הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

Summary

פרוטוקול זה מתאר צעדים פרוצדורליים בסיסיים לביצוע הקלטות תיקון- clamp כל תא. טכניקה זו מאפשרת חקר ההתנהגות החשמלית של נוירונים, וכאשר ביצע פרוסות המוח, מאפשר הערכה של פונקציות עצביים שונים מתא עצב שעדיין משולבים מעגלים במוח השתמרות טוב יחסית.

Abstract

הקלטה כל תא מהדק תיקון היא טכניקה אלקטרו המאפשרת חקר את התכונות החשמליות של חלק ניכר של הנוירון. בתצורה זו, את micropipette נמצא בקשר הדוק עם קרום התא, אשר מונע דליפה נוכחית ובכך מספק מדידות זרם יוניות מדויקות יותר מאשר שיטת הקלטת אלקטרודה חד התאית השתמשה בעבר. קלאסי, הקלטה כל תא יכול להתבצע על נוירונים בסוגים שונים של ההכנות, כולל דגמים תרבית תאים, נוירונים ניתק, נוירונים פרוסות המוח, בבעלי חיים שלמים בהרדמה או ער. לסיכום, טכניקה זו תרמה מאוד להבנת מאפייני biophysical פסיביים ואקטיביים של תאים להתרגש. יתרון עיקרי של שיטה זו הוא בכך שהוא מספק מידע על איך מניפולציות ספציפיות (למשל, תרופתית, הנסיין נגרמת פלסטיות) רשאיות לשנות פונקציות עצביות ספציפיות או גhannels בזמן אמת. בנוסף, פתיחה משמעותית של קרום הפלזמה מאפשרת פתרון פיפטה הפנימי לפזר בחופשיות לתוך הציטופלסמה, מתן אמצעים לתרופות מציגות, למשל, אגוניסטים או אנטגוניסטים של חלבונים תאיים ספציפיים, מניפולצית מטרות אלה מבלי לשנות את תפקידיהן תאי שכנים. מאמר זה יתמקד הקלטה כל התא מבוצע על נוירונים פרוסות מוח, הכנה כי יש את היתרון של קלטת הנוירונים מעגלים עצביים במוח השתמרות טובה יחסית, כלומר, בהקשר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. בפרט, כאשר הוא משולב עם פרמקולוגיה מתאים, טכניקה זו היא כלי רב עצמה המאפשר זיהוי של neuroadaptations הספציפי שאירע לאחר כל סוג של חוויות, כגון למידה, חשיפה לתרופות של התעללות, ומתח. לסיכום, כל תא הקלטות תיקון- clamp פרוסות המוח לספק אמצעים למדוד כהכנה vivo לשעבר שינויים ארוכי טווחבפונקציות עצביות שהתפתח חיות ערות ללא פגע.

Introduction

טכניקת תיקון- clamp, טכניקת אלקטרו אשר פותחה בסוף שנתי ה -1970 ^1,2, היא כלי עיקרי ללימוד פונקציות ערוץ יון בודדים או מספר רבות של רקמת חיה. בין תצורות תיקון השונות שניתן להשיג, כל תא הקלטות תיקון- clamp לאפשר בחקר ההתנהגות החשמלית של חלק ניכר של הנוירון. קלאסי, טכניקה זו מבוצעת במבחנה או על פרוסות המוח, נוירונים ניתק טרי, או על מודלים תרבית תאים ^3. כאשר מבוצע על נוירונים פרוסות המוח, טכניקה זו מציגה מספר יתרונות. בפרט: (i) נוירונים נרשמים מעגלים במוח נשמרו יחסית כי במידה מסוימת, ולעומת הכנות תרבית תאים, לספק סביבה כי היא פיזיולוגית ³ רלוונטית. זה מאפשר לכיד מוקדם, או אפילו ניטור בזמן אמת, אירועים תאיים ומולקולריים שמופעלים על ידי כל סוג של pharmacolog החריפהמניפולציות iCal - החלטה זמנית כי לא יכול להיות מושגת באמצעות קלסי בתנאי vivo; (ii) יכולת לזהות באופן ויזואלי איזורים במוח אצל פרוסות מוח מאפשרת סגולי תיכון אזורי ³ הם באזור המוח למד נוירונים ספציפיים כשהם מבטאים סמני ניאון; (iii) גישה למרחב התאי של התא על ידי פתיחת חלק ניכר של קרום הפלזמה (בניגוד ניקוב הקרום עם micropipette חדה להקלטות תאיות) ^4. לעומת זאת, זה מאפשר את התוכן או הריכוז של יונים ספציפיים להלחין הפתרון הפנימי להיות שונה כל כך מטרות מולקולריות או מנגנונים תאיים ניתן ללמוד בתנאים שונים. לדוגמה, על הקמת תצורה כל תא, כל סוכן תרופתי ספציפי (למשל, אנטגוניסטים) כי אחד יכול להוסיף את micropipette הקלטה (פיפטה תיקון) פתרון יהיה מפוזר ישירות לתוך הציטופלסמה ולפעול על putat שלהive מטרות תאיות מבלי לשנות את פונקצית יעד תאי שכנים. בנוסף, לעומת הקלטת micropipette חדה, הפתיחה הגדולה בקצה האלקטרודה מהדק תיקון מספקת התנגדות נמוכה, פחות רעש מתחרות, ולכן גישת חשמל טובה יותר לחלק הפנימי של התא ^4. עם זאת, יש לציין כי הפתח הגדול בקצה פיפטה עלול להוביל דיאליזת תא, ובכך אובדן המנגנון מולקולרי תאי שעשויה להיות קריטי עבור הביטוי של התופעות הביולוגיות שאינן תחת ^5,6 מחקר. במקרה זה, הקלטות אלקטרודה חד עשויות להיות מתאימות יותר. סוג זה של הקלטות דורש micropipettes עם נקבוביות כי הוא הרבה יותר מאלו המשמשים להקלטות כל תא, ובכך למנוע את רוב חילוף היונים בין שטח תאיים הפתרון פיפטה הפנימי.

