La purificación del ARN intracelularmente Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; En los macrófagos

Resumen

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

Resumen

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells ^1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

Introducción

Patógenos bacterianos intracelulares ─ bacterias causantes de enfermedades infecciosas y capaz de crecer y reproducirse dentro de las células del huésped humano ─ son un importante problema de salud en todo el mundo ^5. Para invadir y replicarse dentro de una célula de mamífero, patógenos intracelulares han adquirido sofisticados mecanismos de virulencia y factores. Aunque estos mecanismos son fundamentales para la capacidad de causar una enfermedad, se sabe poco acerca de su regulación y dinámica. Desde los perfiles de expresión de genes de bacterias cultivadas en medio líquido no reflejan el entorno real dentro de células huésped, hay una necesidad creciente de transcriptoma análisis de bacterias cultivadas en sus nichos intracelulares. Estos análisis permitirán al desciframiento de adaptaciones específicas bacterianas provocadas por el anfitrión y le ayudará a identificar nuevas dianas para el diseño terapéutico. El análisis del transcriptoma de bacterias que crecen de forma intracelular es muy difícil, puesto que superan en número a ARN de mamífero ARN bacteriano por lopor lo menos diez veces. En este manuscrito, se describe un método experimental para aislar el ARN bacteriano de Listeria monocytogenes bacterias que crecen dentro de las células de macrófagos murinos. El ARN extraído se puede utilizar para estudiar las adaptaciones intracelulares y mecanismos de virulencia de las bacterias patógenas por diversas técnicas de análisis de la transcripción, tales como RT-PCR, el ARN-Seq, microarrays y otras tecnologías basadas en hibridación.

L. monocytogenes es el agente causante de la listeriosis en humanos, una enfermedad con manifestaciones clínicas dirigidas principalmente a los individuos inmunocomprometidos, ancianos y mujeres embarazadas ^6. Eso es un patógeno intracelular facultativo Gram-positiva que invade una amplia gama de células de mamíferos que se han utilizado durante décadas como modelo en las interacciones huésped-patógeno estudia ^7. Tras la invasión, que reside inicialmente en una vacuola o fagosoma (en el caso de las células fagocíticas), de la que debe escapar en tque acogerá citosol de la célula con el fin de replicar. Varios factores de virulencia han demostrado mediar en el proceso de escape, principalmente la hemolisina de formación de poros, listeriolisina O (LLO) y dos fosfolipasas adicionales ^8. En el citosol las bacterias utilizan el anfitrión maquinaria polimerización de la actina para impulsarse en los filamentos de actina dentro de la célula y propagarse de célula a célula (Figura 1). Todos los principales factores de virulencia de L. monocytogenes involucrados en la invasión, la supervivencia intracelular y la replicación, son activados por el regulador de la transcripción de virulencia principal, PrfA. ^8-10.

En la última década, varios estudios realizados por nosotros y otros han métodos para el análisis del transcriptoma de bacterias que crecen de forma intracelular aplicado con éxito dentro de las células anfitrionas ^2,11-15. Dos enfoques principales se utilizan para separar el ARN bacteriano de host-RNA que se basan en: 1) el enriquecimiento selectivo de ARN bacteriana y 2) el aislamiento de ARN por difelisis celular rential. El primer enfoque se basa en la hibridación de sustracción de extractos de ARN total de las moléculas de ARN de mamífero (por ejemplo, utilizando kits disponibles en el comercio) o la captura selectiva de secuencias transcritas bacterianas (escoceses) ^11. El segundo enfoque se basa en la lisis diferencial de bacterias y células huésped, en el que se lisan las células huésped mientras que las células bacterianas se mantienen intactos. Las células bacterianas se separan a continuación a partir del lisado de la célula huésped, generalmente por centrifugación, y el ARN se extrae usando técnicas estándar. El principal problema con este enfoque es que, junto con las bacterias intactas, también se aíslan células huésped núcleos, por lo tanto las preparaciones de ARN todavía contienen ARN de mamífero. Una forma de superar este problema es separar bacterias intactas de células huésped núcleos utilizando centrifugación diferencial, aunque este procedimiento por lo general toma tiempo el aumento de la preocupación de los cambios en el perfil de la expresión génica durante la extracción. En este artículo presentamos un ba mejorada y rápidaprotocolo de extracción de ARN cteria, que se basa en el enfoque de lisis diferencial de células. En primer lugar, L. monocytogenes células de macrófagos infectados se lisan con agua fría. A continuación, los núcleos de los macrófagos se eliminan mediante una breve centrifugación y bacterias intactas se recogen rápidamente en los filtros, de la que el ARN se aísla usando caliente extracción con fenol-SDS de los ácidos nucleicos bacterianos.

