RNA Arıtma Hücre içindeki dan Yetiştirilen<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Makrofaj

Özet

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

Özet

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells ^1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

Giriş

Hücre içi bakteriyel patojenler ─ bulaşıcı hastalıklar ve büyüyen insan konak iç hücrelerini üretebilen neden olan bakteriler ─ dünya çapında önemli bir sağlık sorunu ⁵ vardır. istila ve bir memeli hücre içinde çoğaltmak için, hücre içi patojenler sofistike virülans mekanizmaları ve faktörleri edindik. bu mekanizmalar bir hastalığa neden yeteneği temel olmakla birlikte, biz onların düzenlenmesi ve dinamikleri hakkında çok az şey biliyoruz. sıvı ortamda yetişen bakteri geni ekspresyonunun konak hücreleri içinde, gerçek bir ortam yansıtamıyacağından, hücre içi niş yetiştirilen bakteri analiz transcriptome için giderek artan bir ihtiyaç vardır. Bu tür analizler ev sahibi tarafından tetiklenen spesifik bakteriyel uyarlamalar deşifre sağlayacak ve tedavi tasarımı için yeni hedefler belirlemeye yardımcı olacaktır. memeli RNA da bakteriyel RNA sayıca üstün beri hücre yetiştirilen bakterilerin Transcriptome analizi son derece zorluen az on kat. Bu yazıda, fare makrofaj hücreleri içinde büyüyen Listeria monocytogenes bakterilerden bakteriyel RNA izole etmek için deneysel bir yöntem açıklanmaktadır. ekstre RNA, hücre içi uyarlama ve RT-PCR, RNA-DİZ, mikrodizi ve diğer melezleştirme tabanlı teknolojiler gibi transkripsiyon analizleri çeşitli tekniklerle, patojenik bakterilerin hastalık oluşturma mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.

L. monocytogenes insanlarda listeriosis etkeni öncelikle immün sistemi baskılanmış bireyler, yaşlılar ve hamile kadınlar ⁶ hedefleyen klinik bulgularla seyreden bir hastalıktır. O ⁷ çalışma evsahibi-patojen etkileşimlerinin bir model olarak yıllardır kullanılmaktadır memeli hücrelerinin geniş bir dizi işgal bir Gram-pozitif fakültatif hücre içi patojendir. istila etmesine, bu t kaçmasına gereken bir vakuol ya da (fagositik hücreler durumunda), bir fagozomun, başlangıçta bulunduğuo çoğaltmak için hücre sitoplazmada ev sahipliği. Muhtelif virülans faktörlerinin çıkış işlemi, temel olarak, gözenek-oluşturucu hemolisin, listeriolisin O (LLO) ve iki ek fosfolipazları ⁸ aracılık ettiği gösterilmiştir. Sitoplazmada bakteriler (Şekil 1) hücre içindeki aktin filamentler kendilerini itmek için ve hücreden hücreye yayılan konak aktin polimerizasyonu makineleri kullanıyoruz. L. Bütün büyük virulans faktörleri işgali, hücre içi yaşam ve çoğaltmaya katılan monocytogenes, ana virülans transkripsiyon regülatör PrfA. ^8-10 aktive edilir.

