RNA Purificazione da nella cellula Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In macrofagi

Riepilogo

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

Abstract

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells ^1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

Introduzione

Intracellulari batteri patogeni ─ batteri che causano malattie infettive e in grado di crescere e riprodursi all'interno delle cellule di ospiti umani ─ sono un grave problema di salute in tutto il mondo ^5. Per invadere e replicarsi all'interno di una cellula di mammifero, patogeni intracellulari hanno acquisito sofisticati meccanismi di virulenza e fattori. Mentre questi meccanismi sono fondamentali per la capacità di causare una malattia, si sa poco circa la loro regolazione e la dinamica. Dal momento che i profili di espressione genica di batteri coltivate in mezzi liquidi non riflettono l'ambiente reale all'interno di cellule ospiti, vi è una crescente necessità per le analisi del trascrittoma di batteri coltivati ​​nelle loro nicchie intracellulari. Tali analisi consentiranno la decifrazione di specifici adattamenti batteriche innescati dal conduttore e contribuiranno a identificare nuovi bersagli terapeutici per la progettazione. analisi del trascrittoma di batteri intracellulare coltivate è molto impegnativo dal momento che l'RNA dei mammiferi più numerosi RNA batterica da ATalmeno dieci volte. In questo manoscritto, descriviamo un metodo sperimentale per isolare l'RNA batterica da Listeria monocytogenes batteri che crescono all'interno delle cellule macrofagi murini. L'RNA estratto può essere usato per studiare adattamenti intracellulari e meccanismi di virulenza dei batteri patogeni di varie tecniche di analisi della trascrizione, come RT-PCR, RNA-Seq, microarray e altre tecnologie di ibridazione base.

L. monocytogenes è l'agente eziologico della listeriosi negli esseri umani, una malattia con manifestazioni cliniche di targeting principalmente individui immunocompromessi, anziani e donne incinte ^6. esso è un agente patogeno intracellulare facoltativo Gram-positivi che invade una vasta gamma di cellule di mammiferi che sono stati utilizzati per decenni come un modello in interazioni ospite-patogeno studi ^7. Dopo l'invasione, risiede inizialmente in un vacuolo o phagosome (nel caso delle cellule fagocitiche), da cui deve fuggire in tegli ospitare citoplasma delle cellule al fine di replicare. Diversi fattori di virulenza hanno dimostrato di mediare il processo di fuga, soprattutto l'emolisina pore-forming, listeriolysin O (LLO) e due fosfolipasi ulteriori ^8. Nel citosol i batteri utilizzano macchinari polimerizzazione ospitante per spingersi sui filamenti di actina all'interno della cellula e di diffondersi da cellula a cellula (Figura 1). Tutti i principali fattori di virulenza di L. monocytogenes coinvolti nella invasione, la sopravvivenza intracellulare e la replica, vengono attivati ​​dal regolatore di trascrizione maestro virulenza, PrfA. ^8-10.

Negli ultimi dieci anni, diversi studi condotti da noi e altri hanno applicato con successo metodi per l'analisi del trascrittoma di batteri intracellulare cresciuti all'interno delle cellule ospiti ^2,11-15. Due approcci principali sono utilizzati per separare l'RNA batterica da host-RNA che si basano su: 1) l'arricchimento selettivo di RNA batterico e 2) l'isolamento di RNA da diffelisi cellulare renziale. Il primo approccio si basa sulla ibridazione sottrattiva del totale estratti di RNA di molecole di RNA di mammiferi (ad esempio utilizzando kit disponibili in commercio) o la cattura selettiva di sequenze di trascritti batteriche (Scozia) ^11. Il secondo approccio si basa sulla lisi differenziale di batteri e cellule ospiti, in cui le cellule ospiti vengono lisate mentre le cellule batteriche rimangono intatte. Le cellule batteriche sono poi separati dal lisato cellula ospite, di solito per centrifugazione, e l'RNA è estratto utilizzando tecniche standard. Il problema principale di questo approccio è che, insieme con i batteri intatti, cellule ospiti nuclei sono anche isolati, in tal modo i preparativi di RNA contengono ancora RNA mammiferi. Un modo per superare questo problema è quello di separare i batteri intatti da cellule ospiti nuclei mediante centrifugazione differenziale, se questa procedura richiede solitamente tempo aumentare la preoccupazione delle variazioni del profilo di espressione genica durante l'estrazione. In questo articolo presentiamo un ba migliore e rapidaprotocollo di estrazione cteria RNA, che si basa sulla differenza di cellule approccio lisi. Primo, L. monocytogenes infetti macrofagi sono lisate con acqua fredda. Successivamente, i nuclei dei macrofagi vengono rimossi da una breve centrifugazione e batteri intatti sono rapidamente raccolti su filtri, da cui l'RNA è isolato tramite hot estrazione con fenolo-SDS degli acidi nucleici batterici.

