Preparación y caracterización de lipofílico Doxorrubicina micelas profármaco

Resumen

Un protocolo para la preparación y caracterización de doxorrubicina lipofílica profármaco cargado 1,2-sn distearoyl- glicero-3-phosphoethanolamine- N - [amino (polietilenglicol) -2000] se describe (DSPE-PEG) micelas.

Resumen

Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous environment through self-assembly. The hydrophobic core of micelles functions as a drug reservoir and encapsulates hydrophobic drugs. The hydrophilic shell prevents the aggregation of micelles and also prolongs their systemic circulation in vivo. In this protocol, we describe a method to synthesize a doxorubicin lipophilic pro-drug, doxorubicin-palmitic acid (DOX-PA), which will enhance drug loading into micelles. A pH-sensitive hydrazone linker was used to conjugate doxorubicin with the lipid, which facilitates the release of free doxorubicin inside cancer cells. Synthesized DOX-PA was purified with a silica gel column using dichloromethane/methanol as the eluent. Purified DOX-PA was analyzed with thin layer chromatography (TLC) and ¹H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (¹H-NMR). A film dispersion method was used to prepare DOX-PA loaded DSPE-PEG micelles. In addition, several methods for characterizing micelle formulations are described, including determination of DOX-PA concentration and encapsulation efficiency, measurement of particle size and distribution, and assessment of in vitro anticancer activities. This protocol provides useful information regarding the preparation and characterization of drug-loaded micelles and thus will facilitate the research and development of novel micelle-based cancer nanomedicines.

Introducción

La quimioterapia se utiliza comúnmente para tratar varias formas de cáncer. La mayoría, si no todos, los medicamentos de quimioterapia tienen efectos secundarios tóxicos que pueden variar de leves condiciones manejables, tales como náuseas y diarrea, a las condiciones que amenazan la vida más. Debido a que la mayoría de los medicamentos contra el cáncer son tóxicos, la exposición no selectiva de estos fármacos para el tejido normal inevitablemente causa toxicidad. Por lo tanto, hay una gran necesidad de un enfoque terapéutico que puede ofrecer selectivamente fármacos en células cancerosas. Otro de los desafíos con la administración de medicamentos contra el cáncer es su escasa solubilidad en agua. Por lo general, se necesitan agentes solubilizantes para formular estos fármacos poco solubles. Sin embargo, la mayoría de agentes solubilizantes, tales como sulfóxido de dimetilo (DMSO), Cremophor EL, y polisorbato 80 (Tween 80) puede causar toxicidad hepática y renal, hemólisis, reacciones de hipersensibilidad agudas y neuropatías periféricas. ¹ Por lo tanto, se necesitan formulaciones seguras y biocompatibles para el uso clínico de pobremedicamentos contra el cáncer Ly solubles. Nanoportadores son prometedores sistemas de administración de fármacos para hacer frente a los retos anteriores. Estos nanoportadores incluyen liposomas, nanopartículas ^{2, 3, 4-7} micelas conjugados polímero-fármaco, ⁸ y materiales inorgánicos. ⁹ Varios productos de nanomedicina (por ejemplo, Doxil, Abraxane, y Genexol) han sido aprobados por las agencias reguladoras para el tratamiento de pacientes con cáncer. ¹⁰

Las micelas poliméricas son prometedores portadores de administración de fármacos a nanoescala, que se han utilizado con éxito para el suministro de fármacos contra el cáncer. ^4-7,11,12 micelas poliméricas típicos se preparan a partir de polímeros anfífilos a través de un proceso de autoensamblaje. Las micelas poliméricas estructurados de núcleo-envoltura incluyen una vaina hidrófila y un núcleo hidrofóbico. La envoltura hidrofílica puede estabilizar estéricamente micelas y prolongar su circulación en el torrente sanguíneo. El núcleo hidrofóbico puede resumir eficazmente d hidrófoboalfombras. Debido al pequeño tamaño de las micelas (normalmente menos de 200 nm) y las propiedades de circulación largo, se cree que las micelas poliméricas para lograr tumor de orientación a través de efectos de retención (EPR) (tumor pasiva focalización) aumento de la permeabilidad y.

estabilidad carga de fármaco es crítica para el tumor capacidad de las micelas de orientación. Para lograr la orientación óptima del tumor, micelas deben tener fugas mínimas de drogas antes de llegar al sitio del tumor, sin embargo, la liberación rápida del fármaco después de entrar en las células cancerosas. Además, estabilidad de la formulación es también un requisito esencial para el desarrollo de productos, porque la estabilidad formulación determina la viabilidad de desarrollo de productos, así como la vida útil de los productos desarrollados. Recientemente, se han hecho muchos esfuerzos para mejorar la carga de fármacos en vehículos de entrega. El enfoque de profármaco lipófilo es una estrategia que ha sido explorado para mejorar la carga de fármaco en nanopartículas lipídicas y emulsiones. ^13,14 El conjugation de lípidos con fármacos puede mejorar significativamente su lipofilia y mejorar la carga y la retención de los componentes lipófilos de nanoportadores.

