Preparação e caracterização de Lipofílica Doxorrubicina micelas Pro-drogas

Resumo

Um protocolo para a preparação e caracterização de doxorrubicina lipofílico pró-fármaco carregado 1,2-distearoyl--sn-glicero-3-phosphoethanolamine- N - [amino (polietileno glicol) -2000] (DSPE-PEG) micelas é descrito.

Resumo

Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous environment through self-assembly. The hydrophobic core of micelles functions as a drug reservoir and encapsulates hydrophobic drugs. The hydrophilic shell prevents the aggregation of micelles and also prolongs their systemic circulation in vivo. In this protocol, we describe a method to synthesize a doxorubicin lipophilic pro-drug, doxorubicin-palmitic acid (DOX-PA), which will enhance drug loading into micelles. A pH-sensitive hydrazone linker was used to conjugate doxorubicin with the lipid, which facilitates the release of free doxorubicin inside cancer cells. Synthesized DOX-PA was purified with a silica gel column using dichloromethane/methanol as the eluent. Purified DOX-PA was analyzed with thin layer chromatography (TLC) and ¹H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (¹H-NMR). A film dispersion method was used to prepare DOX-PA loaded DSPE-PEG micelles. In addition, several methods for characterizing micelle formulations are described, including determination of DOX-PA concentration and encapsulation efficiency, measurement of particle size and distribution, and assessment of in vitro anticancer activities. This protocol provides useful information regarding the preparation and characterization of drug-loaded micelles and thus will facilitate the research and development of novel micelle-based cancer nanomedicines.

Introdução

A quimioterapia é utilizada para tratar várias formas de cancro. A maioria, se não todos, os fármacos de quimioterapia têm efeitos secundários tóxicos que podem variar de pequenas condições controláveis, tais como náusea e diarreia, condições que ameaçam a vida mais. Uma vez que a maioria dos fármacos anti-cancerígenos são tóxicos, não-exposição selectiva destes fármacos ao tecido normal, inevitavelmente, provoca toxicidade. Por conseguinte, existe uma grande necessidade de uma abordagem terapêutica que possa entregar drogas selectivamente em células cancerosas. Um outro desafio com a administração de fármacos anti-cancro é a sua fraca solubilidade em água. Normalmente, os agentes de solubilização são necessários para formular estes fármacos pouco solúveis. No entanto, a maioria dos agentes de solubilização, tais como o sulfóxido de dimetilo (DMSO), Cremophor EL, e polissorbato 80 (Tween 80) podem causar toxicidade hepática e renal, hemólise, as reacções de hipersensibilidade aguda e neuropatias periféricas. ¹ Assim, formulações seguros e biocompatíveis são necessários para o uso clínico de máfármacos anti-cancerígenos ly solúveis. Nanocarriers são promissores sistemas de entrega de drogas para enfrentar os desafios acima. Estes nanocarriers incluem lipossomas, ² nanopartículas, ³ micelas, ^4-7 conjugados de polímero-droga, ⁸ e materiais inorgânicos. ⁹ Vários produtos nanomedicina (por exemplo, DOXIL, Abraxane e Genexol) foram aprovados pelas agências reguladoras para tratar pacientes com câncer. ¹⁰

As micelas poliméricas são promissores transportadores de distribuição de drogas de nano-escala, que têm sido utilizados com êxito para a administração de fármacos anti-cancro. ^4-7,11,12 micelas poliméricas típicas são preparadas a partir de polímeros anfifílicos através de um processo de auto-montagem. Os core-shell micelas poliméricas estruturadas incluem uma camada hidrófila e um núcleo hidrofóbico. A camada hidrófila pode estabilizar estereoquimicamente micelas e prolongar a sua circulação na corrente sanguínea. O núcleo hidrofóbico pode encapsular eficazmente d hidrofóbicotapetes. Devido ao pequeno tamanho de micelas (normalmente inferiores a 200 nM) e propriedades de longa circulação, micelas poliméricas são acreditados para atingir tumores direccionamento por meio de efeitos de retenção (EPR) (tumor passivo segmentação) e permeabilidade aumentada.

