Доклинические Ортотопическая мышиной модели рака простаты человека

Резюме

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

Аннотация

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Введение

Рак предстательной железы является второй наиболее распространенной причиной смерти от рака (9%) среди мужчин в Соединенных Штатах, рядом с раком легких и бронхов (28%) ^1. По последним данным, по оценкам, 220, 800 вновь диагностированных случаев рака простаты и 27 540 смертельных случаев будет происходить в 2015 году ^1. Пятилетняя относительная выживаемость ранней стадии рака простаты> 99% в то время как передовые метастатического заболевания только 28% ^1. Главной проблемой для лечения распространенного метастатического заболевания является отсутствие понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе склонности этого заболевания метастазировать в другие органы, в частности, к кости, которая является частым местом для рака простаты. Следовательно, существует явная необходимость в изучении молекулярной состав этих опухолей предстательной железы с целью разработки эффективных терапевтических схем против прогрессии к расширенному метастатическим ^2,3 заболевания.

Простаты опухолей выставляется HIGч биологическая гетерогенность без четко определенного пути к прогрессированию. Метастазы часто происходят без предварительного указания инвазии опухоли ^4. Эта клиническая гетерогенность приписывается молекулярное разнообразие рака простаты. Понимание молекулярной состав этих смертельных опухолей является ключевым для разработки более диагностических и терапевтических стратегий для этого заболевания. Следовательно, исследование рака простаты в настоящее время сосредоточена на понимании и предотвращении метастазирования.

Доклинические в естественных условиях мышиные модели предлагают различные варианты , чтобы понять молекулярные механизмы прогрессии рака простаты к расширенному метастазами. Кроме того, эти модели имеют важное значение для доклинических оценки новых терапевтических стратегий против этого заболевания. Наиболее часто используемые животные модели включают в себя трансгенные модели мыши, в хвостовую вену, внутрисуставной сердца и имплантации Ортотопическая модели мыши человека. Трансгенные исследования времени Консуминг и корреляция развития рака простаты у мышей с у людей показали изменчивость ^11. В спонтанных метастатических моделях мышей, клетки вводятся непосредственно в кровоток и тем не менее, они имеют быстрое время обработки данных , они не могут быть использованы для изучения первичной опухоли или начальные шаги в метастатического каскада ^5. Ортотопической ксенотрансплантата модели имеют ограничение развития костей метастатических поражений, общий сайт метастазов рака простаты. Тем не менее, ортотопическая рак простаты ксенотрансплантата модель мыши человека является хорошо изученным и широко используется для изучения молекулярных событий развития первичной опухоли, перекрестных помех между опухолью и органов микросреды, начальной стадии метастазирования и использования экспериментальных лекарственных средств для терапевтического вмешательства ^{6 , 7,8-11.}

протокол

Протоколы для всех процедур, связанных с животными, должны быть рассмотрены и одобрены к уходу и использованию комитета (Institutional Animal IACUC) путем. Следуйте официально утвержденных процедур по уходу и использованию лабораторных животных. Intra-простатической инъекции требует открытого абдоминальной хирургии и животные должны храниться в патогена среде с обозначенным хирургии комнате, где используются соответствующие хирургические асептических методов во время всей процедуры.

1. Получение клеток для вживления

Примечание: На основании исследований необходимости, любая линия клеток рака простаты может быть использован. Клеточные линии культивируют в соответствии с инструкциями поставщика.

1. Для клеточной линии PC3M-Luc-C6, который стабильно экспрессирует ген люциферазы светлячка, культуры клеток в минимальной основной среде (MEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 1x несущественные аминокислотах, 1x флеомицин D1 и 1 мМ пирувата натрия , Поддерживать клетки в инкубаторе шIth увлажненной атмосфере 95% воздуха и 5% СО ₂ при 37 ° С. Клетки PC3M-Luc-С6 были закуплены от основного объекта UCSF.
2. Урожай клеток путем обработки трипсином. Мытье культуральные планшеты один раз фосфатным буферным раствором (PBS). Добавить 2 мл 0,05% трипсина на 10 см чашку и инкубировать в течение 3-5 мин в инкубаторе с увлажненной атмосфере 95% воздуха и 5% СО ₂ при 37 ° С до клетки отделяют.
   1. Для того, чтобы избежать образования комков, не агитирую клетки, поражая или встряхивания блюдо во время ожидания клетки отделяться. Собирают клетки в 5 мл полной среды и со спином вниз в течение 5 минут при 200 х г. Промыть осадок клеток с PBS, чтобы удалить трипсина.
3. Перечислять живые клетки с помощью теста с трипановым голубым. Смешайте 10 мкл суспензии клеток в PBS с 10 мкл 0,4% (вес / объем) раствора трипанового синего. Загрузите смесь в гемоцитометра или счетнокамерное горкой и подсчет клеток непосредственно под микроскопом или читать камеры слайд в ячейке CouГюнтер.
   1. Приготовить клеточную суспензию , содержащую 2,5 х 10 ⁵ клеток в 10 мкл среды. Смешайте клеточной суспензии с 10 мкл базальной мембраны, как внеклеточного матрикса экстракта и поместить клетки на льду. Добавить люциферин к клеточной суспензии (1: 200 мкл, что запас 30 мг / мл) концентрации перед инъекцией в организм мышей.
      Примечание: Это позволяет сразу же био-изображений животных, чтобы проверить согласованность клеточных инъекций среди различных экспериментальных групп. Вводят клетки как можно быстрее, желательно в течение 30 минут после того, как трипсином, так как жизнеспособность клеток быстро уменьшается после отрыва.