כל צורה של ניסיון (אקוטי או כרוני), כולל לימוד ^7-10, חשיפה לתרופות של התעללות ^11,12, מתח ^13,14, וכו ', יכול לשנות היבטים שונים של תפקוד עצבי באזורי מוח ספציפיים. בגלל שינויים אלה לעתים קרובות דורשים זמן לפתח (שעות עד ימים), כל תא הקלטות פרוסות מוח מחיות שעברו חוויה ספציפית מאפשרות לחוקרים לזהות את השינויים האלה. בעיקרון, רב (אם לא כל) רכיבים להשתתף פונקציות עצביות (למשל, תעלות יונים המופעל ליגנד, תעלות יונים מגודרות מתח, מובילי הנוירוטרנסמיטר), ובכך מוח מעגל פעילות והתנהגות, ניתן לשנות על ידי ניסיון (ניסיון תלוי פלסטיות) ^10,15-17. ברמה העצבית, פעילות במעגל המוח עולה מן האינטראקציות מתמידות בין הסינפטי (למשל, העברת גלוטמט) וגורם רגישות הסלולר מהותית (למשל, תעלות יונים הדנדריטים-axosomato: נתרן, Na ^+; אשלגן, K ^+; וסידן, Ca ^{2 +} ). בתנאים ספציפיים באמצעות וולדואר התא תיקון- clamp טכניקות אלקטרו, שינויי אות שמקורם במיוחד משינויים הרגישים מהותי לעומת הסינפטי יכול להיות מבודד.

ברוב המקרים, רגישות הסינפטי נבחנת באמצעות טכניקת מתח- clamp כל התא. מצב הקלטה זה מאפשר מדידה של זרמי יון [למשל, בתיווכו של קולטני חומצת α-אמינו-3-הידרוקסי-5-מתיל-4-isoxazolepropionic ( קולטני AMPA) ואת הקולטנים חומצה N-Methyl-D-אספרטית (קולטני NMDA)] דרך הממברנה פלזמה העצבית תוך כדי לחיצה על פוטנציאל הממברנה במתח סט. הנה, הנסיינים להשתמש בפתרונות micropipette פנימיים המכילים צזיום (Cs ^+), חוסם רחב של K ⁺ ערוצים (גורמים רגישים מהותיים מפתח). עם הקמתה של תצורה כל תא, דיפוזיה של Cs ⁺ בחלל תאי תחסום K ⁺ ערוצים, ובכך תאפשר גם מהדק שטח יעיל יחסית וטרוםלפרוק השפעת הגורמים רגישים מהותיים על מדידות אחרות. סוגיות שטח מהדק, כלומר, קושי מתח- clamp התא כולו, להתעורר בעת הקלטת תאים בצורה סדירה (למשל, נוירונים), ובמיוחד נוירונים עם הדנדריטים עצומים ומורכב סוכת ^18,19. כיוון שבקרות גרועות מהדק מתח סומטיים מתח בעץ הדנדריטים של נוירונים, היבטים שונים של אותות חשמליים הדנדריטים נחקרים מעוותים באופן מרחק תלויה הדנדריטים. בשילוב עם כלים תרופתיים כגון (חומצת גמא-aminobutyric, GABA _{אנטגוניסט} לקולטן) picrotoxin או חומצת kynurenic (חוסם רחב של קולטני גלוטמט) מומסים הפתרון התאי (נוזל מלאכותי שדרת Cerebro, ACSF), טכניקה זו מאפשרת המדידה של גלוטמט receptor- ו GABA _A R בתיווך זרמים בהתאמה.

לעומת זאת, רגישות מהותית בדרך כלל נבחנת במצב הקלטה הנוכחית מהדקת.בניגוד הקלטת מתח- clamp, מצב הקלטה זו מאפשר המדידה של וריאציות פוטנציאלי קרום המושרים על ידי זרמי יון זורמים דרך קרום התא העצבי. בדרך כלל, שינוי ב רגישות מהותית נבחן באמצעות שינויי יכולת נוירונים כדי ליצור פוטנציאל פעולה, מחייב הוא Na ⁺ ו- K ⁺ ערוצים. לכן, בעת ביצוע הקלטות מהדק הנוכחי, micropipettes מלא פתרון פנימי המכיל K ⁺ במקום Cs ^+. בשילוב עם סוכנים תרופתיים החוסמות גלוטמט GABA _A זרמי קולטן בתיווך מומס ACSF, תכנון הניסוי הזה מאפשר מדידת התרומה של גורמים פנימיים (למשל, K ⁺ ערוצים) כדי ירי עצבי מבלי מזוהם שינויים פוטנציאליים רגיש הסינפטי גורמים.

מאמר זה יתאר את השלבים פרוצדורליים צורך בסיסי to (i) להכין פרוסות מוח בריאות; (Ii) להשיג תצורת כל תא, וכן (iii) לפקח פרמטרים בסיסיים להעריך הסינפטי רגיש מהותי.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדי UT Southwestern ולשימוש, נבחרו כדי למזער מתח, אי נוחות, ואת הכאב שחווה חיות הניסוי.

