Preclínica modelo murino ortotópico de cáncer de próstata humano

Resumen

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

Resumen

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Introducción

El cáncer de próstata es la segunda causa más frecuente de muerte por cáncer (9%) entre los hombres en los Estados Unidos, junto con el cáncer de pulmón y de bronquios (28%) ^1. Según los últimos datos, se estima que 220, 800 casos de cáncer de próstata recién diagnosticados y 27, 540 muertes ocurrirán en 2015 ^1. La tasa de supervivencia relativa a cinco años de cáncer de próstata en etapa temprana es> 99%, mientras que la de enfermedad metastásica avanzada es sólo el 28% ^1. Un reto importante para el tratamiento de la enfermedad metastásica avanzada es la falta de comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la propensión de la enfermedad a la metástasis a otros órganos, especialmente en el hueso, que es un sitio frecuente de cáncer de próstata. Por lo tanto, existe una clara necesidad de estudiar la composición molecular de estos tumores de próstata con el fin de desarrollar regímenes terapéuticos eficaces contra la progresión a avanzado ^2,3 enfermedad metastásica.

Los tumores de próstata hig exhibiciónh heterogeneidad biológica sin un camino bien definido para la progresión. Metástasis a menudo se producen sin ninguna indicación previa de la invasividad tumoral ^4. Esta heterogeneidad clínica se atribuye a la diversidad molecular de cáncer de próstata. Comprender la composición molecular de estos tumores letales es la clave para diseñar mejores estrategias diagnósticas y terapéuticas para esta enfermedad. En consecuencia, la investigación del cáncer de próstata se centra actualmente en la comprensión y la prevención de la metástasis.

Preclínicos modelos de ratón in vivo ofrecen una variedad de opciones para comprender los mecanismos moleculares de la progresión del cáncer de próstata metastásico avanzado a la enfermedad. Además, estos modelos son importantes para las evaluaciones preclínicas de nuevas estrategias terapéuticas contra esta enfermedad. Los modelos animales más comúnmente usados ​​incluyen modelos de ratones transgénicos, la cola de inyección venosa, implantación intra-cardiaca y modelos de ratón ortotópico humanos. estudios transgénicos son consumi tiempong y correlación de desarrollo del cáncer de próstata en ratones con la de los seres humanos han demostrado la variabilidad ^11. En modelos de ratón de metástasis espontáneas, las células se inyectan directamente en la circulación y, sin embargo, de que tengan tiempo de respuesta rápido, no se pueden utilizar para estudiar el tumor primario o los pasos iniciales de la cascada metastásica ^5. modelos de xenoinjerto ortotópico tienen la limitación del desarrollo de lesiones metastásicas óseas, el sitio común de metástasis del cáncer de próstata. Sin embargo, el cáncer de próstata modelo de ratón con xenoinjerto ortotópico humano está bien caracterizado y ampliamente usado para estudiar los eventos moleculares del desarrollo del tumor primario, la diafonía entre tumor y microambiente de órganos, la fase inicial de la enfermedad metastásica y el uso de fármacos experimentales para la intervención terapéutica ^{6 , 7,8-11.}

Protocolo

Los protocolos para todos los procedimientos con animales deben ser revisados ​​y aprobados por un Comité para el Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC). Siga los procedimientos aprobados oficialmente para el cuidado y uso de animales de laboratorio. La inyección intra-prostática requiere cirugía abdominal abierta y animales debe mantenerse en un entorno libre de patógenos de una sala de cirugía designada donde se utilizan técnicas asépticas quirúrgicos adecuados durante todo el procedimiento.

1. Preparación de las células para la implantación

NOTA: Basado en la necesidad de investigación, cualquier línea celular de cáncer de próstata se puede utilizar. Las líneas celulares se cultivaron de acuerdo con las instrucciones del proveedor.