A carga de droga a estabilidade é crítica para a capacidade de direccionamento tumoral de micelas. Para alcançar segmentação tumor ideal, micelas deve ter vazamento de drogas mínima antes de chegar ao local do tumor, mas liberte rapidamente a droga depois de entrar células cancerosas. Além disso, a estabilidade da formulação é também um requisito essencial para o desenvolvimento do produto, porque a estabilidade da formulação determina a viabilidade do desenvolvimento do produto, bem como a vida de prateleira de produtos desenvolvidos. Recentemente, muitos esforços têm sido feitos para melhorar o carregamento de medicamentos em transportadores de entrega. A abordagem de pró-fármaco lipofílico é uma estratégia que tem sido explorado para melhorar a carga de fármaco em nanopartículas de lípidos e emulsões. ^13,14 O conjugation de lipídios com drogas pode melhorar significativamente a sua lipofilicidade e aumentar a carga e retenção nos componentes lipofílicos de nanocarriers.

Aqui, descrevemos um protocolo para a preparação de doxorrubicina lipofílico pró-drogas micelas carregadas. Em primeiro lugar, é descrito o procedimento de síntese para a doxorubicina lipofílico pró-droga. Então, um protocolo para a geração de micelas com um método de película-dispersão é introduzida. Este método tem sido utilizado com sucesso nos estudos anteriores. ⁵ DSPE-PEG foi seleccionado como o material transportador para a preparação de micelas porque tem sido utilizado com sucesso para a entrega de drogas micela ^15,16. Finalmente, descreve-se vários testes in vitro utilizados para caracterizar micela formulações e para avaliar a atividade anticâncer.

Protocolo

1. Síntese de DOX-PA

1. Pesar 390 mg de doxorrubicina e 243 mg de hidrazida de ácido palmítico, e transferir para um balão de fundo redondo.
2. Adicionar 150 ml de metanol anidro para o balão com uma seringa de vidro. Adicionar 39 ul de ácido trifluoroacético (TFA), com uma pipeta. Usando um agitador magnético, agita-se a mistura de reacção durante 18 horas à temperatura ambiente no escuro.
   NOTA: As quantidades de materiais de reacção podem ser ampliados ou reduzidos para se obter diferentes quantidades de DOX-PA. A proporção dos reagentes deve ser mantida nas mesmas proporções. As reacções que utilizam quantidades de DOX na gama de 78 mg a 1170 mg pode ser realizado num laboratório normal química.
3. Purificação de DOX-PA usando uma coluna de gel de sílica. ¹⁷
   1. Remover o solvente na mistura de reacção com um evaporador rotativo. Adicionar 3 g de gel de sílica após o volume da mistura é reduzida para cerca de 20 ml. Continue a evaporação rotativa para se obter pós secos e para permitir que tele adsorção de produtos sobre o gel de sílica. Manter a amostra sob vácuo durante mais 30 min após os pós secos são formados.
   2. Pacote de 50 g de gel de sílica numa coluna usando diclorometano como solvente. Cuidadosamente adicionar a amostra de gel de sílica contendo o produto adsorvida para a coluna.
   3. Elui-se a coluna com uma mistura de diclorometano e metanol, aumentando gradualmente a percentagem de metanol, aumentando assim a polaridade do solvente (Tabela 1).
   4. Recolha fracções de eluente em tubos de ensaio (25 ml / tubo) e monitorizar o progresso por cromatografia de camada fina (TLC).
   5. Combinar todas as fracções contendo DOX-PA puro e remover o solvente usando um evaporador rotativo até o pó seca é formada. Além disso secar o produto sob um vácuo O / N.
4. Análise de DOX-PA por TLC.
   1. Corte um x 8 cm secção de 4 cm de placa de TLC. soluções de amostra spot 0,5 cm da parte inferior da placa com TLC capilares mancha usando conheceuhanol como o solvente.
   2. Colocar a placa de TLC para uma câmara de desenvolvimento contendo uma mistura de diclorometano e metanol (3/1, v / v). A profundidade do solvente deve ser apenas menos de 0,5 cm.
   3. Remova a placa da câmara de revelação quando a frente de solvente atingir o topo da placa. Marcar a localização da frente de solvente com um lápis e permitem que a placa secar. Colocar a placa de TLC para uma câmara de coloração contendo vapor de iodo saturada, a fim de visualizar amostras.
5. Análise de DOX-PA com ^um H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy ^{(1H-RMN). 18}
   1. Dissolve-se 15 mg de DOX-PA em 1 ml de sulfóxido de metil-d6 (DMSO) e transferir a amostra para um tubo de RMN.
   2. Insira o tubo de RMN para o ímã do instrumento de RMN. Medir o espectro de protões, seleccionando de DMSO como um solvente. Retire o tubo de RMN do ímã. Analise o resultado RMN ^18.

