Lipofilik Doksorubisin Pro-ilaç misellerin Hazırlanması ve Karakterizasyonu

Özet

Lipofilik doksorubisin ön-ilacın hazırlanması ve tanımlanması için bir protokol, 1,2-distearoil, sn -glisero-3-phosphoethanolamine- N yüklü - [amino (polietilen glikol) -2000] (DSPE-PEG) miseller anlatılmıştır.

Özet

Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous environment through self-assembly. The hydrophobic core of micelles functions as a drug reservoir and encapsulates hydrophobic drugs. The hydrophilic shell prevents the aggregation of micelles and also prolongs their systemic circulation in vivo. In this protocol, we describe a method to synthesize a doxorubicin lipophilic pro-drug, doxorubicin-palmitic acid (DOX-PA), which will enhance drug loading into micelles. A pH-sensitive hydrazone linker was used to conjugate doxorubicin with the lipid, which facilitates the release of free doxorubicin inside cancer cells. Synthesized DOX-PA was purified with a silica gel column using dichloromethane/methanol as the eluent. Purified DOX-PA was analyzed with thin layer chromatography (TLC) and ¹H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (¹H-NMR). A film dispersion method was used to prepare DOX-PA loaded DSPE-PEG micelles. In addition, several methods for characterizing micelle formulations are described, including determination of DOX-PA concentration and encapsulation efficiency, measurement of particle size and distribution, and assessment of in vitro anticancer activities. This protocol provides useful information regarding the preparation and characterization of drug-loaded micelles and thus will facilitate the research and development of novel micelle-based cancer nanomedicines.

Giriş

Kemoterapi genellikle çeşitli kanser tiplerini tedavi etmek için kullanılır. hepsi değilse de çoğu, kemoterapi ilaçları daha fazla yaşamı tehdit eden koşullara, bulantı ve ishal gibi yönetilebilir küçük koşullar değişebilir toksik yan etkileri vardır. En antikanser ilaçların toksik olduğundan, normal dokuya bu ilaçların seçici olmayan maruz kaçınılmaz toksisiteye neden olur. Bu nedenle, seçici bir şekilde kanser hücrelerine ilaç teslim bir terapötik yaklaşım için büyük bir ihtiyaç vardır. antikanser ilaçların verilmesi ile diğer zorluk da kötü su çözünürlüğü olduğunu. Genellikle, çözündürücü maddeler, bu az çözünen ilaçların formüle edilmesi gereklidir. Bununla birlikte, dimetil sülfoksit gibi en çözündürücü maddeler, (DMSO), Cremophor EL, ve polisorbat 80 (Tween 80), karaciğer ve böbrek toksisitesi, hemoliz, akut yüksek tansiyon tepkilerine ve periferal nöropatiler neden olabilir. ¹ Bu nedenle, güvenli ve biyo-uyumlu formülasyonlar için gerekli olan yoksul klinik kullanımıly çözünür antikanser ilaçlar. Nanocarriers yukarıdaki zorlukları ele almak için ilaç taşıyıcı sistemleri umut vericidir. Bu nanocarriers lipozomlar, ² nano-tanecikleri, ³ miseller, ^4-7, polimer-ilaç konjügatları, ⁸ ve inorganik malzemeler bulunmaktadır. ⁹ Çeşitli Nanomedicine ürünleri (örneğin, Doxil, Abraxane ve Genexol) kanser hastalarının tedavisinde düzenleyici kurumlar tarafından onaylanmıştır. ¹⁰

Polimerik miseller başarılı antikanser ilaçların verilmesi için kullanılan nano ölçekli ilaç verme taşıyıcılar, umut vericidir. ^4-7,11,12 tipik bir polimerik miseller kendinden montaj işlemi boyunca amfifil polimerlerle hazırlanır. Çekirdek-kabuk yapılı polimer miseller bir hidrofilik ve bir hidrofobik kabuk çekirdek bulunmaktadır. hidrofil kabuk sterik miseller stabilize ve kanda kendi dolaşımını uzatabilir. hidrofobik çekirdek etkin bir şekilde hidrofobik d sarabilirizkilim. Çünkü miseller (tipik olarak en az 200 nm) ve uzun sirkülasyon özelliklerinin küçük boyutu, polimerik miseller gelişmiş geçirgenlik ve tutma (EPR) etkileri (pasif tümör hedefleme) ile hedef tümör elde inanılmaktadır.