1. Para la línea celular PC3M-Luc-C6 que expresa de forma estable el gen de luciferasa de luciérnaga, células de cultivo en medio esencial mínimo (MEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), aminoácidos 1x no esenciales, 1x fleomicina D1 y 1 mM de piruvato de sodio . Mantener las células en una incubadora wITH una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de _CO2 a 37 ° C. células PC3M-Luc-C6 se adquirieron a partir facilidad de la base de la UCSF.
2. Cosecha células por tripsinización. Lavar las placas de cultivo una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Añadir 2 ml de tripsina 0,05% a una placa de 10 cm y se incuba durante 3 a 5 min en una incubadora con una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de _CO2 a 37 ° C hasta que se separan las células.
   1. Para evitar la formación de grumos, no agitar las células golpeando o sacudiendo el plato a la espera de las células se despeguen. Recoger las células en 5 ml de medio completo y centrifugar durante 5 minutos a 200 x g. Lavar el sedimento celular con PBS para eliminar la tripsina.
3. Enumerar las células vivas mediante el ensayo de exclusión de azul de tripano. Mezclar 10 l de la suspensión de células en PBS con 10 l de 0,4% (v / p) de solución de azul de tripano. Cargar la mezcla en un hemocitómetro o cámara de recuento de diapositivas y contar las células inmediatamente bajo un microscopio o leer la diapositiva cámara en un cou célulanter.
   1. Preparar una suspensión celular que contenía 2,5 x 10 ⁵ células en 10 l de medios. Mezclar la suspensión de células con el extracto de matriz extracelular 10 l membrana basal-like y colocar las células en hielo. Añadir luciferina a la suspensión celular (1: 200 l; de stock 30 mg / ml de concentración) antes de la inyección en ratones.
      NOTA: Esto permite inmediata bio-imágenes de los animales para comprobar la coherencia de las inyecciones de células entre los diferentes grupos experimentales. Inyectar las células tan rápidamente como sea posible, preferiblemente dentro de 30 min después de tripsinización desde la viabilidad celular disminuye rápidamente después de la separación.

2. Preparación del área quirúrgica

1. Realizar la cirugía en un área despejada, desinfectada que promueve la asepsia.
2. Desinfectar el banco contador / laboratorio con una solución de cloro antes de la cirugía.
   NOTA: El uso de alcohol no se recomienda debido al largo tiempo de contacto requerido para entrar en vigor (15 min).
3. Use paños estériles,limpiar las almohadillas absorbibles o toallas, y reemplazar estos materiales después de cada sesión quirúrgica. Esterilizar todos los instrumentos antes de su uso. Los métodos preferidos son un autoclave de vapor, vidrio esterilizador de cuentas, gas óxido de etileno, o la esterilización con vapor de peróxido de hidrógeno.
4. Utilizar un microscopio de disección aséptica limpiado para realizar el procedimiento quirúrgico o investigadores experimentados pueden realizar sin un microscopio.