2. Подготовка хирургической области

1. Выполните операцию в лаконичную, дезинфицируют области, что способствует асептики.
2. Санируйте счетчик / лабораторном столе с отбеливателя раствором перед операцией.
   Примечание: Употребление алкоголя не рекомендуется из-за длительного времени контакта, необходимого для вступили в силу (15 мин).
3. Используйте стерильными пеленками,очистить рассасывающиеся колодки или полотенца, и заменить эти материалы после каждой хирургической сессии. Стерилизовать все инструменты перед использованием. Предпочтительные способы паровой автоклав, стеклянная бусина стерилизатора, окись этилена газ, или перекись водорода стерилизации паром.
4. Используйте асептических очищенную рассекает микроскоп для проведения хирургической процедуры или опытные исследователи могут выполнить его без микроскопа.

3. Имплантация опухолевых клеток

1. Используйте мужской 6-8 неделя старый иммунокомпрометированных BALB / C или NOD / SCID мышей.
   Примечание: Гораздо труднее работать на более мелких животных и крупных животных, как правило, имеют более медленной кинетикой роста опухоли и метастазов.
2. Вводят предоперационного обезболивающее в соответствии с инструкциями животного объекта. Например, могут быть использованы внутрибрюшинном бупренорфин в дозе 0,1 мг / кг массы тела.
3. Обезболить животных, помещая их в изофлурановым камеру с 1-3% изофлуран в кислороде и промэто пока животные не будут полностью под наркозом. Убедитесь в том, что нет никакого пальца ноги рефлекс мышечного тонуса в этой точке. Использование надлежащего ветеринарного глазная мазь смазки, чтобы предотвратить слепоту из-за ксерофтальмии во время общей анестезии.
   Примечание: Обезболить животных предпочтительным методом исследователя , например, для пентобарбиталнатрием, 0,05 мг на грамм веса тела вводят внутрибрюшинно или кетамин раствор / Ксилазина (концентрация: 17,16 мг / мл) в дозе 65 мг / кг массы тела используется подкожно. Изофлюран ингаляция является предпочтительным методом обезболиванием. Глазная мазь следует осторожно применять без трутся роговицы.
4. Удалить животное с изофлуран камеры и помещают в аппарат для носовой конус с непрерывным потоком 1-2% изофлуран в кислороде, чтобы гарантировать, что животное находится под полным обезболиванием, прежде чем продолжить.
   1. Удалить волосы от мышей бритья или использовать для удаления волос крем перед началом процедуры.
      Примечание: Было бы желательно, чтобы поместить курсор мыши над стерильным грелку во время операции.
5. Поместите мышь в положении лежа на спине. Очистите нижнюю часть живота с добавлением 10% вес / вес повидон-йода с последующим 70% смывов этанол.
6. С парой тонких щипцов, поднимите участок кожи 2 мм над препуциальной железы, около 1-2 см выше пениса оболочки и около 2-3 см ниже нижней части грудной клетки.
7. Сделайте срединный разрез 1 см в длину, сначала через кожу с помощью скальпеля , а затем через мышечный слой с ножницами (Рисунок 1).
8. Расположить мочевого пузыря в полости тела. Это желто-светло - коричневый сферический орган, расположенный непосредственно под разрез (рисунок 1).
9. С парой тонких щипцов сцепление мочевого пузыря и поднимите вверх, затем вниз из полости корпуса в направлении пениса оболочки. Это выставит две семенные пузырьки, которые являются пара белых saclike органов и четко различны.
10. Сватный тампон в каждой руке, экстернализовать семенные пузырьки, один за другим, и вытащить их из полости тела и положите их лицевой стороной вниз на внешней поверхности живота с мочевого пузыря в середине (рисунок 2).
11. С помощью ватного тампона, слегка наклонить назад семенные пузырьки в точке вставки вблизи шейки мочевого пузыря, в направлении пениса оболочки, таким образом, что два спинных лепестка простаты четко видны. Используйте влажные ватные тампоны , чтобы избежать повреждения ткани (рисунок 3).
12. Перемешайте суспензии клеток с микропипетки перед загрузкой в ​​шприц.
13. При размещении семенных пузырьков в положении с помощью ватного тампона, вставить иглу шприца в спинной простатической доли под микроскопом (рис 4). Медленно вводят 20 мкл клеточной суспензии до тех пор, пока образование булла идентифицируется. Выпуклым булла указывает на то, что инъекция является правильным.
14. В то время как втягивания иглы, слегка нажмите на месте инъекции сватным тампоном и удерживайте в течение нескольких секунд, чтобы предотвратить утечку.
15. Осторожно поднимите семенные пузырьки с ватные тампоны и вставить их обратно в полость тела один за другим, а затем в мочевой пузырь. Избегайте 'вертела' внутренние органы при выполнении этой процедуры.
16. После размещения органов обратно в полость тела, шовный мышечный слой сначала в прерванного узор с рассасывающиеся 4-0 хромированный кетгут швами с последующим закрытием кожи с нерассасывающегося 4-0 нейлоновой хирургического шва. Кожа также может быть стянуты и закрытые хирургические зажимы, чтобы полностью закрыть разрез.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши имеют привычку царапать и кусать их раны, что может привести к повторному открытию раны, следовательно, использование клея ткани рекомендуется также наряду с швами. Изображение животных сразу, чтобы гарантировать, что есть равной интенсивности биолюминесценции среди всех экспериментальных групп.
17. Возврат животных, чтобы очистить клетки и держать их под лампой или согревающего теплаING площадку. Монитор животных постоянно, пока они полностью не восстановятся от наркоза и поддержания грудины лежачее.