1. פתרונות

הערה: כן micropipette פתרונות פנימיים מראש. לרוב מטרות בסיסיות ניסיון, שני סוגים של פתרונות צריכים להספיק: Cs ⁺ מבוסס ו- K ⁺ פתרונות מבוססים.

1. השתמש Cs ⁺ פתרונות מבוססים (למשל, פתרון גלוקונאט Cs ^+, ראה חומרים) עבור ניסויי מהדק מתח. כן ב RT.
   1. הכן 117 מ"מ פתרון Cs-Gluconate ידי ערבוב 4.62 גרם חומצה D-gluconic (~ 3.696 מ"ל) עם 3.54 גרם CsOH (~ 2.01 מ"ל).
   2. הוסף DDH ₂ O ל 90 מ"ל ולתת לו לאזן במשך 30 דקות.
   3. מוסיפים את החומרים מוצק (20 מ"מ HEPES = 0.476 גרם; 0.4 מ"מ EGTA = 15.2 מ"ג; 2.8 מ"מ NaCl = 16.4 מ"ג; 5 מ"מ tetraethylammonium (TEAכלוריד) = 83 מ"ג).
   4. הוסף DDH ₂ O ל ~ 97 מ"ל.
   5. התאם את ה- pH של התמיסה עם 50% CsOH 7.2 - 7.3.
   6. בדוק osmolarity ונכון במידת הצורך עם DDH ₂ O.
      הערה: טווח טוב הוא ~ 280 - 285 mOsm. osmolarity אופטימלית צריך להיות 15 - 20 mOsm מתחת osmolarity של ACSF סטנדרטי (בדרך כלל 300 - 310 mOsm, 300 mOsm במעבדה שלנו). Osmolarity עשוי להשתנות תלוי פתרונות יצירות ספציפיות.
   7. Aliquot 1,000 μl ולאחסן ב -20 ° C או מתחת.
   8. הכן, aliquot, להקפיא, ולהוסיף ATP / GTP לפתרון הפנימי ביום ההקלטה.
      1. להוסיף ATP 64.63 מ"ג עד 10 מ"ג GTP ו להתמוסס 637.11 μl של DDH ₂ O.
      2. כן 10 aliquots μl ולאחסן ב -20 ° C או מתחת. מערבבים כל aliquot 100x עם 1,000 μl של פתרון פנימי ביום הניסוי. לאחר ATP / GTP מתווסף הפתרון הפנימי, לשמור אותו על קרח כדי למנוע ATP / GTP degradatiעַל.
2. השתמש K ⁺ פתרונות מבוססים (למשל, פתרון K-Gluconate, ראה חומרים) עבור שני ניסויים שוטפים ומתח מהדק כאשר K ⁺ conductances להישאר פונקציונלי כך ירי עצבי ניתן להעריך. כן ב RT.
   1. לשקול את כל החומרים על פי ההיקף הסופי הרצוי. להכנת 90 מ"ל של תמיסת, 120 מ"מ K-Gluconate = 2.81 גרם; 20 מ"מ KCl = 0.149 גרם; 10 HEPES מ"מ = 0.238 גרם; 0.2 מ"מ EGTA = 0.008 גרם; 2 מ"מ MgCl ₂ = 0.021 _גרם.
   2. השתמש מספיק DDH ₂ O להגיע 90% מנפח הפתרון הסופי. כך תוכל להבטיח שכל מספיק מקום נותר pH וכוונון osmolarity.
   3. לאחר הוספת ערבוב את כל המרכיבים, לוודא הפתרון ברור לפני מדידת pH.
   4. תוך ערבוב הפתרון הזמן, להתאים את ה- pH ל -7.2 - 7.3 באמצעות הידרוקסיד ⁺ K (KOH).
   5. לאחר התאמת ה- pH, השתמש osmometer והמודעהosmolarity רק 280 - 285 mOsm.
      הערה: osmolarity אופטימלית צריך להיות 15 - 20 mOsm מתחת osmolarity של ACSF סטנדרטי (בדרך כלל 300 - 310 mOsm, 300 mOsm במעבדה שלנו). Osmolarity עשוי להשתנות תלוי פתרונות יצירות ספציפיות.
   6. Aliquot 1,000 μl ולאחסן ב -20 ° C או מתחת.
   7. כן, aliquot, להקפיא, ולהוסיף ATP / GTP לפתרון הפנימי ביום ההקלטה (ראה שלב 1.1.8).
3. כן 1 ליטר של ACSF הסטנדרטי (ראה חומרים).
   הערה: אנו משתמשים המתכון הזה במעבדה שלנו בעת הקלטה נוירונים קוצני בינוני (MSNs) פרוסות מוח, לעומת זאת, מתכונים עשויים להיות שונים בין מעבדות, ולכן, אנו ממליצים הנסיין להשתמש מתכון המשמש באופן שיגרתי בעת הקלטת האזור במוח של עניין .
4. הכן את ACSF דיסקציה (פתרון חיתוך, ~ 125 מ"ל הערה:. נפח מדויק יהיה תלוי בגודל של החדר חיתוך כפי שהוא אמור לחלוטין להטביע את המוח) לשימושצעדים 2.2 - 2.8.
   1. הכן 5 מ"מ חומצה kynurenic (לחסום תהליכים excitotoxic הנגרמת קולטן הגלוטמט) בתקן ACSF ב נפח מספיק כדי להטביע את המוח במהלך חיתוך. השתמש sonicator לעזור לפזר את חומצת kynurenic.
      הערה: אורכו של sonication עשוי להשתנות תלוי נפח וכמות מוצקי הפתרון. הפתרונים חייבים להיות ברורים עד סוף התהליך (בסביבות 1 - 2 הדקות בתנאים שלנו).
   2. להתקרר בזמן מבעבע עם 95% O _2, 5% גז CO ₂ בתוך דלי קרח עד הטמפרטורה מגיעה ל 2 - 0. ° C.
5. כן ACSF להקלטה.
   1. קח 1 L לסטנדרטי ACSF (או מה שנשאר מהפתרון המוכן בשלב 1.3) שאליו סוכנים תרופתיים מתאימים ניתן להוסיף בהתאם בניסויים מתוכננים.
      1. לדוגמה, להוסיף 100 picrotoxin מיקרומטר בעת ההקלטה זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים או פוטנציאלים (EPSCs או EPSPs), אנטגוניסטים לקולטן גלוטמט (kynurenic חומצה, 2 מ"מ; או שילוב של מיקרומטר 50 D-APV עם CNQX 10 מיקרומטר) בעת הקלטת זרמי מעכבות פוסט סינפטי או פוטנציאלים (iPSCs או IPSPs), ושניהם אנטגוניסטים לקולטן picrotoxin ו גלוטמט כאשר העריך ירי עצבי בהעדר כל השפעה מאירועים הסינפטי.

