Pré-clinique Orthotopique modèle murin de cancer de la prostate humaine

Résumé

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

Résumé

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Introduction

Le cancer de la prostate est la deuxième cause la plus fréquente de décès par cancer (9%) chez les hommes aux États-Unis, à côté d' un cancer du poumon et des bronches (28%) ^1. Selon des données récentes, on estime que 220 ​​800 cas de cancer de la prostate nouvellement diagnostiqués et 27 540 décès auront lieu en 2015 ^1. Le taux de survie relative à cinq ans du début de cancer de la prostate stade est> 99% tandis que celle de la maladie métastatique avancé est seulement 28% ^1. Un défi majeur pour le traitement de la maladie métastatique avancé est le manque de compréhension des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la propension de cette maladie à métastaser à d'autres organes, en particulier à l'os, qui est un site fréquent pour le cancer de la prostate. Par conséquent, il existe un besoin évident d'étudier la composition moléculaire de ces tumeurs de la prostate afin de développer des schémas thérapeutiques efficaces contre la progression à avancé ^2,3 de la maladie métastatique.

Prostate tumeurs présentent high hétérogénéité biologique sans une voie bien définie à la progression. Métastases se produisent souvent sans indication préalable de l' invasivité tumorale ^4. Cette hétérogénéité clinique est attribuée à la diversité moléculaire du cancer de la prostate. Comprendre la composition moléculaire de ces tumeurs mortelles est la clé pour concevoir de meilleures stratégies diagnostiques et thérapeutiques pour cette maladie. Par conséquent, la recherche sur le cancer de la prostate est actuellement axé sur la compréhension et la prévention des métastases.

Modèles de souris pré-cliniques in vivo offrent une variété d'options pour comprendre les mécanismes moléculaires de la progression du cancer de la prostate à la maladie métastatique avancé. En outre, ces modèles sont importants pour les évaluations précliniques de nouvelles stratégies thérapeutiques contre cette maladie. Les modèles animaux les plus couramment utilisés comprennent des modèles transgéniques de souris, l'injection de queue veineuse, l'implantation intra-cardiaque et des modèles de souris orthotopique humains. Les études transgéniques sont consumi de tempsng et la corrélation du développement du cancer de la prostate chez les souris avec celle de l' homme ont montré une variabilité ^11. Dans les modèles spontanés de souris métastatiques, les cellules sont injectées directement dans la circulation et bien, ils ont le temps de réponse rapide, ils ne peuvent pas être utilisés pour étudier la tumeur primaire ou les premières étapes de la cascade métastatique ^5. des modèles de xénogreffes orthotopiques ont la limitation du développement de lésions métastatiques osseuses, le site commun de métastases du cancer de la prostate. Néanmoins, le modèle orthotopique humain du cancer de la prostate de xénogreffe de souris est bien caractérisé et largement utilisé pour étudier les événements moléculaires du développement de la tumeur primaire, diaphonie entre tumeur et microenvironnement d'organes, de la phase initiale de la maladie métastatique et l' utilisation de médicaments expérimentaux pour une intervention thérapeutique ^{6 , 7,8-11.}

Protocole

Protocoles pour toutes les procédures impliquant des animaux doivent être examinés et approuvés par un comité de protection et d'utilisation institutionnelle des animaux (IACUC). Suivre les procédures approuvées officiellement pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. L'injection intra-prostatique nécessite une intervention chirurgicale ouverte abdominale et les animaux doivent être conservés dans un environnement exempt d'agents pathogènes avec une pièce désignée de chirurgie où les techniques aseptiques chirurgicales appropriées sont utilisées pendant toute la procédure.

1. Préparation des cellules pour implantation

REMARQUE: Selon les besoins de recherche, toute lignée cellulaire de cancer de la prostate peut être utilisé. Les lignées cellulaires sont cultivées selon les instructions du fournisseur.