4. Мониторинг животных

1. не Монитор животных регулярно до конца эксперимента, в соответствии с институциональными протоколов. При использовании хирургических металлические зажимы, после того, как удалить одну-две недели. Продолжительность эксперимента зависит от конкретных исследований потребности.
   Примечание: Этот эксперимент был проведен в течение 21 дней, чтобы изучить успешное установление имплантированных раковых клеток в предстательной железе мыши.
2. Администрирование обезболивающее на основе команд животного объекта. Например, внутрибрюшинном бупренорфин в дозе 0,1 мг / кг массы тела может быть использовано во время процедуры со второй дозы через 6 ч, и дополнительные дозы каждые 8-12 ч по мере необходимости.
3. Монитор веса животного, потребление продуктов питания, цвет и текстуру кожи, активность и частоту мочеиспускания и дефекации. Эвтаназии животным IMMEDiately если существует значительная потеря массы тела более чем на 15%.
   1. Для эвтаназии, доставить СО ₂ из резервуара высокого давления в маркированного переполненной клетки со скоростью потока , чтобы сместить 10-30% от камеры или клетке объем / мин, что позволяет СО ₂ , чтобы медленно входить в камеру таким образом , чтобы потери сознания и полной наркотизации происходят до смерти.
   2. Поддержание потока СО ₂ в течение по крайней мере , через одну минуту после остановки дыхания и оставить животных в камере в течение достаточного времени , таким образом , что смерть наступает перед выполнением физического метода.
   3. Выполните обезглавливание, цервикальной дислокации или любой другой IACUC утвержден физический метод после эвтаназии животных химически.
      Примечание: Значительное снижение массы тела часто указывает на летаргический состояние. Животных с опухолью, должны быть в хорошем состоянии для наличия опухолей и до конца эксперимента, за исключением. Эвтаназия должна быть в соответствии с Руководством по АВМА эвтаназии и должны быть Listed в утвержденном протоколе IACUC.

5. Неинвазивная Био-изображений животных

1. Наблюдение за животными в неделю с использованием неинвазивной метод визуализации для отслеживания колонизацию раковых клеток, рост опухоли и любой отдаленными метастазами.
   Примечание: методы визуализации , такие как GFP-визуализации, визуализации люциферазы, рентгеновские лучи или 3D микро-компьютерной томографии (ЕТТ) и т.д. , могут быть использованы на основе конкретных исследований нужны ^12-15.

Результаты

После ортотопической имплантации клеток PC3M-Luc-С6 в заднюю простатической доли мышей еженедельно изображается с использованием животной системы живого биолюминесценции изображений для наблюдения за колонизацию клеток и рост опухоли в течение ходе эксперимента (...

Обсуждение

Эта рукопись описывает детальный порядок создания человеческого ортотопической рака простаты модели ксенотрансплантата мыши. Эта модель была создана путем непосредственной имплантации человеческой клеточной линии рака простаты PC3M-Luc-С6 в спинных простатическими долях иммунодефици...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
PC3 prostate cancer cell line	ATCC	CRL-1435
Minimum Essential Medium (MEM)	GIBCO,Life Technology	11095-080
PBS	GIBCO,Life Technology	10010-023
FBS	GIBCO,Life Technology	10437-028
Zeocin	Invitrogen,Life Technology	R250-01
Trypsin	GIBCO,Life Technology	25300-54
IVIS	Xenogen-Caliper
Insulin Syringes (300 µl, 28.5 g)	Becton Dickinson	309300
Mice	Charles River Laboratories, Inc
Alcohol Swabs	MEDEquip Depot	326895 BD
PVP Iodine Prep Pad	MEDEquip Depot	C12400PDI
Surgical CatGut Chromic Suture	Demetech	CC224017F0P
Matrigel	Corning	354248