono essere controllati per ottenere registrazioni cellule intere di successo e rigorose. Per ulteriori apprendimento teorico, molti ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolated pulse stimulus generator	A.M.P.I	Master-8
Isolation unit (ISO-Flex)	A.M.P.I	ISO-Flex
Computer controlled Amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
Digital Acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1500
Microscope	Olympus	BX-51
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200
Chamber and in-line Heater	Warner Instruments	TC-344B
Vibratome Slicer	Leica	VT1000 S
Micropipette Puller	Narishige	PC-10
Imaging Camera	Q Imaging	QIClick-F-M-12
Narishige pipette puller PC-10	Narishige	PC-10
Glass capillaries	WPI	TW150F-3
Slice hold-down (harp)	Warner Instruments	64-0255
Slice Chamber	Warner Instruments	RC-26
Nonmetallic syringe needle	World Precision Instruments	MF28G67-5
Syringe filters	Nalgene	176-0045
Glue Gun	Home Depot	various
Gas dispersion tube	Ace Glass Inc.	various
Decapitation scissors	Home Depot	100649198
Scalpel Handle #3	World Precision Instruments	500236
Small straight sharp tips scissors	World Precision Instruments	14218
Vessel canulation forceps	World Precision Instruments	500453
Curved hemostatic forceps	World Precision Instruments	501288
Economy Tweezers #3	World Precision Instruments	501976-6
Spatula	Fisher Scientific	14357Q
Scooping spatula	Fisher Scientific	14-357Q
Petri dish	Fisher Scientific	08-747B
Filter paper	Lab Depot	CFP1-110
Solutions
Cs-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm)
D-gluconic acid 50%	Sigma Aldrich/various	G1951
Cesium-OH (CsOH) 50%	Sigma Aldrich/various	232041
NaCl, 2.8 mM	Sigma Aldrich/various	S7653
HEPES, 20 mM	Sigma Aldrich/various	H3375
EGTA, 0.4 mM	Sigma Aldrich/various	E4378
tetraethylammonium-Cl, 5 mM	Sigma Aldrich/various	T2265
Na2GTP, 0.3 mM	Sigma Aldrich/various	G8877
MgATP, 2 mM	Sigma Aldrich/various	A9187
K-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm)
K D-gluconate, 120 mM	Sigma Aldrich/various	G4500
KCl, 20 mM	Sigma Aldrich/various	P3911
HEPES, 10 mM	Sigma Aldrich/various	H3375
EGTA, 0.2 mM	Sigma Aldrich/various	E4378
MgCl2	Sigma Aldrich/various	M8266
Na2GTP, 0.3 mM	Sigma Aldrich/various	G8877
MgATP, 2 mM	Sigma Aldrich/various	A9187
Standard artificial cerebrospinal fluid (ACSF, osmolarity ≈ 300-310 mOsm)
KCl, 2.5 mM	Sigma Aldrich/various	P3911
NaCl, 119 mM	Sigma Aldrich/various	S7653
NaH2PO4•H2O, 1 mM	Sigma Aldrich/various	S9638
NaHCO3, 26.2 mM	Sigma Aldrich/various	S8875
Glucose, 11 mM	Sigma Aldrich/various	G8270
MgSO4-7H2O, 1.3 mM	Sigma Aldrich/various	230391
CaCl2-2H2O, 2.5 mM	Sigma Aldrich/various	C3881
Additional compounds used for solutions preparation
KOH	various
Kynurenic acid	Sigma Aldrich/various	K3375