İnsan Prostat Kanseri klinik öncesi Ortotopik murin modeli

Özet

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

Özet

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Giriş

Prostat kanseri sonraki akciğer ve bronşların (% 28) ¹ kanseri, ABD'de erkekler arasında kanser ölümlerinin (% 9) ikinci en yaygın nedenidir. Son verilere göre, 220, 800 yeni teşhis prostat kanseri vakası ve 27 540 ölüm 2015 ¹ oluşacak tahmin edilmektedir. Ilerlemiş metastatik hastalık olduğunu iken, erken evre prostat kanseri beş yıllık sağkalım oranı göreceli>% 99 sadece% 28 ^1. metastatik hastalığın tedavisi için önemli bir zorluk, özellikle prostat kanseri için sık ortaya çıktığı yerdir kemik için, diğer organlara metastaz için, bu hastalığın eğilimini altında yatan moleküler mekanizmaların anlaşılması eksikliğidir. Bu nedenle, gelişmiş metastatik hastalık ^2,3 ilerleme karşı etkili tedavi rejimleri geliştirmek için bu prostat tümörlerinin moleküler makyaj incelemek için açık bir ihtiyaç vardır.

Prostat sergi HIG tümörleriilerlemesi için iyi tanımlanmış bir yolun olmadan h biyolojik heterojenlik. Metastaz sıklıkla tümör invazivlik ⁴ önceden hiçbir göstergesi ile meydana gelir. Bu klinik heterojenite prostat kanserinin moleküler çeşitlilik atfedilir. Bu ölümcül tümörlerin moleküler makyaj anlamak bu hastalık için daha iyi teşhis ve tedavi stratejilerinin tasarımı anahtarıdır. Sonuç olarak, prostat kanseri araştırması şu anda anlaşılması ve metastaz engelleyen odaklanmıştır.

Preklinik in vivo fare modelleri ilerlemiş metastatik hastalık prostat kanseri ilerlemesinde moleküler mekanizmalarını anlamak için çeşitli seçenekler sunuyoruz. Buna ek olarak, bu modeller, bu hastalığa karşı yeni tedavi stratejileri klinik öncesi değerlendirmeleri için önemlidir. En yaygın olarak kullanılan hayvan modelleri, transjenik fare modelleri, kuyruk damarından, intra-kalp implantasyonu ve insan ortotopik fare modelleri bulunmaktadır. Transgenik çalışmalar zaman consumi vardırng ve insanların bu farelerde prostat kanseri gelişme korelasyon değişkenliğini ¹¹ göstermiştir. Spontan metastatik fare modellerinde, hücreler dolaşıma doğrudan enjekte edilir ve onlar hızlı gerçekleştirme süresi olsa, bunlar primer tümör veya metastatik kaskad ⁵ ilk adımlarını incelemek için kullanılamaz. Ortotopik ksenograft modelleri kemik metastatik lezyonlar, prostat kanseri metastaz ortak sitesi geliştirme sınırlama var. Bununla birlikte, insan ortotopik prostat kanseri ksenograft fare modeli iyi karakterize ve yaygın primer tümör gelişimi, tümör ve organ mikroçevresinin, terapötik müdahale ⁶ metastatik hastalık ve deneysel ilaçların kullanımı başlangıç ​​aşamasında arasındaki çapraz konuşma moleküler olayları incelemek için kullanılır ^{, 7,8-11.}

Protokol

hayvanları ile ilgili tüm prosedürler için protokoller gözden geçirilmiş ve bir Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış olması gerekir. bakım ve laboratuar hayvanlarının kullanımı için resmen onaylanmış prosedürleri izleyin. Intra-prostatik enjeksiyon açık karın cerrahisi gerektiren ve hayvanların uygun cerrahi aseptik teknikler bütün prosedür sırasında kullanılan belirli bir ameliyathane ile bir patojen içermeyen ortamda muhafaza edilmelidir.

İmplantasyon için Hücrelerin hazırlanması 1.

NOT: Araştırma ihtiyacı dayanarak, herhangi bir prostat kanseri hücre hattı kullanılabilir. Hücre çizgileri kullanılarak üreticinin talimatlarına göre kültürlenir.