Son on yılda, çeşitli çalışmalar bize tarafından yürütülen ve diğerleri başarıyla konakçı hücrelere ^2,11-15 içinde hücre yetiştirilen bakterilerin transcriptome analizi için yöntemler uyguladınız. sorumluluk yönün bakteriyel RNA 1) seçici zenginleştirme ve 2) RNA izolasyonu: İki temel yaklaşım dayanmaktadır konak-RNA bakteriyel RNA ayırmak için kullanılırrential hücre parçalama. Birinci yaklaşım (ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak, örneğin), memeli RNA moleküllerinin toplam RNA özleri eksiltici hibridizasyon ve bakteriyel transkribe dizileri (SCOTS) ¹¹ seçmeli tutma dayanır. İkinci yaklaşım, bakteriyel hücreler gibi kalır, ev sahibi hücrelerin lize olan bakteri ve konakçı hücreler, ayırıcı liziz dayanır. Bakteriyel hücreler daha sonra, genellikle santrifüjleme ile konakçı hücre lizatından ayrılır ve RNA, standart teknikler kullanılarak ekstre edilir. Bu yaklaşımı kullanarak, ana problem, sağlam bakteri konakçı hücreler çekirdekleri de izole ile birlikte, bu şekilde RNA preparatları de memeli RNA içeren bir. Bu sorunun üstesinden gelmenin bir yolu, bu prosedür genellikle çıkarma sırasında gen tanımlama profili değişikliklerin endişesini zaman alır ancak diferansiyel santrifüj kullanılarak konakçı hücreler çekirdeklerden sağlam bakteri ayırmaktır. Bu yazıda gelişmiş ve hızlı ba sunmakHücre diferansiyel parçalama yaklaşıma dayanmaktadır cteria RNA ekstraksiyon protokolü. İlk olarak, L. makrofaj hücreleri enfekte monocytogenes soğuk su ile lize edilmiştir. Daha sonra, makrofaj çekirdekler kısa bir santrifüjleme ile ayrılmış ve sağlam bakteri hızlı, RNA bakteriyel nükleik asitlerin sıcak fenol-SDS ekstraksiyonu kullanılarak izole edilir, filtre üzerinde toplanır.

Protokol

Not: tüm deney sırasında, makrofaj hücreleri,% 5 _CO2 basınçlı hava kuluçka makinesi içinde 37 ° C sıcaklıkta kuluçkaya yatırılır ve yalnızca bir sınıf biyolojik güvenlik kabininde yapıldığı deneysel manipülasyonlar için kuluçka alınır. L. ile çalışma monocytogenes bakteri biyolojik güvenlik seviyesine 2 düzenlemelerine göre olduğunu.