Protocollo

Nota: Durante l'intero esperimento, macrofagi vengono incubate a 37 ° C in un incubatore CO ₂ ad aria forzata 5% e il prelievo delle dell'incubatore solo per manipolazioni sperimentali, che vengono eseguite in una cappa di sicurezza biologica Classe II. Lavorare con L. batteri monocytogenes è in base al livello di sicurezza biologica 2 regolamenti.

1. Preparazione e cellulare infezione batterica (giorno 1 e 2)

1. Giorno 1
   1. Cellule Seed 2.0 x 10 ⁷ midollo osseo derivate macrofagi (BMDM) su un piatto 145 millimetri in 30 ml BMDM + Pen-Strep supporti (Tabella 2). Seed 3 piastre per ogni ceppo batterico da analizzare. Incubare per una notte a 37 ° C in un incubatore CO ₂ ad aria forzata 5%.
   2. Avviare una coltura batterica durante la notte di wild-type (WT) L. monocytogenes 10403S deformazione in 10 ml di terreno, cuore, cervello infusione (BHI), a 30 ° C in un incubatore standard. tubi porre la cultura inclinati senza agitare. Nota:Queste condizioni di crescita up-regolare l'espressione dei geni flagelli, che promuove l'infezione efficiente.
2. Giorno 2
   1. Medio Pre-caldo BMDM (senza antibiotici Pen-Strep) (Tabella 2) e tampone fosfato salino (PBS) a 37 ° C.
   2. Lavare monostrato macrofagi due volte con 25 ml di PBS preriscaldata per rimuovere antibiotici. Aggiungere 30 ml di media BMDM fresco.
   3. Lavare 1,5 ml di coltura batterica durante la notte con PBS mediante centrifugazione dei batteri a> 14000 g per 1 minuto, scartando il surnatante, e risospendere i batteri delicatamente in 1,5 ml di PBS pipettando. Ripetere due volte.
   4. Infettare ogni piatto macrofagi con 0,5 ml di una cultura durante la notte lavata di wild-type L. monocytogenes. Se si utilizzano più piatti, infettare ogni piatto 15 min a parte. Questo intervallo di tempo consentirà raccolta ciascuna piastra singolarmente al termine dell'infezione.
      Nota: la molteplicità di infezione (MOI) è dosati con placcatura diluizione in series di coltura batterica usati per l'infezione su piastre di agar BHI e contando unità formanti colonie (CFU) dopo 24 ore di incubazione delle piastre a 37 ° C. Utilizzando 0,5 ml di WT L. monocytogenes ceppo risultati 10403S in un MOI di ~ 100 (100 CFU di batteri per cella macrofagi). Nell'analizzare mutanti batterici difettosi in crescita intracellulare, un più alto MOI dovrebbe essere considerato.
   5. Dopo 0,5 ore di incubazione a 37 ° C, lavare le cellule infette due volte con PBS per rimuovere i batteri senza legami, e aggiungere 30 ml di pre-riscaldato medie BMDM. batteri attaccati saranno interiorizzare durante il prossimo 0,5 ore.
   6. A 1 dall'infezione hr, aggiungere 30 ml di gentamicina (1: 1.000 a raggiungere una concentrazione finale di 50 mg / ml) per uccidere i batteri extracellulari.
   7. Montare l'apparecchiatura filtrante inserendo una testa filtro su un pallone di liquido di raccolta con una luce di uscita del vuoto. Poi posto un filtro (0,45 micron) su una testa del filtro, seguito da un imbuto cilindro e fissare le varie parti con un metallo clampada. Preparare acqua priva di RNasi ghiacciata.
   8. Al 6 ore dopo l'infezione, batteri raccolto dalle cellule infette come segue. Trattare ogni piatto individualmente.
      Nota: Di solito, L. monocytogenes completa 1-log di crescita durante 6 ore di infezione in cellule macrofagi. incubazione più lunghi potrebbero causare la proliferazione batterica e la morte cellulare dei macrofagi, mentre periodi di incubazione più brevi potrebbero causare cariche batteriche sensibilmente inferiori. Il MOI e momento dell'infezione può essere modificato per raggiungere le condizioni ottimali.
      1. Lavare le cellule infettate con PBS una volta. Aggiungere 20 ml di acqua priva di RNasi ghiacciata per la lisi delle cellule macrofagi. Utilizzando un raschietto cellulare, raschiare le cellule dalla piastra rapidamente, ma con attenzione.
      2. Raccogliere cellule lisate in una provetta conica da 50 ml. Vortex per 30 sec. Centrifugare a 800 xg per 3 min a 4 ° C.
      3. Passare il surnatante attraverso l'apparecchio filtro con un sistema a vuoto. Usando le pinzette, rotolare il filtro e rapidamente trasferirla a 15 ml CONItubo cal. Snap-congelare i tubi con i filtri in azoto liquido.
      4. Montare l'apparecchiatura di filtrazione con un nuovo filtro per il campione successivo, come descritto in 1.2.7.
      5. Conservare i filtri congelati a -80 ° C per il giorno successivo. In alternativa, procedere direttamente alla estrazione degli acidi nucleici.