İlaç yükü stabilite miseller yeteneğini hedef tümör için önemlidir. Optimal tümör hedefleme ulaşmak için, misel tümör sitesine ulaşmadan önce en az ilaç sızıntısı, henüz hızlı bir şekilde kanser hücrelerini girdikten sonra ilacı tahliye edilmelidir. formülasyon istikrar ürün geliştirme fizibilite yanı sıra geliştirilen ürünlerin raf ömrünü belirler, çünkü ek olarak, formülasyon stabilitesi, aynı zamanda ürün geliştirme için temel bir gerekliliktir. Son zamanlarda, çok çaba dağıtım taşıyıcılara ilaçların yükleme geliştirmek için yapılmıştır. Lipofilik ön-ilaç bir yaklaşım lipit nanopartiküller ve emülsiyonlar halinde ilaç yüklemesine geliştirmek için araştırılmaktadır bir stratejidir. ^13,14 conjilaçlarla lipidlerin ugation önemli ölçüde iyileştirmek ve lipofilliğini nanocarriers lipofilik bileşenleri yükleme ve tutma artırabilir.

Burada, lipofilik doksorubisin yanlısı ilaç yüklü miseller hazırlamak için bir protokol açıklar. İlk olarak, lipofilik yanlısı ilaç doksorubisin için sentez prosedürü tarif edilmektedir. Daha sonra, bir film-dispersiyon yöntemi ile miseller oluşturmak için bir protokol verilmektedir. Bu yöntem, başarılı bir şekilde daha önceki çalışmalarda kullanılmıştır. ⁵ DSPE-PEG başarıyla misel ilaç verilmesi için kullanılmıştır, çünkü miseller hazırlanması için taşıyıcı malzeme olarak seçilmiştir. ^15,16 Son olarak, misel karakterize etmek için kullanılan çeşitli in vitro analizler açıklanmaktadır formülasyonlar ve antikanser aktivitesini değerlendirmek için.