1. Hücre Hazırlama ve bakteri kökenli enfeksiyon (Gün 1 ve 2)

1. 1.gün
   1. 30 mi BMDM + Pen-Strep ortamı (Tablo 2) ve 145 mm tabak Tohum 2.0 x 10 ^7, kemik iliği kaynaklı makrofaj hücreleri (BMDM). Bakteriyel suşların her biri için tohum 3 tabak analiz edilmesi. % 5 _CO2 basınçlı hava kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
   2. Vahşi tip (WT) L. bir gece boyunca bakteri kültürü Başlangıç Standart bir inkübatörde 30 ° C'de, beyin kalp infüzyon (BHI) ortam 10 ml streyn monocytogenes 10403S. Yeri kültür tüpleri sallayarak olmadan eğimli. Not:Bu büyüme koşulları etkili bir şekilde enfeksiyonu teşvik flagella genlerin ekspresyonunu yukarı-regüle.
2. 2. gün
   1. 37 ° C'de ön-Sıcak BMDM (Pen-Strep antibiyotiksiz) ortamı (Tablo 2) ve fosfat tamponlu tuz (PBS).
   2. antibiyotik kaldırmak için önceden ısıtılmış PBS, 25 ml ile iki kez makrofaj tek tabaka yıkayın. 30 ml taze BMDM orta ekleyin.
   3. 1 dakika boyunca> 14,000 xg'de santrifüj bakteri süpernatant atılması ve pipetleme PBS 1.5 ml yavaşça bakteri resuspending PBS ile gece boyunca bakteri kültürü 1.5 mL yıkanır. İki kez tekrarlayın.
   4. Vahşi tip L yıkanmış bir gece boyunca bir kültürü, 0.5 ml her makrofaj plaka Infect monocytogenes. Birden fazla plakaları kullanıyorsanız, ayrı her plaka 15 dakika bulaştırmak. Bu zaman aralığı enfeksiyonu sonunda tek tek her plaka hasat sağlayacaktır.
      Not: enfeksiyon (MOI) seri seyreltme kaplama ile deneye tabi tutulurBakteri kültürünün s, 37 ° C'de plakalar 24 saat inkübe edildikten sonra, BHI agar plakaları ve sayma koloni oluşturan birim (CFU) ile enfeksiyonu için kullanılmıştır. WT L. 0.5 ml kullanılarak monocytogenes ~ 100 bir İçişleri Bakanlığı içinde 10403S sonuçlar (makrofaj hücre başına 100 bakteri CFU) süzün. hücre içi büyüme hatalı bakteriyel mutantlann analiz edildiğinde, daha yüksek bir MOI dikkate alınmalıdır.
   5. 37 ° C'de 0.5 saat inkübe edildikten sonra, serbest bakterileri uzaklaştırmak için PBS ile iki kez enfekte hücreleri yıkayın ve 30 ml önceden ısıtılmış BMDM ortamı ilave edin. Ekli bakteriler sonraki 0.5 saat boyunca içselleştireceklerdir.
   6. hücre-dışı bakterileri öldürmek için: (50 ug / ml bir nihai konsantrasyon elde etmek 1000 1) 1 saat sonra enfeksiyondan, gentamisin 30 ul ekle.
   7. Bir vakum çıkış portu ile bir toplama sıvı şişesi üzerinde bir filtre kafasını koyarak filtre aparatı monte edin. Sonra silindir bir huni tarafından izlenen bir filtre kafasına bir filtre (0.45 um), koyun ve bir metal c farklı bölümlerini sabitleyinlamba. buz soğukluğunda RNaz içermeyen su hazırlayın.
   8. aşağıdaki şekilde enfekte olmuş hücrelerden 6 saat sonrası enfeksiyon, hasat bakterileri. tek tek her plaka davranın.
      Not: Genellikle, L. monocytogenes makrofaj hücrelerinin enfeksiyon 6 saat boyunca büyüme 1-log tamamlar. kısa inkübasyon süreleri önemli ölçüde daha düşük bakteri yüklerini neden olabilir ise uzun inkubasyon, bakteriyel aşırı çoğalma ve makrofajların hücre ölümüne neden olabilir. MOI, enfeksiyon süresi optimal şartlara ulaşmak için değiştirilebilir.
      1. bir kez PBS ile enfekte hücreleri yıkanır. makrofaj hücreleri lize etmek için buz-soğuğu RNaz içermeyen su 20 ml ekleyin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, hızlı ama dikkatli plaka kapalı hücreleri kazıyın.
      2. 50 ml konik tüp lize hücreleri toplamak. 30 saniye vorteksleyin. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 800 x g'de santrifüjleyin.
      3. bir vakum sistemi kullanılarak filtre aparatı ile süpernatant geçirin. coni ml filtre rulo ve hızlı bir şekilde 15 transfer, cımbız kullanarakcal tüp. sıvı azot içinde filtreler ile tüpler Yapış-dondurma.
      4. 1.2.7 de tarif edildiği gibi, aşağıdaki örnek için yeni bir filtre ile filtrasyon aparatı birleştirin.
      5. Bir sonraki gün için -80 ° C'de donduruldu filtreleri saklayın. Seçenek olarak ise, bir nükleik asit çıkarma, doğrudan devam edin.

2. Nükleik Asitler Ekstraksiyon (Gün 3)

Not: Bir çeker ocak içinde, fenol ve kloroform çözümler Bütün müdahaleler gerçekleştirin.