1. Pour la lignée cellulaire PC3M-Luc-C6 qui exprime de façon stable le gène de la luciférase de luciole, des cellules de culture en milieu essentiel minimum (MEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), des acides aminés 1x non essentiels, 1x phléomycine D1 et 1 mM de pyruvate de sodium . Maintenir les cellules dans un incubateur wvec une atmosphère humidifiée de 95% d' air et 5% de CO ₂ à 37 ° C. cellules PC3M-Luc-C6 ont été achetés auprès de l'installation de base UCSF.
2. Récolte des cellules par trypsinisation. Laver les plaques de culture une fois avec du tampon phosphate salin (PBS). Ajouter 2 ml de trypsine à 0,05% dans une boîte de 10 cm et laisser incuber pendant 3-5 min dans un incubateur avec une atmosphère humidifiée de 95% d' air et 5% de _CO2 à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules se détachent.
   1. Pour éviter l'agglutination, ne pas agiter les cellules en frappant ou en secouant le plat en attendant les cellules pour détacher. Recueillir les cellules dans 5 ml de milieu complet et centrifuger pendant 5 minutes à 200 x g. Laver le culot cellulaire avec du PBS pour éliminer la trypsine.
3. Énumérer les cellules vivantes par essai d'exclusion au bleu trypan. Mélanger 10 ul de la suspension cellulaire dans du PBS avec 10 ul de 0,4% (poids / volume) de solution de bleu trypan. Chargez le mélange dans une diapositive hémocytomètre ou chambre de comptage et de compter les cellules immédiatement sous un microscope ou lire la diapositive de chambre dans un cou cellulairenter.
   1. Préparer une suspension de cellules contenant 2,5 x 10 ⁵ cellules dans 10 ul de milieux. Mélanger la suspension cellulaire avec 10 ul de la membrane basale, comme l'extrait de matrice extracellulaire et de placer les cellules sur de la glace. Ajouter luciférine à la suspension cellulaire (1: 200 pi; stocks 30 mg / ml concentration) avant d'injecter à des souris.
      NOTE: Cela permet immédiatement bio-imagerie des animaux pour vérifier la cohérence des injections de cellules entre les différents groupes expérimentaux. Injecter cellules aussi rapidement que possible, de préférence dans les 30 minutes après trypsinisation depuis la viabilité cellulaire diminue rapidement après le détachement.

2. Préparation de la zone chirurgicale

1. Effectuer la chirurgie dans, une zone épurée désinfectée qui favorise l'asepsie.
2. Désinfectez le compteur / banc de laboratoire avec une solution d'eau de Javel avant la chirurgie.
   NOTE: La consommation d'alcool est déconseillée en raison de temps de contact nécessaire pour prendre effet (15 min).
3. Utilisez des champs stériles,nettoyer des tampons ou des serviettes résorbables, et remplacer ces matériaux après chaque session chirurgicale. Stériliser tous les instruments avant de les utiliser. Les procédés préférés sont un autoclave à vapeur, perle de verre stérilisateur, gaz d'oxyde d'éthylène, ou le peroxyde d'hydrogène stérilisation à la vapeur.
4. Utiliser un microscope à dissection aseptique nettoyé pour effectuer la procédure chirurgicale ou des chercheurs expérimentés peuvent effectuer sans un microscope.