A continuación, se describe un protocolo para la preparación de doxorrubicina lipofílica micelas cargadas de profármaco. En primer lugar, se describe el procedimiento para la síntesis de doxorrubicina lipofílica profármaco. A continuación, se introduce un protocolo para generar micelas con un método de película de dispersión. Este método ha sido utilizado con éxito en nuestros estudios anteriores. ⁵ DSPE-PEG fue seleccionado como el material de soporte para la preparación de micelas, ya que ha sido utilizado con éxito para la administración de fármacos micela. ^15,16 Finalmente, se describen varios ensayos in vitro utilizados para caracterizar micela formulaciones y para evaluar la actividad contra el cáncer.

Protocolo

1. Síntesis de DOX-PA

1. Pesar 390 mg de doxorrubicina y 243 mg de hidrazida de ácido palmítico, y transferir a un matraz de fondo redondo.
2. Añadir 150 ml de metanol anhidro al matraz con una jeringa de vidrio. Añadir 39 l de ácido trifluoroacético (TFA) con una pipeta. El uso de un agitador magnético, se agita la mezcla de reacción durante 18 horas a RT en la oscuridad.
   NOTA: Las cantidades de materiales de reacción se pueden escalar hacia arriba o hacia abajo para obtener diferentes cantidades de DOX-PA. La relación de los reactivos debe mantenerse en las mismas proporciones. Las reacciones que utilizan cantidades de DOX en el intervalo de 78 mg a 1170 mg se pueden realizar en un laboratorio de química regular.
3. Purificación de DOX-PA utilizando una columna de gel de sílice. ¹⁷
   1. Eliminar el disolvente en la mezcla de reacción con un evaporador rotatorio. Añadir 3 g de gel de sílice después de la volumen de la mezcla se reduce a alrededor de 20 ml. Continuar evaporación giratoria para producir polvos secos y para permitir tque la adsorción de los productos en el gel de sílice. Mantenga la muestra bajo un vacío durante 30 minutos más después de que se formaron los polvos secos.
   2. Paquete de 50 g de gel de sílice en una columna utilizando diclorometano como disolvente. añadir con cuidado la muestra de gel de sílice que contiene el producto adsorbido a la columna.
   3. Eluir la columna con una mezcla de diclorometano y metanol, al tiempo que aumenta gradualmente el porcentaje de metanol, lo que aumenta la polaridad del disolvente (Tabla 1).
   4. Recoger fracciones de eluyente en tubos de ensayo (25 ml / tubo) y controlar el progreso por cromatografía de capa fina (TLC).
   5. Combinar todas las fracciones que contienen puro DOX-PA y eliminar el disolvente utilizando un evaporador rotatorio hasta que se forma de polvo seco. secar aún más el producto bajo un vacío de O / N.
4. Análisis de DOX-PA por TLC.
   1. Corte una sección cm x 8 cm 4 de la placa de TLC. soluciones de muestras puntuales, 0,5 cm desde la parte inferior de la placa de TLC con capilares manchado utilizando cumplenHanol como disolvente.
   2. Coloque la placa de TLC en una cámara de revelado que contiene una mezcla de diclorometano y metanol (3/1, v / v). La profundidad de disolvente debe ser un poco menos de 0,5 cm.
   3. Retirar la placa de la cámara de revelado cuando el frente del disolvente alcance la parte superior de la placa. Marque la ubicación del frente de disolvente con un lápiz y dejar que la placa se seque. Coloque la placa de TLC en una cámara de tinción que contiene vapor de yodo saturada con el fin de visualizar las muestras.
5. Análisis de DOX-PA con ¹ H-Nuclear Espectroscopía de Resonancia Magnética ⁽¹ H-NMR). ¹⁸
   1. Disolver 15 mg de DOX-PA en 1 ml de metil sulfóxido-d6 (DMSO) y la transferencia de la muestra en un tubo de RMN.
   2. Insertar el tubo de RMN en el imán del instrumento de RMN. Medir el espectro de protón, la selección de DMSO como disolvente. Retire el tubo de RMN del imán. Analizar el resultado de RMN ^18.