1. kararlı biçimde ateşböceği lusiferaz genini ifade PC3M-Luc-C6 hücre hattı için, en az temel ortam (MEM) kültür hücreleri,% 10 cenin sığır serumu (FBS), 1 x esansiyel olmayan amino asitler ile takviye edilmiş, 1 x fleomisin, D1 ve 1 mM sodyum piruvat . bir kuluçka w hücreleri korumaki, 37 ° C de% 95 hava ve% 5 _CO2 bulunan nemli bir atmosferde. PC3M-Luc-C6 hücreleri UCSF çekirdek tesisinden temin edilmiştir.
2. tripsinizasyon ile Hasat hücreleri. Fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir kez kültür plakaları yıkayın. Hücreler müstakil yılına kadar 37 ° C'de% 95 hava ve% 5 _CO2 bulunan nemli bir atmosfere sahip bir kuluçka makinesi içinde, 10 cm tabak 2 mi% 0.05 tripsin ilave edin ve 3-5 dakika inkübe edilir.
   1. topaklanma önlemek için, vurma veya hücrelerin ayırmak için beklerken çanak sallayarak hücreleri ajitasyon yok. tam ortam 5 ml hücreleri toplamak ve 200 x g'de 5 dakika boyunca aşağı doğru döndürün. Tripsin kaldırmak için PBS ile hücre pelet yıkayın.
3. tripan mavisi dışlama deneyi ile canlı hücreleri numaralandırmak. % 0.4, 10 ul (ağ / hac), tripan mavisi solüsyonu ile PBS içinde hücre süspansiyonu 10 ul karıştırın. Bir hemositometre veya sayma kamara slayt içine karışımı yerleştirin ve mikroskop altında hemen hücreleri saymak ya da bir hücre cou odası slayt okumaknter.
   1. 10 ul medya 2.5 x 10 ⁵ hücre ihtiva eden bir hücre süspansiyonu hazırlanır. 10 ul bazal membran benzeri hücre dışı matris ekstresi ile bir hücre süspansiyonu karıştırılır ve buz üzerinde hücreleri yerleştirin. Hücre süspansiyonuna luciferase ekleyin (1: 200 ul; hazır 30 mg / ml konsantrasyon) farelere enjekte edilmeden önce.
      NOT: Bu farklı deneysel gruplar arasında hücre enjeksiyonları tutarlılığını kontrol etmek için hayvanların hemen biyo-görüntüleme sağlar. hücre canlılığı ayrıldıktan sonra hızla azalır çünkü trypsinization sonra tercihen 30 dakika içinde, mümkün olduğunca çabuk hücreleri enjekte edilir.

Cerrahi Alan 2. Hazırlık

1. asepsi teşvik derli toplu bir dezenfekte alanda ameliyat.
2. Ameliyat öncesi çamaşır suyu karışımı ile sayaç / laboratuvar tezgah dezenfekte edin.
   NOT: alkol kullanımı nedeniyle etkisini (15 dk) almak için gerekli uzun temas süresi cesareti olduğunu.
3. Steril örtüler kullanınemilebilir pedler ya da havlu temizleyin ve her seansta sonra bu malzemeleri değiştirin. Kullanmadan önce tüm aletleri sterilize. Tercih edilen yöntemler, bir hareketli buharlı otoklav içinde, bir cam boncuk sterilizatör etilen oksit gazı ya da hidrojen peroksit buharı sterilizasyon vardır.
4. cerrahi prosedürü gerçekleştirmek için bir aseptik temizlenmiş diseksiyon mikroskobu kullanın ya da deneyimli araştırmacılar mikroskop olmadan gerçekleştirebilirsiniz.