Protocolo

Nota: Durante todo el experimento, las células de macrófagos se incubaron a 37 ° C en un incubador de _CO2 de aire forzado 5% y sacados de la incubadora sólo para las manipulaciones experimentales, que se llevan a cabo en una cabina de seguridad biológica de Clase II. Trabajar con L. bacterias monocytogenes es de acuerdo al nivel de seguridad biológica 2 regulaciones.

1. Preparación de células y la infección bacteriana (Día 1 y 2)

1. Día 1
   1. Células de semillas 2,0 x 10 ⁷ de médula ósea derivadas de macrófagos (BMDM) en un plato de 145 mm en 30 ml BMDM + medios de Pen-Strep (Tabla 2). Seed 3 placas para cada cepa bacteriana a ser analizados. Incubar toda la noche a 37 ° C en una incubadora de _CO2 de aire forzado 5%.
   2. Iniciar un cultivo bacteriano durante la noche de tipo salvaje (WT) L. monocytogenes 10403S cepa en 10 ml de medio de cerebro y corazón de infusión (BHI), a 30 ° C en un incubador estándar. Coloque los tubos de cultivo inclinados sin agitación. Nota:Estas condiciones de crecimiento hasta de regular la expresión de los genes flagelos, que promueve la infección eficiente.
2. Dia 2
   1. Medio Pre-caliente BMDM (sin antibióticos Pen-Strep) (Tabla 2) y solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 37 ° C.
   2. Lavar monocapa de macrófagos dos veces con 25 ml de PBS precalentado para eliminar los antibióticos. Añadir 30 ml de medio fresco BMDM.
   3. Lavar 1,5 ml de cultivo bacteriano durante la noche con PBS por centrifugación las bacterias a> 14.000 xg durante 1 min, desechar el sobrenadante, y resuspendiendo las bacterias suavemente en 1,5 ml de PBS mediante pipeteo. Repetir dos veces.
   4. Infectar a los macrófagos cada placa con 0,5 ml de un cultivo de una noche de lava de tipo salvaje de L. monocytogenes. Si el uso de múltiples placas, infectar a cada placa de 15 minutos de diferencia. Este intervalo de tiempo permitirá la cosecha de cada placa individualmente al final de la infección.
      Nota: La multiplicidad de infección (MOI) se ensaya mediante siembra de diluciones en series de cultivo bacteriano usado para la infección en placas de BHI agar y contando las unidades formadoras de colonias (CFU) después de 24 hr de incubación de las placas a 37 ° C. Usando 0,5 ml de WT L. monocytogenes cepa 10403S resultados en una MOI de ~ 100 (100 UFC de bacterias por célula macrófagos). Al analizar los mutantes bacterianos defectuosos en el crecimiento intracelular, un MOI más alto debe ser considerado.
   5. Después de 0,5 horas de incubación a 37 ° C, se lavan las células infectadas dos veces con PBS, para eliminar las bacterias no unidas, y añadir 30 ml pre-calentado medio BMDM. bacterias adheridas internalicen durante el próximo 0,5 horas.
   6. A 1 h después de la infección, añadir 30 l de gentamicina (1: 1.000 para alcanzar una concentración final de 50 mg / ml) para matar las bacterias extracelulares.
   7. Montar el aparato de filtración mediante la colocación de una cabeza de filtro en un matraz de recogida de líquido con un puerto de salida de vacío. A continuación, coloque un filtro (0,45 micras) en una cabeza de filtro, seguido de un embudo de cilindro y asegurar las diferentes partes con un metal clámpara. Preparar agua libre de RNasa helada.
   8. A las 6 horas después de la infección, las bacterias de la cosecha de las células infectadas de la siguiente manera. Tratar a cada placa individual.
      Nota: Por lo general, L. monocytogenes completa 1-log de ​​crecimiento durante 6 h de infección en células de macrófagos. incubaciones más largas podrían dar lugar a la proliferación bacteriana y la muerte celular de los macrófagos, mientras que los períodos de incubación más cortos podrían resultar en cargas bacterianas considerablemente inferiores. El MOI y el tiempo de la infección pueden ser modificados para alcanzar condiciones óptimas.
      1. Lavar las células infectadas con PBS una vez. Añadir 20 ml de agua libre de RNasa enfriado con hielo para lisar células macrófagos. El uso de un rascador de células, raspar las células de la placa rápidamente, pero con cuidado.
      2. Recoger las células lisadas a un tubo cónico de 50 ml. Vortex durante 30 segundos. Centrifugar a 800 xg durante 3 min a 4 ° C.
      3. Pasar el sobrenadante a través del aparato de filtro usando un sistema de vacío. Usando las pinzas, el rollo de filtro y rápidamente la transferencia a un 15 ml CONItubo de cal. Snap-congelar los tubos con los filtros en nitrógeno líquido.
      4. Montar el aparato de filtración con un filtro nuevo para la siguiente muestra, como se describe en 1.2.7.
      5. Almacenar los filtros congelados a -80 ° C para el día siguiente. Como alternativa, proceder directamente a la extracción de ácidos nucleicos.