2. Preparación de DOX-PA micelas por el Método de Cine de dispersión

1. Disolver DSPE-PEG (40 mg) y DOX-PA (4 mg) con 2 ml de metanol en un vial de vidrio de 10 ml.
2. Eliminar el disolvente orgánico bajo vacío usando un evaporador rotatorio hasta que se forme una fina película en el vial.
   NOTA: Como alternativa, se evaporan los disolventes orgánicos bajo gas inerte (por ejemplo, gas argón o nitrógeno) para formar una película y mantener el vial en un desecador de vacío para eliminar adicionalmente el disolvente residual.
3. Transferencia de 2 ml de solución salina de Dulbecco tamponada con fosfato (pH 7,4, DPBS) al vial de vidrio.
4. Colocar el vial en un baño de ultrasonidos durante 3 minutos a temperatura ambiente para generar micelas.
   NOTA: La energía ultrasónica varía entre los diferentes modelos de baños de ultrasonidos. Seleccione una unidad que puede generar energía ultrasónica suficiente para dispersar a la película de polímero / fármaco delgada. La potencia de salida del baño de ultrasonidos utilizado en este protocolo es de 110 W.
5. Mantenga micelas a 4 ° C para el almacenamiento a corto plazo y -20 ° C durante largo-term de almacenamiento.
   NOTA: Como alternativa, las micelas también pueden ser liofilizado y reconstituido con agua antes de su uso. Por lo general, no se necesita ningún crioprotector o lioprotector para esta formulación.

3. Caracterización de DOX-PA micelas

1. Determinación de la concentración de DOX-PA en micelas y la eficiencia de encapsulación de drogas
   1. Disolver DOX-PA sintetizado en los pasos anteriores en DMSO para preparar soluciones de DOX-PA de cinco concentraciones diferentes: 1 g / ml, 5 mg / ml, 20 mg / ml, 50 mg / ml, y 100 mg / ml. Medir la absorción de las soluciones de DOX-PA con un espectrómetro de UV-VIS a 490 nm. Generar una curva estándar en base a las concentraciones de fármaco DOX-PA y su correspondiente absorción a 490 nm.
   2. Diluir 25 l de micela cargada de fármaco con 500 l de DMSO. Medir la absorción a 490 nm con un espectrómetro UV-VIS. Calcular las concentraciones de fármaco con la curva estándar generada en el punto 3.1.1.
   3. Calcular la eficiencia de encapsulación usando la siguiente ecuación:
      Eficiencia de encapsulación de Drogas (%) = (cantidad de fármacos en micelas) / (cantidad de fármaco añadido) x 100%
2. Caracterización del tamaño de partícula con dispersión de luz dinámica (DLS)
   1. Diluir micelas con DPBS (pH 7,4) a una concentración final DSPE-PEG de 1 mg / ml. Analizar una muestra de 2 ml con un analizador de tamaño de partícula para obtener el tamaño y la polidispersidad índice promedio Z (PDI).
3. Evaluación de la actividad contra el cáncer in vitro
   NOTA: Utilice una técnica estéril apropiada y operar dentro de una cabina de bioseguridad.
   1. Retirar el medio de cultivo de células de un matraz de cultivo celular (por ejemplo, T25) que contiene DU-145 células de cáncer de próstata humano y enjuagar las células con 2 ml de DPBS (pH 7,4).
   2. Aspirar DPBS, añadir 1 ml de solución de tripsina (0,25%), y se incuba durante 2 min a 37 ° C para separar las células.
   3. Añadir 10 ml de medio de cultivo celular (RPMI 1640 + 10% de suero fetal bovino + 1% de antibiótico-antimicótico), cuando la mayoría de las células se separaron del matraz. La transferencia de células a un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugar las células a 1.000 xg durante 5 min.
   4. Vuelva a suspender el sedimento celular con 5 ml de medio de cultivo celular y retirar una muestra para contar el número de células con un hemocitómetro. Diluir las células con medio de cultivo celular a una densidad de 50.000 células / ml. Añadir las suspensiones de células se diluyeron en una placa de cultivo celular de 96 pocillos (100 l / pocillo). Se incuban las células en un incubador de cultivo celular (37 ° C, 5% de CO ₂₎ durante 18 horas para permitir la unión celular.
   5. Diluir DOX dimetil sulfóxido solución (DMSO) y solución de DOX-PA DMSO con medio de cultivo celular para obtener las concentraciones finales de fármaco de 0,1 M, 0,5 M, 2 M, 5 M, y 10 mM, respectivamente. Mantener la concentración final de DMSO en todas las muestras anteriores a 0,5%. Diluir micela DOX-PA con medio de cultivo celular para obtener co fármaco finalncentrations de 0,1 M, 0,5 M, 2 M, 5 M, y 10 micras, respectivamente. Utilizar el medio de cultivo celular en blanco un control.
   6. Retire la placa de cultivo celular de 96 pocillos de la incubadora y reemplazar el medio de cultivo celular con 100 l de medio que contienen diferentes agentes de tratamiento preparados en la etapa 3.3.5 (n = 4 para cada grupo). Se incuban las células en la incubadora de cultivo celular (37 ° C, 5% de CO ₂₎ para un 72 hr adicional.
   7. Aspirar el medio y añadir 100 l de medio que contenía 0,5 mg / ml de 3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio (MTT).
   8. Se incuban las células en la incubadora de cultivo celular para 2 h adicionales. Retirar con cuidado el medio y añadir 100 l de DMSO para disolver los cristales de formazán.
   9. Medir la absorbancia con el espectrofotómetro de microplacas a una longitud de onda de 570 nm y una longitud de onda de referencia de 670 nm.
   10. Calcular la viabilidad celular usando la siguiente ecuación:
       Viabilidad celular (%) = (A _Prueba / A _{de control)} x 100%
       NOTA: Comparación de la viabilidad celular entre diferentes grupos usando un análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) prueba estadística. Calcular el IC ₅₀ basado en la viabilidad celular frente a los datos de concentración del fármaco.