2. הכנת Slice

1. לבנות או להשיג בחדר התאוששות פרוסה.
   הערה: העיקרון במשך בחדר התאוששות הוא פשוט וניתן לייצרם במעבדה (איור 1). בקצרה, החדר הוא כלי קיבול שבו סל מוכנס להחזיק את פרוסות המוח ברמה נמוכה מן השטח של ACSF. חברות מדעיות רבות גם למכור תאי התאוששות פרוסה.
   1. כדוגמה, להשיג ארבע טבעות (4 - 6 מ"מ גבוה) (איור 1 א ', מבט מהצד; B, מבט מלמעלה) על ידי חיתוך מזרק 30 סמ"ק. לאחר מכן, דבק נמתח רשתות (למשל, לחתוך מתוך הוז ניילוןה) לצד אחד של הטבעות כדי להחזיק את פרוסות המוח (איור 1B) ודבק הטבעות יחד.
      הערה: ניתן להשתמש אקדח דבק.
   2. לאחר ארבע טבעות מודבקים, מדביקים קיר פלסטיק בצורת טרפז שווה שוקיים מעוקל לשתי הטבעות (איור 1 א 'וב') להסיט בועות חמצן מן פרוסות מחלים המוח (איור 1 ג ו-ד). כפי שניתן לראות בתרשים 1D, הכנס מערכת לשדר חמצן (כאן, צינור פיזור גז) באותו צד כשהחומות פלסטיק.
2. לפני החיתוך, oxygenate (95% O _2/5% CO ₂₎ להתקרר פתרון החיתוך (ראה שלב 1.4) כדי 2 - 0 ° C.
3. ממלא את חדר ההתאוששות המותאמת אישית עם ACSF הסטנדרטי ב RT. ודא כי ACSF הוא מחומצן היטב (20 - 30 דקות, זמן עשויות להשתנות בהתאם להיקף הקאמרי) לפני צבת פרוסות בחדר ההתאוששות. ודא כי בועות גז לא באות con הישירטאקט בפרוסות או לשבש אותם.
4. קו במגש קרח vibratome עם קרח וממלא במים קרים כך שליש וחצי של חדר החיתוך הוא שקוע. בזהירות במקום מערכת אספקת חמצן (למשל, אבן לשדר גז) בדיקת טמפרטורה בתא החיתוך כך לא פריט מפריע לתנועת הלהב או מניפולציה פרוסה.
5. מכין את השטח לנתיחה וכלים הדרושים להפקת המוח לנתח באזור המוח הרצוי.
   ההערה: לנתיחה המדויקת בצעה יהיה תלויים באזור המסוים במוח למדה מבנים מוחיים שונים כמו יחייבו משסף מישורים שונים (למשל, עטרה, sagittal, או חתכים אופקיים.).
   1. מניח את הכלים הבאים על underpad: מספרי עריפת ראש, אזמל, מספרי קצה חד ישרים קטנים, מלקחי cannulation הכלי (או כל כלי כירורגי עם קצה רחב, כגון rongeurs, אשר מתאים יותר עבור גולגלות עכברוש), מלקחיים עוצרים דמום מעוקלים, TWeezers, מרית, וגרף מרית, מסנן נייר, צלחת פטרי, סכין גילוח קצה יחיד, ודבק cyanoacrylate.
6. כאשר הטמפרטורה מגיעה ל 2 - 0. ° C, להעביר את פתרון החיתוך לתא חיתוך (מגש החיץ).
7. להרדים את העכבר בתא התייבשות באמצעות isoflurane. הסכום המדויק עשוי להשתנות בהתאם לגודל של החדר משמש, אבל עבור בכלוב קופסת נעליים קטנה להשתמש כמה טיפות (~ 3 - 4). השאר את העכבר בכלוב עד נייח שניתנו (לא מגיב כמו מרקם גירויים; כ -15 שניות בתנאים המתוארים כאן). בצע בדיקות זנב ורגל קמצוץ כדי להבטיח את בעל החיים הוא בהרדמה עמוקה, ואז לערוף לפני הלב מפסיק לפעום (משפר כדאיות התא).
   הערה: עם הצדקה מתאימה, מעבדות כמה לקבל אישור לבצע עריפת ראש חיה כדי לצמצם ככל תהליכים excitotoxic האפשר ולשפר כדאיות התא.