3. L'implantation des cellules tumorales

1. Utilisez homme de 6-8 semaines immunodéprimés Balb / c ou des souris NOD / SCID.
   NOTE: Il est plus difficile d'opérer sur des animaux plus petits et plus grands animaux ont tendance à avoir une cinétique plus lente de la croissance tumorale et les métastases.
2. Injecter des médicaments contre la douleur pré-opératoire selon les instructions de l'installation animale. Par exemple, la buprénorphine intrapéritonéale à une dose de 0,1 mg / kg de poids corporel peut être utilisé.
3. Anesthésier les animaux en les plaçant dans une chambre d'isoflurane avec 1-3% d'isoflurane dans de l'oxygène et wajusqu'à ce que les animaux sont complètement anesthésiés. Assurez-vous qu'il n'y a pas toe réflexe du tonus musculaire à ce stade. Utilisez vétérinaires appropriés pommade ophtalmique lubrifiante pour prévenir la cécité due à la xérophtalmie pendant l'anesthésie générale.
   NOTE: Anesthetize les animaux par la méthode préférée , par exemple de l'enquêteur, pour pentobarbital de sodium, 0,05 mg par poids corporel de gramme est administré intra-péritonéale ou kétamine / solution de Xylazine (concentration: 17,16 mg / ml) à une dose de 65 mg / kg de poids corporel est utilisé sous-cutanée. par inhalation d'isoflurane est un procédé préféré de l'anesthésie. La pommade oculaire doit être appliquée doucement sans frotter contre la cornée.
4. Retirer l'animal de la chambre isoflurane et le placer dans un appareil de cône de nez avec un flux continu de 1-2% d'isoflurane dans de l'oxygène pour assurer que l'animal est sous anesthésie générale avant de poursuivre.
   1. Enlever les poils de souris par le rasage ou utiliser une crème épilatoire avant de commencer la procédure.
      NOTE: Il serait préférable de placer la souris sur un coussin chauffant stérile pendant la chirurgie.
5. Placez la souris dans une position couchée. Nettoyer l'abdomen inférieur à 10% en poids / poids solution de povidone-iode suivi par 70% des prélèvements d'éthanol.
6. Avec une paire de pinces fines, soulever une zone de peau 2 mm au-dessus de la glande préputiale, environ 1-2 cm au-dessus de la gaine du pénis, et environ 2-3 cm en dessous du bas de la cage thoracique.
7. Faire une incision de 1 cm de la ligne médiane de la longueur, tout d' abord à travers la peau avec un scalpel, puis à travers la couche musculaire avec une paire de ciseaux (figure 1).
8. Localiser la vessie dans la cavité du corps. Il est un organe sphérique jaune brun-clair, situé directement sous l'incision (Figure 1).
9. Avec une paire de pinces fines saisir la vessie et soulever vers le haut puis vers le bas de la cavité du corps vers la gaine du pénis. Cela permettra d'exposer les deux vésicules séminales qui sont une paire de blancs organes en forme de sac et clairement distincts.
10. Avec uncoton - tige dans chaque main, extériorisent les vésicules séminales, un par un, et les sortir de la cavité du corps et se trouvait face cachée sur la surface extérieure de l'abdomen avec la vessie au milieu (Figure 2).
11. En utilisant les tampons de coton, inclinez doucement les vésicules séminales au point d'insertion à proximité du col de la vessie, vers la gaine du pénis, de sorte que les deux lobes de la prostate dorsale sont clairement visibles. Utilisez des cotons - tiges humides pour éviter des dommages aux tissus (figure 3).
12. Agiter la suspension cellulaire avec une micropipette avant le chargement dans la seringue.
13. En plaçant les vésicules séminales en position avec un coton - tige, insérer l'aiguille de la seringue dans le lobe dorsal de la prostate sous le microscope (figure 4). Injecter lentement 20 ul de suspension cellulaire jusqu'à une formation de bulle est identifiée. Une bulle bombée indique que l'injection est correcte.
14. Alors que la rétraction de l'aiguille, appuyez légèrement sur le site d'injection avecun coton-tige et maintenez pendant quelques secondes pour éviter les fuites.
15. Soulevez délicatement les vésicules séminales avec des cotons-tiges et insérez-les dans la cavité du corps, un par un suivi de la vessie. Évitez 'virevoltant' les organes internes pendant cette procédure.
16. Après avoir placé les organes dans la cavité du corps, le fil de suture de la couche musculaire d'abord dans un motif interrompu par 4-0 absorbable catgut chromique suivie par la fermeture de la peau non absorbable suture chirurgicale de nylon 4-0. La peau peut également être tiré ensemble et fermé avec des pinces chirurgicales pour fermer l'incision complètement.
    NOTE: Les souris ont l'habitude de se gratter et mordre à leur blessure, ce qui peut conduire à la réouverture de la plaie, d'où l'utilisation de colle tissulaire est également recommandée avec sutures. animaux de l'image immédiatement pour assurer qu'il y ait une intensité bioluminescente égale entre tous les groupes expérimentaux.
17. Remettre les animaux pour nettoyer les cages et les garder sous une lampe chauffante ou à la chaleuring pad. Surveiller les animaux en permanence jusqu'à ce qu'ils récupèrent complètement de l'anesthésie et de maintenir décubitus sternale.