2. Preparação de micelas de DOX-PA pelo método de película-dispersão

1. Dissolve-se DSPE-PEG (40 mg) e DOX-PA (4 mg) com 2 ml de metanol em um frasco de vidro de 10 ml.
2. Remover o solvente orgânico sob vácuo utilizando um evaporador rotativo, até se formar um filme fino no frasco.
   NOTA: Como alternativa, evapora-se os solventes orgânicos sob gás inerte (por exemplo, árgon ou azoto gasoso) para formar uma película e manter o frasco em um exsicador de vácuo para remover adicionalmente o solvente residual.
3. Transferência de 2 ml de solução salina de Dulbecco tamponada com fosfato (pH 7,4, DPBS) para o frasco de vidro.
4. Colocar o frasco num banho de ultra-sons durante 3 minutos à temperatura ambiente para gerar micelas.
   NOTA: A energia de ultra-som varia entre os diferentes modelos de banhos ultra-sônicos. Seleccionar uma unidade que pode gerar energia ultra-sónica suficiente para dispersar o filme de polímero / fármaco fina. O poder de banho ultra-sônico usado neste protocolo de saída é de 110 W.
5. Manter micelas a 4 ° C para armazenagem de curta duração e -20 ° C durante longoarmazenamento -termo.
   NOTA: Como alternativa, micelas também podem ser liofilizados e reconstituídos com água antes da utilização. Normalmente, não cryoprotectant ou lioprotector é necessário para esta formulação.

3. Caracterização de DOX-PA As micelas

1. Determinação da concentração de DOX-PA em micelas e eficiência de encapsulação de drogas
   1. Dissolve DOX-PA sintetizados nos passos anteriores em DMSO para se preparar soluções de DOX-PA de cinco concentrações diferentes: 1 ug / ml, 5 ug / ml, 20 ug / ml, 50 ug / ml, e 100 ug / ml. Medir a absorção de soluções de DOX-PA com um espectrómetro de UV-VIS a 490 nm. Gerar uma curva padrão baseada nas concentrações de droga DOX-PA e o seu correspondente de absorção a 490 nm.
   2. Diluir 25 uL de micelas carregadas com fármaco com 500 ul de DMSO. Medir a absorção a 490 nm com um espectrómetro UV-VIS. Calcule as concentrações de droga com a curva padrão gerada no ponto 3.1.1.
   3. Calcular a eficiência de encapsulação usando a seguinte equação:
      Eficiência de encapsulamento de droga (%) = (quantidade de drogas em micelas) / (quantidade de fármaco adicionado) x 100%
2. Caracterização do tamanho de partícula com dispersão de luz dinâmica (DLS)
   1. Diluir micelas com DPBS (pH 7,4) até uma concentração final de DSPE-PEG de 1 mg / ml. Analisar uma amostra de 2 ml com um analisador de tamanho de partículas para se obter o tamanho e a polidispersidade índice médio Z (PDI).
3. Avaliação in vitro actividade anti-cancro
   NOTA: Use técnica estéril apropriada e operar dentro de uma cabine de segurança biológica.
   1. Remover o meio de cultura celular a partir de um frasco de cultura de células (por exemplo, T25) contendo células DU-145 de cancro da próstata humano e lavar as células com 2 mL de DPBS (pH 7,4).
   2. Aspirar DPBS, adicionar 1 ml de solução de tripsina (0,25%), e incuba-se durante 2 min a 37 ° C para separar as células.
   3. Adicionar 10 ml de meio de cultura celular (RPMI 1640 + 10% de Soro Fetal Bovino + 1% de antibiótico-antimicótico), quando a maioria das células são separadas do balão. Transferir as células para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugar as células a 1000 xg durante 5 min.
   4. Re-suspender o sedimento de células com 5 ml de meio de cultura celular e remover uma amostra para a contagem do número de células com um hemocitómetro. Dilui-se as células com meio de cultura celular a uma densidade de 50.000 células / ml. Adicionar as suspensões de células diluídas em uma placa de cultura celular de 96 poços (100 ul / poço). Incubam-se as células numa incubadora de cultura de células (37 ° C, 5% CO ₂₎ durante 18 h, para permitir a fixação das células.
   5. Diluir DOX dimetil sulfóxido solução (DMSO) e solução de DOX-PA DMSO com meio de cultura de células para se obter concentrações finais da droga de 0,1 uM, 0,5 uM, 2 uM, 5 uM, 10 uM e, respectivamente. Manter a concentração final de DMSO em todas as amostras acima de 0,5%. Diluir micela DOX-PA com meio de cultura de células para se obter co farmacológico finalncentrations de 0,1 uM, 0,5 uM, 2 uM, 5 uM, 10 uM e, respectivamente. Utilizar o meio de cultura de células em branco um controlo.
   6. Remova a placa de cultura celular de 96 poços a partir do incubador e substituir o meio de cultura de células com 100 ul de meio contendo diferentes agentes de tratamento preparado no passo 3.3.5 (n = 4 para cada grupo). Incubam-se as células na incubadora de cultura de células (37 ° C, 5% CO ₂₎ durante uma 72 horas adicionais.
   7. Aspirar o meio e adicionar 100 uL de meio contendo 0,5 mg / ml de 3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -2,5-difenil (MTT).
   8. Incubam-se as células na incubadora de cultura de células durante mais 2 h. Remova cuidadosamente o meio e adicionar 100 ul de DMSO para dissolver cristais de formazano.
   9. Medir a absorvância com o espectrofotómetro de microplacas a um comprimento de onda de 570 nm e um comprimento de onda de referência de 670 nm.
   10. Calcula-se a viabilidade celular utilizando a seguinte equação:
       Viabilidade celular (%) = (A _Teste / _controlo) × 100%
       NOTA: Comparar a viabilidade celular entre os diferentes grupos usando uma análise de uma via de variância (ANOVA) teste estatístico. Calcula-se a CI ₅₀ com base na viabilidade celular comparada dados de concentração de droga.