2. Estrazione acidi nucleici (3 ° giorno)

Nota: eseguire tutte le manipolazioni con soluzioni di fenolo e cloroformio in una cappa aspirante.

1. Preparare una 1: 1 miscela di fenolo acidificati: cloroformio, 400 microlitri per ogni campione. Mescolare in tubi separati, e quindi ritirare la fase acquosa risultante per aspirazione. Aggiungere 40 ml di 10% SDS.
2. Scongelare i tubi del filtro contenente il ghiaccio per tenerli freddo. Per ogni tubo-filtro contenente aggiungere 650 ml di acetato-EDTA (AE) tampone (Tabella 2).
3. Effettuare le seguenti operazioni il più rapidamente possibile.
   1. Vigorosamente vortice la provetta contenente il filtro in modoche il filtro conduce allo periferia del tubo e il buffer lava completamente il filtro. Tenere sempre il freddo tubo ponendolo di nuovo sul ghiaccio. Nota: Potrebbe essere necessario inoltre vortice tubo mentre invertito per lavare completamente i batteri il filtro.
   2. Ripetere l'operazione per tutte le provette. Può essere utile spin-giù la sospensione breve (1 min a 120 xg) alla fine del processo.
4. Trasferire il buffer di batteri contenenti in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente SDS e il mix di fenolo / cloroformio (come preparato in 2.1). Ripetere l'operazione per tutte le provette. Può essere necessario girare i tubi del filtro contenente (1 min a 120 xg) per ottenere tampone residuo dal filtro.
5. Mettere tutti i tubi da 1,5 ml in un dispositivo a vortice multi-tubo, e vortex a pieno ritmo per 10 minuti.
6. Incubare le provette in un blocco di calore a 65 ° C per 10 minuti. Centrifugare alla massima velocità (> 14.000 xg) per 5 min.
7. Trasferire la fase acquosa (circa 400 ml) per ogni tube in una nuova provetta da 1,5 ml contenente 40 ml di 3 M acetato di sodio (pH 5,2) e 1,0 ml di etanolo al 100%. Vortice accuratamente ogni provetta.
   Nota: Glicogeno può essere aggiunto in questa fase per migliorare la visualizzazione della pastiglia precipitato.
8. Incubare i campioni a -80 ° C per 1 ora. In alternativa, incubare a -20 ° C per una notte. Poi, centrifugare i campioni a 4 ° C per 20 min alla massima velocità (> 14.000 xg).
9. Aspirare con cautela il etanolo (strato superiore) da ogni provetta. Aggiungere 500 ml freddo etanolo al 70% per ogni campione e miscelare accuratamente. Centrifugare a 4 ° C per 20 min alla massima velocità (> 1 4.000 xg).
10. Aspirare con cautela il etanolo da ogni provetta. Essiccare i campioni per circa 2 minuti usando un evaporatore sotto vuoto senza riscaldamento. Non over-asciugare i campioni.
11. Aggiungere acqua priva di RNasi 25 microlitri di ciascun campione. Incubare a temperatura ambiente per 20 min. Attenzione vortice e spin-down.
12. Misurare la concentrazione di RNA in tegli campioni utilizzando un microvolumi UV-Vis spettrofotometro. Aspettatevi di estrarre circa 0,5-1 mg di acidi nucleici per piastra.
    Nota: repliche tecniche possono essere combinati in questa fase.