Resultados

La Figura 1 muestra el esquema de síntesis de DOX-PA. DOX-PA fue sintetizado mediante conjugación de ácido palmítico con doxorubicina a través de un enlace hidrazona sensible al pH. Un ligero exceso de hidrazida de ácido palmítico se utilizó para facilitar la finalización de la reacción. Este método de reacción tiene una eficacia muy alta y sólo una pequeña cantidad de doxorrubicina se mantuvo después de una reacción de 18 h (Figura 2). E...

Discusión

En este trabajo se describe un método película de dispersión sencilla, rápida para la preparación de las micelas. Este método utiliza las propiedades de autoensamblaje de un polímero anfifílico (por ejemplo, DSPE-PEG) para formar micelas de núcleo-envuelta estructurados en un entorno acuoso. Este método de preparación de micelas tiene varias ventajas. 1. Se trata de un proceso de formulación simple, que evita el uso de pasos de reducción de tamaño complicadas (tales como la extrusión u homogeneiz...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DSPE-PEG2K	Cordenpharm	LP-R4-039	>95%
Doxorubicin	LC Laboratories	D-4000	>99%
Palmitic Acid Hydrazide	TCI AMERICA	P000425G	>98.0%
Methanol	ACROS Organics	610981000	Anhydrous
Methylene chloride	FISHER	D151-4	99.90%
Methyl sulfoxide-d6	ACROS Organics	AC320760075	NMR solvent
Trifluoroacetic Acid	ACROS Organics	AC293811000	99.50%
Silica Gel	FISHER	L-7446	230-400 mesh
Baker Flex TLC Plates	FISHER	NC9990129
DPBS	Sigma-Aldrich	D8537
DU 145  Prostate Cancer Cells	ATCC	HTB-81
MTT	ACROS Organics	158990050	98%
RPMI 1640 Medium	MEDIATECH INC	10041CV
Antibiotic-Antimycotic	LIFE TECHNOLOGIES	15240062	100x stock solution
Fetal Bovine Serum	LIFE TECHNOLOGIES	10437077
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy	Varian, Inc		300 NMR
Büchi R-3 Rotavapor	Buchi	1103022V1	Rotary evaporator
Ultrasonic Bath	BRANSON ULTRASONICS CORPORATION	CPX952318R
UV-VIS spectrometer Biomate 3	Thermo Spectronic
Zetasizer Nano ZS90	Malvern Instruments		Particle Size Analyer
Microplate Spectrophotometer	Rio-Rad	Benchmark Plus
Cell Culture Incubator	Napco	CO2 6000
Biological Safety Cabinet	Nuaire
SigmaPlot	Systat Software, Inc.		Analytical Software
96-Well Cell Culture Plate	Becton Dickinson	353072
Trypsin  0.25%	Corning Cellgro	25-053-CI