Tümör Hücreleri 3. implantasyonu

1. erkek 6-8 haftalık bağışıklığı baskılanmış Balb / c veya NOD / SCID fareleri kullanın.
   Not: Bu, tümör büyümesi ve metastaz yavaş kinetik sahip olma eğilimindedir küçük hayvanlar ve daha büyük hayvanlar üzerinde çalıştırmak için daha zordur.
2. Hayvan Tesisin talimatlarına göre ön ameliyat ağrısı ilaç enjekte edilir. Örneğin, 0.1 mg / kg vücut ağırlığı bir dozda intra-peritonal buprenorfin kullanılabilir.
3. oksijen ve wa% 1-3 izofluran ile bir izofluran odasına yerleştirerek hayvanların anestezisibu hayvanların tam olarak anestezi kadar. Bu noktada kas tonusu hiçbir ayak refleks olmadığından emin olun. genel anestezi sırasında kseroftalmiden nedeniyle körlüğü önlemek için uygun veteriner oftalmik merhem yağ kullanın.
   Not: pentobarbital sodyum için araştırmacının tercih edilen bir yöntem, örneğin tarafından hayvanların anestezisi gram vücut ağırlığı başına, 0.05 mg intra-peritonal ya Ketamin / Ksilazin çözeltisi tatbik edilir (konsantrasyon: 17.16 mg / ml) 65 mg / kg dozda vücut ağırlığı subkutan kullanılır. Izofluran inhalasyonu anestezisi tercih edilen bir yöntemdir. göz merhemi hafifçe kornea sürtünmemelidir uygulanmalıdır.
4. izofluran bölme hayvan çıkarın ve hayvan devam etmeden önce, tam anestezi altında olmasını sağlamak için oksijen,% 1-2 izofluran sürekli akışı ile bir burun konisi cihazının içine koyun.
   1. Tıraş tarafından farelerden alınan saç çıkarın veya prosedürü başlamadan önce saç kremleri kullanın.
      NOT: Ameliyat sırasında steril bir ısıtma yastığı üzerinde fare yerleştirmek için tercih olacaktır.
5. Bir yatar pozisyonda fare yerleştirin. povidon-iyot çözeltisi,% 70 etanol bezlerden, ardından 10 ağırlık / ağırlık ile% alt karın temizleyin.
6. ince forseps bir çift, 2 mm prepusyal bezi üzerinde penis kılıf üzerinde yaklaşık 1-2 cm ve göğüs kafesinin alt bölümünün yaklaşık 2-3 cm deri bir alanı kaldırın.
7. Ilk olarak bir bisturi ile deri yoluyla ve daha sonra bir makas (Şekil 1), kas tabakası içinden uzunluğunda bir orta hat kesimi 1cm sağlayın.
8. vücut boşluğunda mesane bulun. Bu kesi (Şekil 1) altında doğrudan yer alan sarı-açık kahverengi küresel bir organdır.
9. ince forseps kavrama bir çift mesane ve penis kılıf doğru vücut boşluğundan dışarı aşağı sonra yukarı kaldırın. Bu beyaz saclike organların çift ve açıkça farklı olan iki seminal veziküller gösterecektir.
10. Birliktepamuklu çubukla her el, seminal veziküller, teker teker dışa ve vücut boşluğuna çekip çıkarın ve onları ortada mesane (Şekil 2) ile karın dış yüzeye yüzüstü yatıyordu.
11. İki dorsal prostat lobları açıkça görülebilir şekilde pamuklu çubuklarla kullanarak, yavaşça, penis kılıf doğru mesane boynunun yakın yerleştirilmesi noktasında seminal veziküller geri yatırın. Doku hasarı (Şekil 3) önlemek için ıslak pamuk bezlerden kullanın.
12. şırıngada yüklemeden önce bir mikropipet ile hücre süspansiyonu çalkalayın.
13. Bir pamuklu çubukla pozisyonda seminal vezikül yerleştirirken, mikroskop altında dorsal prostat lob (Şekil 4) içine şırınga iğne takın. Bir bül oluşumu tespit edilene kadar yavaş yavaş hücre süspansiyonu 20 ul enjekte edilir. Bir dışarı vurma bül enjeksiyonu doğru olduğunu gösterir.
14. ile enjeksiyon yerinde hafifçe iğne basın retracting ikenBirkaç saniye için bir pamuklu çubukla ve tutma sızıntısını önlemek için.
15. Dikkatle pamuklu seminal veziküller kaldırın ve mesane ardından tek geri vücut boşluğunda birine bunları takın. Bu yordamı gerçekleştirirken 'twirling' iç organları kaçının.
16. vücut boşluğuna geri organları yerleştirdikten sonra, emilmeyen 4-0 naylon cerrahi sütür ile cilt kapatılması ardından emilebilir 4-0 kromik katgüt sütür ile kesintiye uğramış bir desen ilk kas tabakası dikin. deri de tamamen insizyon kapatmak için bir araya çekti ve cerrahi kelepçeler ile kapatılabilir.
    NOT: Fareler de dikişler ile birlikte tavsiye edilir çizilme ve dolayısıyla yara açılması yeniden doku yapıştırıcısı kullanımı yol açabilir onların yara, ısırma bir alışkanlığı var. Görüntü hayvanlar derhal deney grupları arasındaki eşit biyolüminesans yoğunluk var olduğundan emin olmak için.
17. kafesleri temizlemek ve ısınma lambası veya ısı altında tutmak için hayvanların dönmekped ing. tamamen anestezi kurtarmak ve sternum yatma korumak kadar sürekli hayvanları izleyin.