1. 1 asidifiye fenol karışımı: kloroform, her bir örnek için 400 ul 1 hazırlayın. Ayrı tüplerde karıştırın ve daha sonra aspirasyon ile ortaya çıkan sulu tabaka çekilme. % 10 SDS, 40 ul ekle.
2. Soğuk tutmak için buz üzerinde filtre içeren tüpler çözülme. Her bir filtre ihtiva eden bir tüpe asetat-EDTA (AE) tampon maddesi (Tablo 2) 650 ul ilave edin.
3. mümkün olduğunca çabuk aşağıdaki adımları uygulayın.
   1. Şiddetle bu yüzden filtreyi içeren tüp vorteksFiltre tüpün çevresine whisks ve tampon tamamen filtreyi yıkar. Her zaman buz üzerinde geri koyarak tüp soğuk tutmak. Not: Tam filtre kapalı bakteri yıkamak için ters ise ayrıca tüp vorteks için gerekli olabilir.
   2. Tüm borular için tekrarlayın. Spin-aşağı kısa bir süre süspansiyon (120 xg'de 1 dakika) işlemi sonunda yararlı olabilir.
4. SDS ve (2.1 hazırlandı) fenol / kloroform karışımı ihtiva eden bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne bakteri içeren tampon aktarın. Tüm borular için tekrarlayın. Filtreden kalan tampon almak için tekrar filtre ihtiva eden tüpler (120 xg'de 1 dakika) döndürmek için gerekli olabilir.
5. 10 dakika süre ile tam hızda her 1.5 mi, bir multi-tüp vorteks cihazı tüpler ve vorteks yerleştirin.
6. 10 dakika boyunca 65 ° C ısıya bloğunda inkübe edin. 5 dakika boyunca maksimum hızda (> 14.000 xg) santrifüj.
7. Her t sulu tabakayı (yaklaşık 400 ul) aktarın3 M sodyum asetat (pH 5.2) ve 1.0 ml% 100 etanol içinde 40 ul ihtiva eden yeni bir 1.5 ml'lik tübe Ube. iyice her tüp Vortex.
   Not: Glikojen çöktürülmüş pelet görselleştirme artırmak için bu aşamada ilave edilebilir.
8. 1 saat boyunca -80 ° C'de inkübe edin. Seçenek olarak ise, Cı gece boyunca -20 ° örnekleri inkübe edin. Daha sonra, en yüksek hızda (> 14,000 xg), 20 dakika boyunca 4 ° C 'de numuneler santrifüj.
9. Dikkatle her tüpten etanol (üst katman) aspire. iyice her bir örnek ve vorteks 500 ul soğuk% 70 etanol ekleyin. maksimum hıza (> 1 4000 xg), 20 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüje.
10. Dikkatle her tüpten etanol aspire. Resim ısı ile bir vakum buharlaştırıcı kullanılarak yaklaşık 2 dakika boyunca numune kurutun. numuneler aşırı kurutmayın.
11. Her bir örnek için 25 mL RNaz içermeyen su ilave edilir. 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Dikkatle girdap ve spin-aşağı.
12. t RNA konsantrasyonu ölçmekBir mikrohacim UV-Vis spektrofotometre kullanarak o örnekler. Plaka başına nükleik asitlerin 1 ug - yaklaşık 0.5 ayıklamak için bekliyoruz.
    Not: teknik çoğaltır bu aşamada birleştirilebilir.

3. DNaz Tedavi

1. Mikrofüj tüpüne Tablo 1 'e göre bir reaksiyon ayarlayın. 45 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. 450 mL RNaz içermeyen su ve maksimum hızı (> 14,000 xg) 2 dakika süreyle santrifüjlenerek fenol-kloroform-IAA karışımı (Tablo 2), ayrı fazlar 500 ul ekle.
2. Yeni bir tüpe Sulu tabaka transferi ve maksimum hızı (> 14,000 xg) 2 dakika santrifüjleme ile 500 ul kloroform-IAA karışımı (Tablo 2), girdap ve ayrı fazlar ekleyin.
3. yeni bir tüpe Sulu tabaka transferi ve 1 mL etanol ve 3 M sodyum asetat (pH 5.2) 50 ul ekle. Vortex.
   Not: Glikojen çöktürülmüş pelet görselleştirme artırmak için bu aşamada ilave edilebilir.
4. -80 ° C de 1 saat süreyle inkübe edin. Seçenek olarak ise, Cı gece boyunca -20 ° örnekleri inkübe edin. maksimum hızda 20 dakika süreyle 4 ° C'de santrifüje.
5. Dikkatle her tüpten etanol aspire. iyice her bir örnek ve vorteks 500 ul soğuk% 70 etanol ekleyin. en yüksek hızda 20 dakika süreyle 4 ° C'de santrifüje. Dikkatle her tüpten etanol aspire.
6. Resim ısı ile bir vakum buharlaştırıcı kullanılarak yaklaşık 2 dakika boyunca numune kurutun. numuneler aşırı kurutmayın.
7. Oda sıcaklığına girdap ve dönme, yavaşlama, 2 dakika boyunca inkübe RNaz içermeyen su 12 ul ekle. Numuneler, saflaştırılmış RNA içeren buz üzerinde saklayın. Seçenek olarak ise, RNA çözülür RNase içermeyen _H2O 0.1 mM EDTA ve TE tamponu (10 mM Tris, 1 mM EDTA) ile.
8. Bir mikrohacim UV-Vis spektrofotometre kullanılarak RNA konsantrasyonları ölçün. (Teknik çoğaltır birleştirilir ise) numune başına RNA ~ 100 ng bekliyoruz.
   Not: RNA çıkarılan bu protokole göre fo uygundurBirden tekniklerle r gen transkripsiyonu analizi. Biz genellikle L. incelemek için RT-qPCR analizi istihdam makrofaj hücreleri ^1-4 enfeksiyon sırasında gen transkripsiyonunu monocytogenes.