3. Trattamento DNase

1. Impostare la reazione in base alla tabella 1 in una provetta per microcentrifuga. Incubare a 37 ° C per 45 min. Aggiungere 450 acqua priva di RNasi ml e 500 ml di fenolo-cloroformio-IAA mix (Tabella 2), fasi separate mediante centrifugazione per 2 minuti a velocità massima (> 14000 g).
2. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta e aggiungere 500 microlitri cloroformio-IAA mix (Tabella 2), vortice e fasi separate da 2 min centrifugazione a velocità massima (> 14.000 xg).
3. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta e aggiungere 1 ml di etanolo e 50 ml di 3 M acetato di sodio (pH 5,2). Vortice.
   Nota: Glicogeno può essere aggiunto in questa fase per migliorare la visualizzazione della pastiglia precipitato.
4. incubare per 1 ora a -80 ° C. In alternativa, incubare a -20 ° C per una notte. Centrifugare a 4 ° C per 20 min a velocità massima.
5. Aspirare con cautela il etanolo da ogni provetta. Aggiungere 500 ml freddo etanolo al 70% per ogni campione e miscelare accuratamente. Centrifugare a 4 ° C per 20 min alla massima velocità. Aspirare con cautela il etanolo da ogni provetta.
6. Essiccare i campioni per circa 2 minuti usando un evaporatore sotto vuoto senza riscaldamento. Non over-asciugare i campioni.
7. Aggiungere 12 ml di acqua RNase-free, incubare per 2 minuti a temperatura ambiente, vortice e spin-down. I campioni contengono RNA purificato, tenerli su ghiaccio. In alternativa, sciogliere RNA in RNase-free H ₂ O con 0,1 mM EDTA o tampone TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA).
8. Misurare le concentrazioni di RNA utilizzando un microvolumi UV-Vis spettrofotometro. Aspettatevi ~ 100 ng di RNA per campione (se replicati tecniche sono combinate).
   Nota: RNA estratto in base a questo protocollo è adatto foR analisi del gene trascrizione con tecniche multiple. Noi di solito utilizziamo l'analisi RT-qPCR per studiare L. monocytogenes trascrizione genica durante l'infezione delle cellule macrofagi ^1-4.

Risultati

Il sistema modello è illustrato nella figura 1 e comprende cellule di macrofagi infettati con L. monocytogenes batteri, che replicano nel citoplasma dei macrofagi. La figura 2 rappresenta lo schema sperimentale. Figura 3 rappresenta i risultati tipici di tale analisi RT-qPCR di geni di virulenza durante WT L. monocytogenes crescita nei macrofagi in confronto alla crescita ricca di laboratorio medio BHI. I risultati mos...

Discussione

Il protocollo qui descritto rappresenta un metodo ottimizzato per l'isolamento di RNA batterico da L. monocytogenes batteri che crescono intracellulare nelle cellule macrofagi. Questo protocollo si basa su lisi differenziale cellulare e comprende due fasi principali per l'arricchimento di RNA batterico: macrofago sedimentazione nuclei mediante centrifugazione ed un rapido accumulo di batteri per filtrazione. Questi passaggi sono seguiti da un procedimento di estrazione di RNA standard. Mentre questo pro...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Listeria monocytogenes 10403S			20
Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice			21
H2O, RNAse free	Thermo Scientific	10977-015	DEPC-treated water can be used
DMEM	Gibco	41965039
Glutamine	Gibco	25030081
Sodium pyruvate	Gibco	11360-088
β-Mercaptoethanol	Gibco	31350010
Pen/Strep	Gibco	15140-122
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397
FBS	Gibco	10270106
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Brain heart infusion (BHI)	Merckmillipore	1104930500
Phenol saturated pH 4.3	Fisher	BP1751I-400
Chloroform	Fisher	BP1145-1
Iso-amyl alcohol	Sigma-Aldrich	W205702
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	W302406
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
DNaseI	Fermentas	EN0521
SDS 10%	Sigma-Aldrich	L4522
Ethanol absolute	Merck Millipore	1070174000
37 °C, 5% CO2 forced-air incubator	Thermo Scientific	Model 3111
Cell scrapers	Nunc	179693
Kontes glass holder for 45 mm filters	Fisher	K953755-0045
MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm	Merck Millipore	HAWP04700
SpeedVac system	Thermo Scientific	SPD131DDA
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	Model G560E
NanoDrop	Thermo Scientific
145 mm cell culture dishes	Greiner	639 160
1.7 ml tubes, RNase-free	Axygen	MCT-175-C
30 °C incubator	Thermo Scientific
65 °C heat block	Thermo Scientific
4 °C table centrifuge	Eppendorf	5417R
Sterile pipettes, 25 ml	Greiner
Falcon tubes, 50 ml	Greiner
Liquid nitrogen