3. Implantación de células tumorales

1. Utilice macho de 6-8 semanas de edad inmunocomprometidos Balb / c / o ratones SCID NOD.
   NOTA: Es más difícil de operar en los animales más pequeños y animales más grandes tienden a tener más lenta cinética de crecimiento del tumor y la metástasis.
2. Inyectar antes de la cirugía medicamentos para el dolor según las instrucciones de la instalación para animales. Por ejemplo, buprenorfina intra-peritoneal a una dosis de 0,1 mg / kg de peso se puede utilizar.
3. Anestesiar animales colocándolos en una cámara de isoflurano con 1-3% de isoflurano en oxígeno y wahasta que los animales están completamente anestesiados. Asegúrese de que no hay reflejo del dedo del pie de tono muscular en este punto. El uso adecuado de lubricante veterinaria pomada oftálmica para prevenir la ceguera por xeroftalmía durante la anestesia general.
   NOTA: Anestesie los animales por del investigador método preferido, por ejemplo, por pentobarbital sódico, se administra 0,05 mg por gramo de peso corporal intra-peritoneal o la solución de ketamina / xilazina (concentración: 17,16 mg / ml) a una dosis de 65 mg / kg de peso corporal se usa por vía subcutánea. inhalación de isoflurano es un método preferido de la anestesia. La pomada ocular se debe aplicar suavemente sin frotar contra la córnea.
4. Retire el animal de la cámara de isoflurano y colocar en un aparato de cono de la nariz con flujo continuo de 1 a 2% de isoflurano en oxígeno para asegurar que el animal está bajo anestesia completa antes de continuar.
   1. Quitar el pelo de los ratones por el afeitado o usar una crema de eliminación de vello antes de comenzar el procedimiento.
      NOTA: Sería preferible colocar el ratón sobre una almohadilla caliente estéril durante la cirugía.
5. Coloque el ratón en una posición supina. Limpiar la parte inferior del abdomen con 10% w / w solución de povidona-yodo seguido por 70% de etanol hisopos.
6. Con un par de pinzas finas, levante un área de piel de 2 mm por encima de la glándula prepucial, alrededor de 1-2 cm por encima de la vaina del pene, y alrededor de 2 a 3 cm por debajo de la parte inferior de la caja torácica.
7. Hacer un 1 cm de la línea media de la incisión de longitud, primero a través de la piel con un escalpelo y luego a través de la capa muscular con una tijera (Figura 1).
8. Ubicar la vejiga en la cavidad corporal. Es un órgano esférico de color marrón-amarillo claro, que se encuentra directamente debajo de la incisión (Figura 1).
9. Con un par de agarre pinzas finas de la vejiga y levantar hacia arriba luego hacia abajo fuera de la cavidad del cuerpo hacia la vaina del pene. Esto expondrá las dos vesículas seminales, que son un par de órganos en forma de saco blanco y claramente distinto.
10. Con unhisopo de algodón en cada mano, exteriorizar las vesículas seminales, uno por uno, y sacarlos de la cavidad del cuerpo y yacía boca abajo sobre la superficie exterior del abdomen con la vejiga en el medio (Figura 2).
11. El uso de los bastoncillos de algodón, suavemente inclinación hacia atrás de las vesículas seminales en el punto de inserción cerca del cuello de la vejiga, hacia la vaina del pene, de manera que los dos lóbulos de la próstata dorsal son claramente visibles. Use hisopos de algodón húmedo para evitar daños en los tejidos (Figura 3).
12. Agitar la suspensión de células con una micropipeta antes de cargar en la jeringa.
13. Mientras que la colocación de las vesículas seminales en su posición con un hisopo de algodón, inserte la aguja de la jeringa en el lóbulo dorsal de la próstata bajo el microscopio (Figura 4). inyectar lentamente 20 l de suspensión celular hasta que se identifica una formación de bullas. Una ampolla abultada indica que la inyección es correcta.
14. Mientras se retrae la aguja, presione ligeramente en la zona de inyección conun hisopo de algodón y mantener durante unos segundos para evitar fugas.
15. Levante con cuidado las vesículas seminales con hisopos de algodón e insertarlos de nuevo a la cavidad del cuerpo, uno por uno, seguido de la vejiga. Evitar '' girando los órganos internos mientras realiza este procedimiento.
16. Después de colocar de nuevo los órganos en la cavidad corporal, la sutura de la capa muscular primero en un patrón interrumpido con 4-0 suturas de catgut crómico absorbibles seguido por el cierre de la piel con no absorbible 4-0 nylon sutura quirúrgica. La piel también se puede tirar juntos y se cerró con pinzas quirúrgicas para cerrar la incisión por completo.
    NOTA: Los ratones tienen un hábito de arañar y morder a su herida, lo que puede dar lugar a la reapertura de la herida, por lo tanto, el uso del adhesivo tisular también se recomienda junto con suturas. animales imagen de inmediato para asegurar que no es igual intensidad bioluminiscente entre todos los grupos experimentales.
17. Devolver los animales para limpiar las jaulas y mantenerlos bajo una lámpara de calor o calentamientoing almohadilla. Monitorear constantemente los animales hasta que se recuperan completamente de la anestesia y mantienen decúbito esternal.