8. בצע את הנתיחה.
   הערה: המוח חייב להיותחילוץ במהירות (<45 שניות).
   1. באמצעות האזמל לחתוך את העור השטחי על גבי הגולגולת מ מקורי כדי זנב.
   2. מקלפים את הקרקפת בכל צד של הראש.
   3. בעזרת מספרי קצה חד ישרים קטנים, לחתוך את צלחת interparietal לאורך תפר lambdoid להסיר את המוח הקטן. הסר את עצם העורף.
   4. שימוש באותו מספריים, לחתוך את תפר sagittal.
   5. החלק את מלקחיים כלי cannulation (או rongeurs אם שבירת גולגולת עכברוש) מתחת לכל עצמות הקודקודית ומשוך כדי לחשוף את המוח.
   6. באמצעות מלקחיים עוצר דמום מעוקל, לצבוט את העצמות הקדמיות כדי לשבור אותם, ולאחר מכן להשתמש בפינצטה או מלקחיים כלי cannulation להסיר את עצמות שבורות. גזור להסיר את דורה מאטר בעדינות ככל האפשר כפי שהוא יכול להפריע לנתיחה.
   7. חלק את המרית מתחת המוח ומשוך בעדינות את המוח מתוך הגולגולת למקם אותו בתא החיתוך (מגש חיץ) מלא בעבר עם ACSF קר כקרח. בואו המוחלהתקרר במשך 1 - 2 דקות.
   8. הכן את הפלטפורמה לנתיחה על ידי מילוי צלחת פטרי עם קרח וקצת מים קרח לאפשר מגע פנים גדול יותר, לכסות אותו עם המכסה ומניחים על נייר פילטר על גבי. להרטיב את נייר הסינון עם ACSF קר.
   9. ברגע שהמוח הוא התקרר, למקם את המוח על צלחת פטרי מלאות קרח, ובמהירות לבצע דיסקציה המתאים לקבלת המטוס הרצוי של חיתוך.
   10. כדי לקבל פרוסות sagittal המכיל את הגרעין הנסמך (NAC), השתמש סכין גילוח קצה יחיד לחתוך ולהסיר את גבשושיות חוש הריח ואת המוח הקטן אם הם עדיין יהיו קיימים. לאחר מכן, לבצע חתך sagittal של 2 - 3 מ"מימ מהגבול הלטרלי של האונה הימנית כדי לקבל את המשטח השטוח כי יהיה דבוק על הדגימה מחזיקה את הצלחת (ראה שלב 2.8.11).
       הערה: חיתוך רק 2 - 3 מ"מ מהגבול הלטרלי של האונה יאפשר גביית פרוסות המכיל את NAC משני חצאי. דיסקציה המתאים יהיה תלויעל האזור במוח שנחקר. הנה, לנתיחה מבוצעת כך נוירונים NAC ניתן להקליט פרוסות מוח sagittal.
   11. במהירות דבק (באמצעות דבק cyanoacrylate מוחל על צלחת מחזיק הדגימה) פני שטח החתך השטוחים של המוח לצלחת פי המטוס הרצוי של חיתוך. כדי לקבל פרוסות מוח sagittal ראו שלב 2.8.10.
   12. מייד למקום ולאבטח את הדגימה מחזיקה צלחת בתא החיתוך כך שהמוח הוא פרוס rostro-caudally (עבור בטיחות, להגדיר את מחזיק הלהב רק כאשר צלחת הדגימה מאובטחת).
   13. הגדר את vibratome עם פרמטרי חיתוך מתאימים (פרמטרים המשמשים במעבדה עבור vibratome המוזכרים חומרים: מהירות 3 - 4, רטט 9-10, ו פרוסים בעובי 250 מיקרומטר).
   14. לאחר החיתוך, השתמש פיפטה העברה פלסטיק גזוז להעביר את פרוסות המוח אל חדר ההתאוששות (ב RT) (ראה שלב 2.3). זמן ההחלמה עשוי להשתנות בהתאם לסוג עצבי הוא הנחקרת(בדרך כלל 30 - 90 דקות).