Protokol

DOX-PA 1. Sentezi

1. Doksorubisinin 390 mg ve palmitik asit hidrazid 243 mg ağırlığında ve yuvarlak dipli bir şişeye aktarın.
2. cam şırınga ile şişeye susuz metanol 150 ml ekleyin. bir pipet ile trifloroasetik asit (TFA) 39 ul ekle. Manyetik bir karıştırıcı kullanarak, karanlıkta, oda sıcaklığında 18 saat boyunca reaksiyon karışımının karıştırın.
   NOT: Reaksiyon malzemelerin miktarları kadar ölçeklendirilebilir veya aşağı DOX-PA farklı miktarlarda elde etmek için. reaktiflerin oranı, aynı oranlarda muhafaza edilmelidir. 78 mg 1.170 mg aralığında DOX miktarlar kullanılarak reaksiyonlar düzenli kimya laboratuvar gerçekleştirilebilir.
3. Bir silika jel kolonu kullanılarak DOX-PA ile saflaştırılması. ^17.
   1. Bir dönen buharlaştıncı ile reaksiyon karışımında çözücüyü çıkarın. Karışımın hacmi yaklaşık 20 ml azaltılmış sonra, silika jel, 3 g ekleyin. kuru tozlar elde etmek için döner buharlaştırma devam edin ve t sağlamak içinO silika jel üzerine ürünlerin adsorplanmadan. Kuru tozlar oluştuktan sonra ilave bir 30 dakika boyunca vakum altında örnek tutun.
   2. bir çözücü olarak diklorometan kullanılarak bir sütun halinde, silika jel 50 g paketleyin. Dikkatle kolonuna adsorbe ürün silika jel içeren bir örnek ilave edin.
   3. Yavaş yavaş ve böylece çözücünün polaritesi (Tablo 1), artan metanol yüzdesi artırırken, bir diklorometan ve metanol karışımı ile sütun yıkayın.
   4. Test tüpleri içinde eluent fraksiyonlar (25 mi / tüp) toplayın ve ince tabaka kromatografisi (TLC) ile ilerlemesini izlemek.
   5. Saf DOX-PA içeren tüm fraksiyonlar birleştirilir ve kuru toz elde edilinceye kadar, bir döner evaporatör kullanılarak solvent çıkartılmıştır. Bundan başka, bir vakum O / N ve ürünle kurutun.
4. TLC ile DOX-PA analizi.
   1. TLC plakası bir 4 cm x 8 cm uzunluğunda kesilir. TLC tespit kılcal damarların ile plakanın alt spot örnek çözümler 0.5 cm buluştu kullanarakçözücü olarak HANOL.
   2. diklorometan ve metanol karışımı içeren bir geliştirme odasına TLC plakasını (3/1, hac / hac). Çözücünün derinliği 0.5 cm sadece az olmalıdır.
   3. Çözücü ön plaka üst ulaştığında gelişmekte odasından plakasını sökün. Bir kalemle çözücü ön yerini işaretlemek ve plaka kurumasını bekleyin. örnekleri görselleştirmek için doymuş iyodin buharı ihtiva eden bir boyama odasına TLC plakasını.
5. ^1H-Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ⁽¹ 'H-NMR) ile DOX-PA analizi. ¹⁸
   1. metil sülfoksit-d6 (DMSO) içinde 1 ml DOX-PS 15 mg çözülür ve bir NMR tüpü içine örnek aktarmak.
   2. NMR aracın cazibe merkezi haline NMR tüpü yerleştirin. Bir çözücü olarak DMSO seçilmesi, proton spektrumunun ölçün. mıknatıstan NMR tüpü çıkarın. NMR sonucu ¹⁸ analiz edin.

2. Film dağıtım metodu ile DOX-PA miseller hazırlanması

1. DSPE-PEG (40 mg) ve DOX-PA (4 mg), 10 ml bir cam şişe içinde, 2 ml metanol ile çözülür.
2. şişede ince bir film oluşana kadar bir döner buharlaştırıcı kullanılarak vakum altında organik çözücüyü çıkarın.
   Alternatif olarak, (örneğin, argon veya azot gazı), bir film oluşturmak ve daha fazla kalan solventin çıkması için bir vakum desikatörde flakon tutmak için atıl gaz altında, organik çözücüler buharlaştırılmış: NOT.
3. Aktarım cam şişeye Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su (pH 7.4, DPBS) içinde 2 mi.
4. miseller oluşturmak için oda sıcaklığında 3 dakika boyunca ultrasonik bir banyoda şişe yerleştirin.
   NOT: Ultrasonik güç ultrasonik banyolarda farklı modeller arasında değişir. ince polimer / ilaç filmi dağıtmak için yeterli ultrasonik güç üretebilir bir birimi seçin. Bu protokolde kullanılan ultrasonik banyosunun çıkış gücü 110 W olan
5. Kısa süreli depolama için 4 ° C'de miseller tutmak ve -20 ° C de, uzunuzun dönem depolama.
   Not: Alternatif olarak, misellerin dondurularak kurutulmuş ve kullanımdan önce su ile yeniden oluşturulabilir. Genellikle, herhangi bir dondurarak saklama koruyucusu ve liyoprotektan, bu formülasyon için gereklidir.