4. Seguimiento de los Animales

1. Monitorear los animales regularmente hasta el final del experimento, de acuerdo con protocolos institucionales. Si el uso de clips metálicos quirúrgicos, retire después de una a dos semanas. Duración del experimento depende de la necesidad de investigación específico.
   NOTA: Este experimento se llevó a cabo durante 21 días para examinar el establecimiento con éxito de las células cancerosas implantadas en la próstata del ratón.
2. Administrar medicamentos para el dolor en base a las instrucciones de las instalaciones de animales. Por ejemplo, buprenorfina intra-peritoneal a una dosis de 0,1 mg / kg de peso se puede utilizar en el momento del procedimiento con una segunda dosis después de dosis 6 hr y adicionales cada 8-12 horas, según sea necesario.
3. Vigilar el peso del animal, el consumo de alimentos, el color y la textura de la piel, la actividad y la frecuencia de la micción y la defecación. La eutanasia a los animales immediately si hay una pérdida significativa de peso corporal mayor que 15%.
   1. Para la eutanasia, entregar _el CO ₂ de un tanque a presión dentro de una jaula de afluencia de gente a un caudal de desplazar el 10-30% de la cámara o jaula volumen / minuto, permitiendo que _el CO ₂ entre en la cámara lentamente para que se produzca la inconsciencia y la narcotización completa antes de la muerte.
   2. Mantener CO ₂ de flujo para al menos un minuto después de la parada respiratoria y dejar a los animales en la cámara durante un tiempo suficiente para que la muerte se produce antes de realizar un método físico.
   3. Realizar la decapitación, la dislocación cervical o cualquier otro método aprobado por el IACUC física después de la eutanasia de los animales químicamente.
      NOTA: Se ha reducido significativamente el peso corporal a menudo indica una condición de letargo. animales portadores de tumores deben estar en buen estado de salud a excepción de la presencia de tumores hasta el final del experimento. La eutanasia debe ser coherente con las Directrices sobre la eutanasia AVMA y debe ser listed en el protocolo aprobado IACUC.

5. La no-invasivo Bio-imágenes de los Animales

1. Monitorear los animales semanalmente usando una técnica de imágenes no invasivo para el seguimiento de la colonización de las células de cáncer, el crecimiento del tumor y cualquier metástasis distante.
   NOTA: modalidades de imágenes tales como GFP-imágenes, imágenes de la luciferasa, los rayos X o tomografía 3D micro-computarizada (UCT), etc., pueden ser utilizados en base a la investigación específica necesitan ^12-15.

Resultados

Después de la implantación de las células ortotópico PC3M-Luc-C6 en el lóbulo de la próstata posterior, los ratones fueron imágenes semanal mediante el uso de un sistema de imágenes de bioluminiscencia animal vivo para controlar la colonización de células y el crecimiento del tumor durante el transcurso de experimento (Figura 5A - B). La cuantificación de la señal bioluminiscente indicó que las células PC3M-Luc-C6 colonizados con éxito los...

Discusión

Este manuscrito describe un procedimiento detallado para el establecimiento de un cáncer de próstata modelo de xenoinjerto de ratón ortotópico humano. Este modelo fue establecido por la implantación directa de la línea celular de cáncer de próstata humano PC3M-Luc-C6 en los lóbulos prostáticos dorsal de ratones inmunodeficientes. Los tumores se dejaron desarrollar durante el transcurso del experimento. El crecimiento tumoral se controló semanalmente por un sistema de imágenes de bioluminiscencia no invasiva ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
PC3 prostate cancer cell line	ATCC	CRL-1435
Minimum Essential Medium (MEM)	GIBCO,Life Technology	11095-080
PBS	GIBCO,Life Technology	10010-023
FBS	GIBCO,Life Technology	10437-028
Zeocin	Invitrogen,Life Technology	R250-01
Trypsin	GIBCO,Life Technology	25300-54
IVIS	Xenogen-Caliper
Insulin Syringes (300 µl, 28.5 g)	Becton Dickinson	309300
Mice	Charles River Laboratories, Inc
Alcohol Swabs	MEDEquip Depot	326895 BD
PVP Iodine Prep Pad	MEDEquip Depot	C12400PDI
Surgical CatGut Chromic Suture	Demetech	CC224017F0P
Matrigel	Corning	354248