Resultados

A Figura 1 mostra o esquema de síntese de DOX-PA. DOX-PA foi sintetizada por conjugação de ácido palmítico com doxorrubicina através de uma ligação de hidrazona sensível a pH. Um ligeiro excesso de hidrazida de ácido palmítico foi usada para facilitar a finalização da reacção. Este método de reacção tem uma eficiência muito elevada e apenas uma pequena quantidade de doxorubicina permaneceu após uma reacção de 18 h (Figura 2). O rend...

Discussão

Neste trabalho, nós descrevemos, um método de filme rápida dispersão simples para a preparação de micelas. Este método utiliza as propriedades de auto-montagem de um polímero anfifílico (por exemplo, DSPE-PEG) para formar micelas com núcleo e camadas estruturadas num ambiente aquoso. Este método de preparação de micelas tem várias vantagens. 1. Trata-se de um processo de formulação simples, o que evita a utilização de passos de redução de tamanho (complicados, tais como extrusão ou homogene...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DSPE-PEG2K	Cordenpharm	LP-R4-039	>95%
Doxorubicin	LC Laboratories	D-4000	>99%
Palmitic Acid Hydrazide	TCI AMERICA	P000425G	>98.0%
Methanol	ACROS Organics	610981000	Anhydrous
Methylene chloride	FISHER	D151-4	99.90%
Methyl sulfoxide-d6	ACROS Organics	AC320760075	NMR solvent
Trifluoroacetic Acid	ACROS Organics	AC293811000	99.50%
Silica Gel	FISHER	L-7446	230-400 mesh
Baker Flex TLC Plates	FISHER	NC9990129
DPBS	Sigma-Aldrich	D8537
DU 145  Prostate Cancer Cells	ATCC	HTB-81
MTT	ACROS Organics	158990050	98%
RPMI 1640 Medium	MEDIATECH INC	10041CV
Antibiotic-Antimycotic	LIFE TECHNOLOGIES	15240062	100x stock solution
Fetal Bovine Serum	LIFE TECHNOLOGIES	10437077
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy	Varian, Inc		300 NMR
Büchi R-3 Rotavapor	Buchi	1103022V1	Rotary evaporator
Ultrasonic Bath	BRANSON ULTRASONICS CORPORATION	CPX952318R
UV-VIS spectrometer Biomate 3	Thermo Spectronic
Zetasizer Nano ZS90	Malvern Instruments		Particle Size Analyer
Microplate Spectrophotometer	Rio-Rad	Benchmark Plus
Cell Culture Incubator	Napco	CO2 6000
Biological Safety Cabinet	Nuaire
SigmaPlot	Systat Software, Inc.		Analytical Software
96-Well Cell Culture Plate	Becton Dickinson	353072
Trypsin  0.25%	Corning Cellgro	25-053-CI