Sonuçlar

Model sistem, Şekil 1 'de gösterilen ve L ile enfekte makrofaj hücreleri içerir makrofaj sitozolde çoğaltmak bakterileri monocytogenes. 2 deney düzeni temsil Şekil. Şekil 3 WT L. sırasında virülans genlerinin RT-qPCR analizi tipik sonuçlarını temsil Zengin laboratuar ortamı BHI büyümeye kıyasla makrofajlar büyüme monocytogenes. Sonuçlar L. iki ana has...

Tartışmalar

Burada açıklanan protokol L. bakteriyel RNA izolasyonu için optimize edilmiş bir yöntemle temsil makrofaj hücrelerinde hücre büyüyen bakterilerin monocytogenes. Bu protokol, hücre ayırıcı liziz göre ve bakteriyel RNA zenginleştirilmesi için iki ana adımları içerir: santrifüj ve süzme ile bakterilerin hızlı bir koleksiyonunu kullanarak makrofaj çekirdekler çöktürülür. Bu adımlar, standart RNA ekstraksiyon prosedürü izlemektedir. Bu protokol, Lısterıal RNA saflaştırma ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Listeria monocytogenes 10403S			20
Bone marrow derived macrophages prepared from C57B/6 female mice			21
H2O, RNAse free	Thermo Scientific	10977-015	DEPC-treated water can be used
DMEM	Gibco	41965039
Glutamine	Gibco	25030081
Sodium pyruvate	Gibco	11360-088
β-Mercaptoethanol	Gibco	31350010
Pen/Strep	Gibco	15140-122
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397
FBS	Gibco	10270106
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline-PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Brain heart infusion (BHI)	Merckmillipore	1104930500
Phenol saturated pH 4.3	Fisher	BP1751I-400
Chloroform	Fisher	BP1145-1
Iso-amyl alcohol	Sigma-Aldrich	W205702
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	W302406
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
DNaseI	Fermentas	EN0521
SDS 10%	Sigma-Aldrich	L4522
Ethanol absolute	Merck Millipore	1070174000
37 °C, 5% CO2 forced-air incubator	Thermo Scientific	Model 3111
Cell scrapers	Nunc	179693
Kontes glass holder for 45 mm filters	Fisher	K953755-0045
MF-Millipore filters 45 mm, 0.45 µm	Merck Millipore	HAWP04700
SpeedVac system	Thermo Scientific	SPD131DDA
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	Model G560E
NanoDrop	Thermo Scientific
145 mm cell culture dishes	Greiner	639 160
1.7 ml tubes, RNase-free	Axygen	MCT-175-C
30 °C incubator	Thermo Scientific
65 °C heat block	Thermo Scientific
4 °C table centrifuge	Eppendorf	5417R
Sterile pipettes, 25 ml	Greiner
Falcon tubes, 50 ml	Greiner
Liquid nitrogen