2. Ácidos nucleicos extracción (día 3)

Nota: Realice todas las manipulaciones con las soluciones de fenol y cloroformo en una campana de humos.

1. Preparar una mezcla 1: 1 de fenol acidificado: cloroformo, 400 l para cada muestra. Mezclar en tubos separados, y luego retirar la capa acuosa resultante por aspiración. Añadir 40 l de 10% SDS.
2. Descongelar los tubos que contienen filtros-en hielo para mantenerlos fríos. A cada tubo que contiene filtro de añadir 650 l de acetato-EDTA (AE) (Tabla 2).
3. Realice los siguientes pasos lo más rápido posible.
   1. Vigorosamente vórtice el tubo que contiene el filtro paraque el filtro bate a la periferia del tubo y el tampón se lava completamente el filtro. Siempre mantenga el tubo frío colocándolo de nuevo en hielo. Nota: puede ser necesario vórtice, además, el tubo mientras invertida para lavar completamente las bacterias fuera del filtro.
   2. Repita este procedimiento para todos los tubos. Puede ser útil para hacer girar hacia abajo la suspensión en breve (1 min a 120 xg) al final del proceso.
4. Transferir el tampón de bacterias que contienen a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene el SDS y la mezcla de fenol / cloroformo (como se preparó en 2,1). Repita este procedimiento para todos los tubos. Puede que sea necesario para hacer girar los tubos de filtro que contiene (1 min a 120 xg) de nuevo para obtener tampón residual del filtro.
5. Coloque todos los tubos de 1,5 ml en un dispositivo de vórtice de tubos múltiples, y vórtice a velocidad máxima durante 10 min.
6. Incubar los tubos en un bloque de calor C 65 ° durante 10 min. Centrifugar a máxima velocidad (> 14.000 xg) durante 5 min.
7. La transferencia de la capa acuosa (aproximadamente 400 l) de cada uno tUbe a un nuevo tubo de 1,5 ml que contiene 40 l de acetato de sodio 3 M (pH 5,2) y 1,0 ml de etanol al 100%. Vortex cada tubo a fondo.
   Nota: El glucógeno se puede añadir en esta etapa para mejorar la visualización de la pastilla precipitado.
8. Incubar las muestras a -80 ° C durante 1 hr. Alternativamente, se incuban las muestras a -20 ° C durante la noche. A continuación, centrifugar las muestras a 4 ° C durante 20 min a la velocidad máxima (> 14.000 xg).
9. aspirar cuidadosamente el etanol (capa superior) de cada tubo. Añadir etanol 500 l frío 70% a cada muestra y mezclar bien. Centrifugar a 4 ° C durante 20 min a la velocidad máxima (> 1 4.000 xg).
10. aspirar cuidadosamente el etanol a partir de cada tubo. Secar las muestras durante aproximadamente 2 minutos usando un evaporador al vacío sin calor. No sobre-secar las muestras.
11. Añadir 25 l de agua libre de RNasa a cada muestra. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min. Con cuidado vórtice y spin-down.
12. Medir la concentración de ARN en tél muestras usando un microtomo UV-Vis. Esperar a extraer aproximadamente 0,5 - 1 mg de ácidos nucleicos por placa.
    Nota: Técnico repeticiones se pueden combinar en esta etapa.