3. הקלטה Micropipettes והכנה Rig

1. עיין הנחיות הספציפיות של המדריך של המשתמש חולץ להשיג את מאפייני micropipette הרצויים.
   הערה: MSNs, אנו משתמשים במגוון התנגדות פיפטה של ​​3.2-4.0 MΩ.
2. חמצן ACSF ולהתאים את זרימת 2 מ"ל / דקה. ACSF אבק באמצעות קווי משאבת ואקום או peristaltic מותקנים במתקן.
3. הפעל את בקר דוד זלוף ולהתאים את הגדרות טמפרטורה על מנת לקבל את הטמפרטורה הרצויה (למשל, 31.8 - 32.2 מעלות צלזיוס).
   הערה: יציבות טמפרטורה תלויה בכך היא ברמת ACSF קבועה ומהירות זרימה מתמדת בתא. מאז כמה תכונות biophysical של נוירונים (למשל, התנגדות קלט, R _i, המכונה גם התנגדות הממברנה, R _{מ ')} הם רגישים לטמפרטורה, שמירה על טמפרטורה יציבה חשובה.
4. הפעל computer שבשליטת מגבר, מצלמה, micromanipulator, ואור רקע מיקרוסקופ. אם ביצוע ניסוי הדורש גירוי חשמלי של רקמות, להפעיל בקר הגירוי לבין יחידת בידוד.
   הערה: חלק מהגברים אחרים מייצרים להמליץ ​​על "חימום" לפני השימוש, ולכן מומלץ להתייעץ במדריך עבור הליך ההפעלה המדויק.
5. התחל לכידת מצלמה, רכישת אות ותוכנת מגבר.
6. Slice מיקום ויזואליזציה:
   1. בעזרת פיפטה העברת גזוז-קצה פלסטיק, לצייר בעדינות פרוסה מוח אחד מאולם ההתאוששות.
   2. מניח את פיפטה ההעברה לתא ההקלטה בעדינות לסחוט את הפרוסה מתוך פיפטה על coverslip הרירית התחתון של החדר.
      הערה: כל עוד לא הצפה מתרחשת, היא אינה מזיקה כדי לקבל קצת ACSF מאולם התאוששות שפיכה לאמבטיה.
   3. שימוש במלקחיים כדי לשנות את המיקום של פרוסת so האזור הרצוי יוצב בדיוק במרכז לתא ההקלטה. השתמש בכוח מיקרוסקופ הנמוך (4X) עדשה אובייקטיבית עינית לסיוע מיצוב.
   4. לאחר המיקום הרצוי הושג, להבטיח את המיקום הפרוס המוח עם מטה-חזק פרוסה (מוכר גם בשם "נבל") בחדר.
   5. Switch to מתח גבוה (40X) עדשה אובייקטיבית ומורידים אותה בעדינות עד קשר נוצר עם ACSF בתא.
   6. השתמש בגלגל לכוונון עדין להביא הרקמה אל המוקד. בעוד במגע עם ACSF, לא להשתמש בגלגל התאמה הגס על המיקרוסקופ כמו הורדת העדשה האובייקטיבית יתר על המידה יכולה למחוץ את הפרוסה או אפילו לשבור את התלוש לכסות רירי התחתון של החדר, אשר יכול לגרום ACSF לשפוך על הקבל לפגוע בו.
   7. כאשר הדגש הוא על רמת רקמות, להתבונן תאים באזור הממוקד עבור צורה. תאים מתים ניתנים לזיהוי בקלות על ידי קרום גרעין הפלזמה תפח שלהם (<1E strong> איור). תאים בריאים אמורים להופיע עגולים, דמוי ביצה, או מבנים הומוגנית אליפטי (איור 1E).
   8. חפש תא המטרה. לסמן אותו על מסך המחשב כדי לעזור להנחות את micropipette הקלטה. אם אתה משתמש בתוכנות כגון QCapture, לשרטט ריבוע סביב לתא המטרה על ידי החזקת לחצן הימני של העכבר.
   9. הרם את העדשה האובייקטיבית אז יהיה מספיק מקום בחרוט נוצר על ידי העדשה האובייקטיבית להיות במגע עם ACSF למקום להזיז את micropipette ההקלטה.
7. Micropipette שמת מיצוב
   1. באמצעות מזרק 1 מיליליטר, מחט microsyringe אל מתכתית, ומסנן ייעודי, למלא micropipette עם הפתרון הפנימי שהוכן מראש על פי הניסוי המתוכנן (K ⁺ מבוסס או Cs ⁺ מבוסס הפתרון פנימי, ראה צעדים 1.1., 1.2 , וחומרים עבור רכב). השתמש פתרון מספיק ולכן הפנימיהפתרון בא במגע עם האלקטרודה חוט כסף מצופה כלוריד בתוך בעל micropipette.
      הערה: אלקטרודה חוט הכסף ניתן כלור על ידי השריית אותו אקונומיקת משק בית. triphosphates nucleoside (ATP & GTP) ניתן להוסיף את הפתרון הפנימי לפני השימוש. שמור את המזרק המכיל את הפתרון על קרח כדי למנוע שפלת ATP / GTP.
   2. ודא שאין בועות אוויר בתוך micropipette כפי שהם יכולים לצאת בעוד micropipette הוא ברקמה ולטשטש את הפרוסה.
   3. מניחים את micropipette ב בעל אלקטרודה לכן הפתרון בא במגע עם האלקטרודה חוט מצופה כלוריד כסף.
   4. להדק את המכסה פיפטה כך מכונת הכביסה החרוטה תהווה חותמת סביב micropipette.
   5. החל לחץ חיובי לפני טבילת micropipette ב ACSF כדי למנוע פסולת מלהיכנס פיפטה.
   6. מניחים את headstage במצב נעול (מול תא), ושימוש micromanipulator, guide אותו לכיוון החדר כך שזה בערך מתחת למרכז המטרה השקועה.
   7. בעת הזזת micropipette עם micromanipulator (שקיעה ב- בינוני עד מהיר), השתמש מסך המחשב כדי לאתר את micropipette ולהדריך אותו לכיוון המיקום של התא על ציר XY.
   8. מדוד את התנגדות micropipette ידי החלת צעד מתח (למשל, 4 mV עבור 100 msec), אשר ניתן להשיג באופן ידני או באופן אוטומטי באמצעות תוכנה ספציפית כגון מצב "אמבטיה" אם באמצעות "מבחן ממברנה" בתוכנת Clampex (ראה גם לשלב 4) . כדי לוודא שאין בועות אוויר או חפצים זרים אחרים לחסום את micropipette, להפעיל לחץ חיובי באמצעות מזרק מלא-אוויר (למשל, 30 סמ"ק מזרק) המחובר בעל micropipette עם צינורות פוליאתילן.
   9. לאחר ניקוי micropipette, לבצע מתח היסט להפחית נוכחי פיפטה לאפס, אשר ניתן להשיג באופן ידני או באמצעות תוכנה ספציפית כגון & #39; פיפטה לקזז "על מפקד המגבר מבוקר מחשב.
      הערה: פונקציה זו תפצה על כל מתח הנגרם עקב הבדלים בריכוז שבין האמבטיה ואת פתרונות micropipette (כלומר, פוטנציאל צומת נוזלים ^20).