Hayvanların 4. İzleme

1. kurumsal protokollere göre, deney sonuna kadar düzenli olarak hayvanların izleyin. Cerrahi metal klips kullanıyorsanız, bir iki hafta sonra kaldırın. Deney süresi belirli bir araştırma ihtiyacı bağlıdır.
   NOT: Bu deney, sıçan prostatı implante kanser hücrelerinin başarılı bir kuruluş incelemek için 21 gün boyunca uygulanmıştır.
2. Hayvan Tesisin talimatlarına göre ağrı ilaç yönetmek. Gerektiğinde, örneğin 0.1 mg / kg vücut ağırlığı bir dozda intra-peritonal buprenorfin 6 saat ve daha fazla doz uygulandıktan sonra ikinci bir doz işlem sırasında her 8-12 saat kullanılır.
3. Hayvan ağırlığı, gıda tüketimi, ten rengi ve dokusu, aktivite ve idrar ve dışkılama sıklığı izleyin. hayvanların immed euthanizegeçirmeden% 15 daha büyük bir vücut ağırlığı önemli bir kayıp olup olmadığını.
   1. Ötenazi için, bilinç kaybı ve tam uyuşurucu meydana böylece _CO2 yavaş yavaş odasına girmek için izin, oda ya da kafes hacmi / dakika 10-30% değiştirmesi için bir akış hızında bir un-kalabalık kafesin içine basınçlı bir tanktan CO ₂ teslim ölümünden önce.
   2. Solunum durması sonrasında, en az bir dakika süre ile _CO2 akış korumak ve ölüm fiziksel yöntemin gerçekleştirilmesi öncesinde gerçekleştirilen, böylece yeterli bir süre için bölmeye hayvanlar bırakın.
   3. Gerçekleştirin decapitation, servikal dislokasyon veya başka herhangi bir IACUC kimyasal hayvanları euthanizing sonra fiziksel yöntemi onayladı.
      NOT: Önemli ölçüde azaltılmış vücut ağırlığı genellikle uyuşuk durumunu gösterir. Tümör taşıyan hayvanlar, deneyin sonuna kadar, tümör varlığı dışında sağlıklı olmalıdır. Ötenazi Ötanazi AVMA Yönergeleri ile uyumlu olmalıdır ve liste olmalıonaylanmış IACUC protokolü, d.

Hayvanların 5. Non-invaziv Biyo-görüntüleme

1. haftalık, kanser hücrelerinin, tümör büyümesi ve herhangi bir uzak metastaz kolonizasyonunu izlemek için non-invaziv bir görüntüleme tekniği kullanılarak hayvanları izleyin.
   NOT: vb GFP-görüntüleme, Lusiferaz görüntüleme, X-ışınları veya 3D mikro-bilgisayarlı tomografi (UCT) gibi görüntüleme yöntemleri spesifik araştırma dayalı kullanılabilir ^12-15 gerekir.

Sonuçlar

Prostatik lobuna PC3M-Luc-C6 hücrelerinin ortotopik implantasyonu takiben fareler haftada deney sırasında (- B Şekil 5A) üzerinden hücrelerin kolonizasyonunun ve tümör büyümesini izlemek için canlı bir hayvan biyolüminesans görüntüleme sistemi kullanılarak görüntülendi. bioluminescent sinyal Niceleme PC3M-Luc-C6 hücreleri başarıyla prostat lobları kolonize olduğunu göstermiştir. Artan biyolüminesans deneyi (Şekil 5B)<...

Tartışmalar

Bu el yazması bir insan ortotopik prostat kanseri ksenograft fare modeli oluşturmak için ayrıntılı bir yordam açıklanır. Bu model, bağışıklık yetersizliği olan farelerde dorsal prostat loblar, insan prostat kanseri hücre kuşağı PC3M-Luc-C6 doğrudan implantasyonu ile kurulmuştur. Tümörler deney boyunca gelişmeye bırakılmıştır. Tümör büyüme deney sırasında bir non-invaziv biyoparlaklık görüntüleme sistemi ile haftalık izlendi.

Ksenograft tümör modeller...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
PC3 prostate cancer cell line	ATCC	CRL-1435
Minimum Essential Medium (MEM)	GIBCO,Life Technology	11095-080
PBS	GIBCO,Life Technology	10010-023
FBS	GIBCO,Life Technology	10437-028
Zeocin	Invitrogen,Life Technology	R250-01
Trypsin	GIBCO,Life Technology	25300-54
IVIS	Xenogen-Caliper
Insulin Syringes (300 µl, 28.5 g)	Becton Dickinson	309300
Mice	Charles River Laboratories, Inc
Alcohol Swabs	MEDEquip Depot	326895 BD
PVP Iodine Prep Pad	MEDEquip Depot	C12400PDI
Surgical CatGut Chromic Suture	Demetech	CC224017F0P
Matrigel	Corning	354248