3. El tratamiento de DNasa

1. Configurar la reacción de acuerdo con la Tabla 1 en un tubo de microcentrífuga. Incubar a 37 ° C durante 45 min. Añadir 450 l de agua libre de RNasa y 500 l de fenol-cloroformo-IAA mezcla (Tabla 2), fases separadas por centrifugación durante 2 minutos a velocidad máxima (> 14.000 xg).
2. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo y añadir 500 l de cloroformo-IAA mezcla (Tabla 2), mezclar y fases separadas por centrifugación de 2 minutos a velocidad máxima (> 14.000 xg).
3. Transferir la fase acuosa a un nuevo tubo y añadir 1 ml de etanol y 50 l de acetato de sodio 3 M (pH 5,2). Vórtice.
   Nota: El glucógeno se puede añadir en esta etapa para mejorar la visualización de la pastilla precipitado.
4. incubar durante 1 hora a -80 ° C. Alternativamente, se incuban las muestras a -20 ° C durante la noche. Centrifugar a 4 ° C durante 20 min a velocidad máxima.
5. aspirar cuidadosamente el etanol a partir de cada tubo. Añadir etanol 500 l frío 70% a cada muestra y mezclar bien. Centrifugar a 4 ° C durante 20 min a velocidad máxima. aspirar cuidadosamente el etanol a partir de cada tubo.
6. Secar las muestras durante aproximadamente 2 minutos usando un evaporador al vacío sin calor. No sobre-secar las muestras.
7. Añadir 12 l de agua libre de RNasa, se incuba durante 2 minutos a temperatura ambiente, vórtice, y spin-down. Las muestras contienen ARN purificado, los mantienen en hielo. Como alternativa, disolver ARN en RNasa libre de H ₂ O con EDTA 0,1 mM o tampón TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM).
8. Medir las concentraciones de ARN usando un microtomo UV-Vis. Esperar ~ 100 ng de RNA por muestra (si se combinan técnica repeticiones).
   Nota: el ARN extraído de acuerdo con este protocolo es adecuado for análisis de transcripción génica mediante múltiples técnicas. Por lo general, empleamos el análisis RT-qPCR para estudiar L. monocytogenes la transcripción de genes durante la infección de las células de macrófagos ^1-4.

Resultados

El sistema modelo se muestra en la Figura 1 e incluye células de macrófagos infectados con L. monocytogenes bacterias, que se replican en el citoplasma de los macrófagos. La figura 2 representa el esquema experimental. La figura 3 representa los resultados típicos de tales análisis de RT-qPCR de genes de virulencia durante WT L. monocytogenes en los macrófagos en comparación con el crecimiento en medio rico labor...

Discusión

El protocolo descrito aquí representa un método optimizado para el aislamiento de ARN bacteriana de L. monocytogenes bacterias que crecen intracelularmente en células de macrófagos. Este protocolo se basa en la lisis diferencial de células e incluye dos pasos principales para el enriquecimiento de ARN bacteriano: sedimentación núcleos de macrófagos utilizando centrifugación y una rápida acumulación de bacterias por filtración. Estos pasos son seguidos por un procedimiento de extracción de ARN está...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Listeria monocytogenes 10403S			20
Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice			21
H2O, RNAse free	Thermo Scientific	10977-015	DEPC-treated water can be used
DMEM	Gibco	41965039
Glutamine	Gibco	25030081
Sodium pyruvate	Gibco	11360-088
β-Mercaptoethanol	Gibco	31350010
Pen/Strep	Gibco	15140-122
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397
FBS	Gibco	10270106
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Brain heart infusion (BHI)	Merckmillipore	1104930500
Phenol saturated pH 4.3	Fisher	BP1751I-400
Chloroform	Fisher	BP1145-1
Iso-amyl alcohol	Sigma-Aldrich	W205702
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	W302406
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
DNaseI	Fermentas	EN0521
SDS 10%	Sigma-Aldrich	L4522
Ethanol absolute	Merck Millipore	1070174000
37 °C, 5% CO2 forced-air incubator	Thermo Scientific	Model 3111
Cell scrapers	Nunc	179693
Kontes glass holder for 45 mm filters	Fisher	K953755-0045
MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm	Merck Millipore	HAWP04700
SpeedVac system	Thermo Scientific	SPD131DDA
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	Model G560E
NanoDrop	Thermo Scientific
145 mm cell culture dishes	Greiner	639 160
1.7 ml tubes, RNase-free	Axygen	MCT-175-C
30 °C incubator	Thermo Scientific
65 °C heat block	Thermo Scientific
4 °C table centrifuge	Eppendorf	5417R
Sterile pipettes, 25 ml	Greiner
Falcon tubes, 50 ml	Greiner
Liquid nitrogen