DOX-PA misellerin 3. karakterizasyonu

1. Miseller ve ilaç kapsülleme verimliliği DOX-PA konsantrasyonunun belirlenmesi
   1. 1 ug / ml, 5 ug / ml, 20 ug / ml, 50 ug / ml ve 100 ug / ml: DOX-PA beş farklı konsantrasyonlarda DOX-PA çözeltiler hazırlanması DMSO içinde bir önceki adımda sentezlenmiştir çözülür. 490 nm'de bir UV-VIS spektrometresi ile DOX-PA çözeltiler emilimini belirlemek. DOX-PA madde konsantrasyonları ve 490 nm'de bunların karşılık gelen emme göre bir standart eğri oluşturur.
   2. DMSO, 500 ul ilaç yüklü misel 25 ul seyreltilir. Bir UV-VIS spektrometresi ile 490 nm'de emilim ölçülür. 3.1.1 oluşturulan standart eğri ile ilaç konsantrasyonlarını hesaplayın.
   3. Aşağıdaki denklem kullanılarak Kapsülleme verimliliği hesaplayın:
      İlaç Kapsülleme verimliliği (%) = (miseller ilaç miktarı) / (ilave ilaç miktarı) x% 100
2. Dinamik ışık dağılımı ile parçacık boyutunun Karakterizasyonu (DLS)
   1. 1 mg / ml'lik bir son DSPE-PEG konsantrasyonuna DPBS (pH 7.4) ile miseller seyreltilir. Z-ortalama boyutu ve çok yönlü dağılma indeksi (PDI) elde etmek için bir parçacık boyutu analiz cihazı ile, 2 ml lik bir numuneyi analiz edin.
3. In vitro anti-kanser etkinliğinin değerlendirilmesi
   NOT: Uygun steril tekniği kullanın ve bir biyogüvenlik kabini içinde çalışırlar.
   1. Bir hücre kültür şişesine (örn, T25) ihtiva eden, DU-145, insan prostat kanseri hücreleri, hücre kültürü ortamının çıkarın ve DPBS, 2 ml (pH 7.4) ile hücrelerin yıkayın.
   2. Aspire DPBS, tripsin solüsyonu (% 0.25) 1 ml ekleyin ve hücreleri ayırmak için 37 ° C'de 2 dakika süreyle inkübe edin.
   3. 10 m eklehücre kültürü aracı maddesi (RPMI 1640 +% 10 cenin sığır serumu +% 1 antibiyotik antimikotik), hücrelerin en şişeden çözülmüş olduğunda. 15 ml santrifüj tüpüne ve santrifüj 5 dakika boyunca 1000 x g'de hücreleri hücreleri aktarın.
   4. Hücre kültür ortamı, 5 ml hücre pelet yeniden askıya ve bir hemositometrede hücre adedini saymak için bir örnek çıkarın. 50,000 hücre / ml'lik bir yoğunluğa kadar hücre kültürü ortamı ile hücreleri seyreltilir. Bir 96-yuvalı hücre kültürü plakasının seyreltilmiş hücre süspansiyonu ekleyin (100 ul / oyuk). Bir hücre kültür inkübatörü içinde inkübe hücreleri (37 ° C,% 5 _CO2) 18 saat hücre tutunmasını sağlar.
   5. sırasıyla, 0.1 uM ve 0.5 uM, 2 uM, 5 uM ve 10 uM nihai ilaç konsantrasyonlarını elde etmek için hücre kültürü ortamı ile DOX dimetil sülfoksit (DMSO) çözeltisi ve DOX-PA DMSO çözeltisi ile seyreltilir. % 0.5 her şeyden örneklerde nihai DMSO konsantrasyonu muhafaza edin. nihai ilaç CO elde etmek için hücre kültürü ortamı ile DOX-PA misel seyreltin0.1 uM ncentrations sırasıyla 0.5 uM, 2 uM, 5 uM, 10 uM,. Boş hücre kültürü ortamında bir denetimi kullanın.
   6. inkübatör 96 oyuklu hücre kültürü plakasının çıkarın ve (her bir grup için n = 4) adım 3.3.5 hazırlandı, farklı işleme maddeleri içeren ortama, 100 ul hücre kültür ortamı yerine. _(2, 37 ° C,% 5 CO) ek 72 saat için hücre kültürü inkübatöründe inkübe hücreleri.
   7. orta aspire ve 3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) ve 0.5 mg / ml ihtiva eden ortam 100 ul -2,5-difenil tetrazolyum bromid (MTT) ilave edin.
   8. 2 saat daha, hücre kültürü inkübatöründe inkübe hücreleri. Dikkatle orta kaldırmak ve formazan kristalleri eritmek için DMSO 100 ul ekleyin.
   9. 570 nm'lik bir dalga boyu ve 670 nm'lik bir referans dalga boyu mikroplaka spektrofotometresiyle absorbansı ölçülür.
   10. Aşağıdaki denklem kullanılarak hücre sağ kalabilirliğinin hesaplanması:
       Hücre Canlılığı (%) = (A _Testi / bir _kontrol) x% 100
       NOT: varyans (ANOVA) istatistik testi, tek-yönlü analizi kullanılarak farklı gruplar arasında hücre canlılığı karşılaştır. Ilaç konsantrasyon verileri vs hücre canlılığı dayalı IC ₅₀ hesaplayın.