4. מבחן ממברנה

הערה: שלב זה חל על המגבר המוזכר החומרים.

1. בעת שימוש מפקד מגבר מבוקר מחשב, תמיד להגדיר את זה על מצב מתח- clamp לבצע את הבדיקה הממברנה.
   הערה: כאשר בדיקת קרום מוגדרת במצב "אמבט", המבחן הממברנה מאפשר מדידת התנגדות micropipette וההתנגדות חותם כאשר חותם נוצר.
2. לאחר קרום מקרע (ראה שלב 5.8), לעבור את הבדיקה הממברנה "Cell" במצב כך ההתנגדות הטורית (R _ים) (התנגדות גישה המכונה גם, R _א), R _i ו קיבול הממברנה _(p-ג)ניתן להשיג.

גישת 5. סופים, היווצרות חותמת, וקבלת תצורת Whole-cell

1. באמצעות גלגל להתמקד בסדר, להתחיל להתמקד למטה תוך הפחתת micropipette בהדרגה. תמיד להתמקד הראשון למטה והורד את micropipette עד המטוס של המוקד. פעולה זו תבטיח כי קצה micropipette לא יחדרו בפתאומיות לתוך הפרוסה.
2. כאשר micropipette מגיע על קשר עם פני השטח של הפרוסה, להאט את מהירות micromanipulator למצב בינוני-נמוך.
3. בעדינות להפעיל לחץ קל חיובי עם המזרק מלא-האוויר המחובר לבעל פיפטה כדי לנקות את כל פסולת מדרך הגישה.
4. גישת התא או על ידי לסירוגין עם ידיות בקרת XYZ, או באמצעות פנייה באלכסון (אם מודל micromanipulator מאפשר זאת) שבו שני צירי XZ מוחלפים עם סיבוב ידית ציר Z. השיטה השנייה תמנע דחיסה אנכית של רקמות.
   הערה: כאן, המטרה היאלהתקרב התא על ידי גרימת נזק מינימלי הפרוסה. כאשר micropipette הוא מספיק קרוב לתא גומה מופיעה (א discoloring סבב פני התא נגרם על ידי הלחץ החיובי מיושם באמצעות קצה micropipette) (איור 2).
5. כאשר הגומה מופיעה (איור 2-1), להחיל יניקה חלשה קצרה דרך הצינור מחובר צינור היניקה בעל פיפטה כדי ליצור את החותם (איור 2-2). שמור ניטור במבחן הממברנה.
   הערה: אם חותם חלקית נוצר (<1 GΩ), הזרקת זרמים שליליים ידי מפחית את הפוטנציאל מחזיק (על מפקד המגבר מבוקר מחשב) יכול להקל היווצרות חותמת ולהגיע gigaohms התנגדות ( "חותם gigaohm" או "gigaseal"> 1 - 5 GΩ). ההתנגדות הגבוהה של החותם (> 1 GΩ) תהיה גם זיהום רעש גבול האות רשמה ולתרום היציבות המכאנית שלתיקון.
6. בעוד gigaseal מגבש, השתמש מפקד המגבר מבוקר המחשב להביא את פוטנציאל ההחזקה של התא קרוב ככל האפשר אל פיזיולוגיים נחים _(שאר V) פוטנציאלי כדי למנוע שינויים פתאומיים פעם הממברנה מהקרע. לדוגמה, MSNs הם בדרך כלל-הידק מתח ב -70 או -80 mV _(שאר V פיזיולוגיים: -70 ל -90 mV).
7. לאחר gigaseal יצרה, לפצות על קיבול מהיר ואיטי באופן ידני או אוטומטי. אם אתה משתמש מפקד מגבר מבוקר מחשב כגון מפקד Multiclamp, לחץ על 'אוטומטי' עבור 'Cp המהיר' ו 'Cp איטי ".
8. אם את החותם נותר יציב מעל 1 GΩ (או הזרקה פחות מ 10 - 20 רשות לקיים את התא על פוטנציאל הממברנה הרצוי), להחיל קצר יניקה חזקה דרך הצינור אותו כמו 5.5 כדי לקרוע את קרום התא (איור 2 -3).
   הערה: פעולה זו עשויה להימשך מספר ניסויים. קרע בקרום טוב מושגת wיניקה תרנגולת מבוצעת מספיק חזק, כך הממברנה מקרע לא לסתום את micropipette (דבר שעלול להוביל לעלייה R _ים בעת ההקלטה), אבל חלש מספיק כדי לא למשוך חלק גדול של הממברנה או התא.
9. לאחר שהשיג תצורה כל תא מוצלחת, באופן קבוע לפקח על מיקום micropipette להעריך נכון עבור להיסחף משמעותי מכיוון שהוא עלול להוביל לאובדן של התיקון. משרעת סחף עשויה להשתנות בהתאם למספר גורמים, למשל, את איכות התקנת האסדה וכוחות משייכים headstage. באופן אידיאלי, להיסחף צריך להיות כמעט אפסי.
10. על ידי מעבר "Cell" במצב במבחן קרום, להציג פרמטרים שונים של התא כגון R _i, R _s ו- C _p. צג הפרמטרים הללו במהלך ההקלטה.
    הערה: כל הפרמטרים האלה יכולים לעזור להעריך את מצב הבריאות הראשוני של תאים סוגי תאים (ראה "מבחן ממברנה" סעיף, שלב 4).
11. לאחר הדואר הפעולות הנ"ל הושלמו, להישאר במצב מתח- clamp למדוד זרמים (למשל, EPSCs, iPSCs), או לעבור למצב הנוכחי מהדק במידה ואתם מתכננים למדוד משינוי מתח הממברנה (למשל, ירי פוטנציאל פעולה). עבור אלה האחרונים, להזריק או זרם חיובי או שלילי להחזיק בתא במתח הממברנה הרצוי (כדי לבצע שלב זה, עיין מגבר מדריך ידני).