4. Surveillance des animaux

1. Surveiller les animaux régulièrement jusqu'à la fin de l'essai, selon des protocoles institutionnels. Si vous utilisez des clips métalliques chirurgicales, retirer après une à deux semaines. Durée de l'expérience dépend de la nécessité de recherche spécifique.
   REMARQUE: Cette expérience a été menée pendant 21 jours pour examiner la mise en place réussie des cellules cancéreuses de la prostate implantées dans la souris.
2. Administrer des médicaments de la douleur sur la base des instructions de l'installation des animaux. Par exemple, la buprénorphine intrapéritonéale à une dose de 0,1 mg / kg de poids corporel peut être utilisé au moment de l'opération avec une seconde dose après 6 h et toutes les doses supplémentaires de 8 à 12 h selon les besoins.
3. Surveiller le poids des animaux, la consommation alimentaire, la couleur de la peau et la texture, l'activité et la fréquence de la miction et la défécation. Euthanasier animaux immediately s'il y a une perte significative de poids corporel supérieur à 15%.
   1. Pour l' euthanasie, livrer CO ₂ à partir d' un réservoir sous pression dans une cage non encombrée à un débit pour déplacer 10-30% de la chambre ou de la cage de volume / minute, ce qui permet de CO ₂ pour entrer dans la chambre lentement pour que narcotisation inconscience et complète se produit avant la mort.
   2. Maintenir CO ₂ flux pendant au moins une minute après l' arrêt respiratoire et de laisser les animaux dans la chambre pendant un temps suffisant pour que la mort se produit avant d'effectuer une méthode physique.
   3. Effectuer la décapitation, la dislocation cervicale ou tout autre IACUC approuvé la méthode physique après euthanasier les animaux chimiquement.
      REMARQUE: le poids corporel significativement réduite indique souvent une condition léthargique. Tumoraux animaux porteurs doivent être en bonne santé, sauf pour la présence de tumeurs jusqu'à la fin de l'expérience. Euthanasie devrait être conforme aux lignes directrices de l'AVMA sur l'euthanasie et doit être listed dans le protocole IACUC approuvé.

Bio-imagerie 5. Non-invasive des animaux

1. Surveiller les animaux chaque semaine à l'aide d'une technique d'imagerie non invasive pour suivre la colonisation des cellules cancéreuses, la croissance tumorale et des métastases à distance.
   NOTE: modalités d'imagerie telles que la GFP-imagerie, l' imagerie de la luciférase, les rayons X ou 3D micro-tomographie par ordinateur (UCT) , etc. , peuvent être utilisés en fonction de la recherche spécifique ont besoin ^12-15.

Résultats

Après l' implantation orthotopique de cellules PC3M-Luc-C6 dans le lobe de la prostate postérieure, les souris ont été hebdomadaire imagés en utilisant un système d'imagerie par bioluminescence d'animaux vivants pour contrôler la colonisation des cellules et la croissance des tumeurs au cours de l' expérience (Figure 5A - B). Quantification du signal bioluminescent a indiqué que les cellules PC3M-Luc-C6 colonisé avec succès les...

Discussion

Ce manuscrit décrit une procédure détaillée pour établir un modèle de xénogreffe de souris humaine orthotopique de cancer de la prostate. Ce modèle a été mis en place par implantation directe de la lignée cellulaire du cancer de la prostate humain PC3M-Luc-C6 dans les lobes prostatiques dorsale de souris immunodéprimées. Les tumeurs ont été autorisés à se développer au cours de l'expérience. La croissance tumorale a été surveillée toutes les semaines par un système d'imagerie par biolumine...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PC3 prostate cancer cell line	ATCC	CRL-1435
Minimum Essential Medium (MEM)	GIBCO,Life Technology	11095-080
PBS	GIBCO,Life Technology	10010-023
FBS	GIBCO,Life Technology	10437-028
Zeocin	Invitrogen,Life Technology	R250-01
Trypsin	GIBCO,Life Technology	25300-54
IVIS	Xenogen-Caliper
Insulin Syringes (300 µl, 28.5 g)	Becton Dickinson	309300
Mice	Charles River Laboratories, Inc
Alcohol Swabs	MEDEquip Depot	326895 BD
PVP Iodine Prep Pad	MEDEquip Depot	C12400PDI
Surgical CatGut Chromic Suture	Demetech	CC224017F0P
Matrigel	Corning	354248