Sonuçlar

Şekil 1, DOX-PS sentez şemasını göstermektedir. DOX-PA pH'a duyarlı hidrazon bağ yoluyla doksorubisin palmitik asit konjügasyonu sentezlendi. palmitik asit hidrazid hafif bir fazlalığı reaksiyon tamamlanmasını sağlamak için kullanılmıştır. Bu reaksiyon yöntemi çok yüksek bir etkinliğe sahip ve doksorubisinin sadece küçük bir miktar, bir 18 saat sonra (Şekil 2) ile gösterilmektedir. Verim yaklaşık% 88 idi. Reaksiyonun son...

Tartışmalar

Bu çalışmada, miseller hazırlanması için basit ve hızlı bir film-dispersiyon bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, bir amfifilik polimerin kendinden montaj özelliklerinden istifade (örneğin, DSPE-PEG) sulu bir ortamda çekirdek-kabuk yapılı miseller oluşturmak için. Bu misel hazırlama yöntemi birçok avantaja sahiptir. 1. Genellikle lipozom, nanopartiküller ve nanoemülsiyonlar. ¹⁹ 2 hazırlanmasında kullanılan (örneğin, haddeleme ya da homojenizasyon gibi) karışık büy...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DSPE-PEG2K	Cordenpharm	LP-R4-039	>95%
Doxorubicin	LC Laboratories	D-4000	>99%
Palmitic Acid Hydrazide	TCI AMERICA	P000425G	>98.0%
Methanol	ACROS Organics	610981000	Anhydrous
Methylene chloride	FISHER	D151-4	99.90%
Methyl sulfoxide-d6	ACROS Organics	AC320760075	NMR solvent
Trifluoroacetic Acid	ACROS Organics	AC293811000	99.50%
Silica Gel	FISHER	L-7446	230-400 mesh
Baker Flex TLC Plates	FISHER	NC9990129
DPBS	Sigma-Aldrich	D8537
DU 145  Prostate Cancer Cells	ATCC	HTB-81
MTT	ACROS Organics	158990050	98%
RPMI 1640 Medium	MEDIATECH INC	10041CV
Antibiotic-Antimycotic	LIFE TECHNOLOGIES	15240062	100x stock solution
Fetal Bovine Serum	LIFE TECHNOLOGIES	10437077
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy	Varian, Inc		300 NMR
Büchi R-3 Rotavapor	Buchi	1103022V1	Rotary evaporator
Ultrasonic Bath	BRANSON ULTRASONICS CORPORATION	CPX952318R
UV-VIS spectrometer Biomate 3	Thermo Spectronic
Zetasizer Nano ZS90	Malvern Instruments		Particle Size Analyer
Microplate Spectrophotometer	Rio-Rad	Benchmark Plus
Cell Culture Incubator	Napco	CO2 6000
Biological Safety Cabinet	Nuaire
SigmaPlot	Systat Software, Inc.		Analytical Software
96-Well Cell Culture Plate	Becton Dickinson	353072
Trypsin  0.25%	Corning Cellgro	25-053-CI