תוצאות

טמפרטורה, גורם נשלטת בקלות על ידי הנסיין, משפיע על מאפייני biophysical של תעלות יונים ו קולטנים, ובכך צורת הגל של זרמים פוסט-סינפטי (PSCs) (EPSC ו iPSCs) ואת היכולת של נוירונים לעורר קוצים. איור 3 ואיור 4 מראים את השפעת הטמפרטורה על הירי העצבי ושיפ...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את ההליך הבסיסי ביצוע ניסויים תיקון- clamp כל תא על נוירונים פרוסות המוח. עם זאת, המורכבות, הפוטנציאל והרגישות של הטכניקה הזו לא יכולים להיות מתוארת בצורה מושלמת במאמר זה. הנה, יש לנו ניסינו להתוות את הצעדים הבסיסיים ביותר מדגיש פרמטרים חשובים חייבים לה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolated pulse stimulus generator	A.M.P.I	Master-8
Isolation unit (ISO-Flex)	A.M.P.I	ISO-Flex
Computer controlled Amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
Digital Acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1500
Microscope	Olympus	BX-51
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200
Chamber and in-line Heater	Warner Instruments	TC-344B
Vibratome Slicer	Leica	VT1000 S
Micropipette Puller	Narishige	PC-10
Imaging Camera	Q Imaging	QIClick-F-M-12
Narishige pipette puller PC-10	Narishige	PC-10
Glass capillaries	WPI	TW150F-3
Slice hold-down (harp)	Warner Instruments	64-0255
Slice Chamber	Warner Instruments	RC-26
Nonmetallic syringe needle	World Precision Instruments	MF28G67-5
Syringe filters	Nalgene	176-0045
Glue Gun	Home Depot	various
Gas dispersion tube	Ace Glass Inc.	various
Decapitation scissors	Home Depot	100649198
Scalpel Handle #3	World Precision Instruments	500236
Small straight sharp tips scissors	World Precision Instruments	14218
Vessel canulation forceps	World Precision Instruments	500453
Curved hemostatic forceps	World Precision Instruments	501288
Economy Tweezers #3	World Precision Instruments	501976-6
Spatula	Fisher Scientific	14357Q
Scooping spatula	Fisher Scientific	14-357Q
Petri dish	Fisher Scientific	08-747B
Filter paper	Lab Depot	CFP1-110
Solutions
Cs-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm)
D-gluconic acid 50%	Sigma Aldrich/various	G1951
Cesium-OH (CsOH) 50%	Sigma Aldrich/various	232041
NaCl, 2.8 mM	Sigma Aldrich/various	S7653
HEPES, 20 mM	Sigma Aldrich/various	H3375
EGTA, 0.4 mM	Sigma Aldrich/various	E4378
tetraethylammonium-Cl, 5 mM	Sigma Aldrich/various	T2265
Na2GTP, 0.3 mM	Sigma Aldrich/various	G8877
MgATP, 2 mM	Sigma Aldrich/various	A9187
K-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm)
K D-gluconate, 120 mM	Sigma Aldrich/various	G4500
KCl, 20 mM	Sigma Aldrich/various	P3911
HEPES, 10 mM	Sigma Aldrich/various	H3375
EGTA, 0.2 mM	Sigma Aldrich/various	E4378
MgCl2	Sigma Aldrich/various	M8266
Na2GTP, 0.3 mM	Sigma Aldrich/various	G8877
MgATP, 2 mM	Sigma Aldrich/various	A9187
Standard artificial cerebrospinal fluid (ACSF, osmolarity ≈ 300-310 mOsm)
KCl, 2.5 mM	Sigma Aldrich/various	P3911
NaCl, 119 mM	Sigma Aldrich/various	S7653
NaH2PO4•H2O, 1 mM	Sigma Aldrich/various	S9638
NaHCO3, 26.2 mM	Sigma Aldrich/various	S8875
Glucose, 11 mM	Sigma Aldrich/various	G8270
MgSO4-7H2O, 1.3 mM	Sigma Aldrich/various	230391
CaCl2-2H2O, 2.5 mM	Sigma Aldrich/various	C3881
Additional compounds used for solutions preparation
KOH	various
Kynurenic acid	Sigma Aldrich/various	K3375