Peritonitis estandarizada por stent de colon ascendente en ratas: un modelo animal simple y factible para inducir lesión renal aguda séptica

Resumen

La lesión renal aguda (IRA) es una complicación grave en el paciente crítico y se relaciona con un aumento de la mortalidad. Aquí, presentamos un modelo in vivo confiable y reproducible para imitar la LRA en condiciones inflamatorias que podría contribuir a la comprensión de la patogénesis de la LRA séptica.

Resumen

La LRA en pacientes sépticos se asocia con un aumento de la mortalidad y un mal pronóstico, a pesar de los grandes esfuerzos para refinar la comprensión de su fisiopatología. Aquí, se presenta un modelo in vivo que combina un foco séptico estandarizado para inducir LRA y una configuración de cuidados intensivos (UCI) para proporcionar un monitoreo hemodinámico avanzado y una terapia comparable en la sepsis humana. La sepsis es inducida por la peritonitis estandarizada del stent del colon ascendente (sCASP). La LRA se investiga funcionalmente mediante la medición de muestras de sangre y orina, así como histológicamente mediante la evaluación de las puntuaciones histopatológicas. Además, la monitorización hemodinámica avanzada y la posibilidad de tomar muestras repetitivas de gases en sangre permiten un análisis diferenciado de la gravedad de la sepsis inducida.

El método sCASP es un método estandarizado, fiable y reproducible para inducir LRA séptica. La configuración de cuidados intensivos, la monitorización hemodinámica y de intercambio gaseoso continua, la baja tasa de mortalidad, así como la posibilidad de realizar análisis detallados de la función renal y las deficiencias son ventajas de esta configuración. Por lo tanto, el método descrito puede servir como un nuevo estándar para las investigaciones experimentales de la LRA séptica.

Introducción

La sepsis sigue siendo la principal causa de muerte en las unidades de cuidados intensivos (UCI) no cardíacas, con tasas de mortalidad del 30 al 50% ≈^1,2,3. Una característica distintiva de la sepsis grave y el shock séptico es la lesión renal aguda que provoca un aumento adicional de la tasa de mortalidad cuando se asocia a disfunción orgánica a distancia, como insuficiencia cardíaca y respiratoria ^4,5,6. La incidencia global de LRA en pacientes de UCI varía del 20 al 50%⁷. A pesar del papel fundamental de la LRA en relación con el resultado y la mortalidad en la sepsis, el mecanismo patológico subyacente aún no se conoce bien.

En general, existen los 3 componentes principales: inflamación, lesión tóxica y cambios hemodinámicos que contribuyen al desarrollo de LRA⁷. Los cambios hemodinámicos incluyen reducción del flujo sanguíneo renal (FSR) e isquemia renal global o regional. En este caso, hay que tener en cuenta que la sepsis también puede causar un deterioro de la microcirculación renal debido a la hipotensión sistémica y/o a la ruptura de la barrera endotelial⁸. Por lo tanto, el estudio de la LRA séptica debe incluir siempre la monitorización hemodinámica. Los estudios in vivo recientes sobre LRA utilizaron mayoritariamente modelos animales, como la lesión por isquemia-reperfusión renal o la nefrectomía bilateral. Estos estudios generalmente mostraron una falta de monitoreo hemodinámico y cuidados intensivos.

La investigación de posibles nuevos mecanismos patológicos y terapias de la LRA séptica requiere un modelo in vivo con un foco séptico definido, una configuración de cuidados intensivos, un resultado predecible y una lesión orgánica 9,10,11,12. Aquí, describimos un modelo innovador de roedores para LRA séptica que cumple con los requisitos mencionados anteriormente. La LRA séptica es inducida por la peritonitis estandarizada del stent del colon ascendente (sCASP). El modelo sCASP utilizado provoca una sepsis abdominal por una fuga fecal intestinal que conduce a la invasión bacteriana y al fallo multiorgánico¹³. Se ha demostrado que los cambios fisiopatológicos después de la CASP son similares a los de la sepsis humana y, por lo tanto, la CASP representa un modelo clínicamente relevante en la investigación de la sepsis^11,14.

Además, en el protocolo experimental se establece una configuración de cuidados intensivos (UCI) que comprende una monitorización hemodinámica avanzada y terapia de UCI. La configuración de la UCI permite la reanimación con líquidos, la aplicación de analgesia por vía intravenosa y el análisis repetitivo de gases en sangre. La función renal se evalúa mediante la medición de valores estándar como la creatinina y el aclaramiento de inulina y ácido p-aminohipúrico (HAP). Al final del experimento, las puntuaciones patológicas de los tejidos y órganos extraídos proporcionan información adicional. El modelo sCASP para inducir LRA séptica ya está evaluado y reveló nuevos conocimientos en patología renal¹⁵. La aplicación adicional de este protocolo que se presenta a continuación podría ayudar a refinar la comprensión de la LRA séptica.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Distrito de Unterfranken, Alemania, y se llevaron a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki.

1. Preparación quirúrgica e instalación de monitorización invasiva y medicación continuada

1. Anestesiar ratas Sprague-Dawley usando isoflurano administrado por un vaporizador de precisión a una concentración y caudal aprobados por el organismo de supervisión de investigación animal de la institución local y/o el equipo veterinario. Confirme la profundidad adecuada de la anestesia observando la frecuencia respiratoria, que se vuelve más lenta y profunda, y verifique la falta de respuesta después del pinzamiento de la cola o los dedos del pie. Afeita la garganta y el estómago con una navaja.
   Nota: La reducción masiva de la frecuencia respiratoria puede ser un indicador de una sobredosis de anestesia y provocar bradipno, hipotensión y, finalmente, la muerte.
2. Coloque a la rata en posición supina sobre una almohadilla térmica. Aplica ungüento veterinario en los ojos para evitar que se sequen. Mantener la profundidad anestésica adecuada utilizando la concentración y el caudal de isoflurano basándose en el monitoreo intraoperatorio de la rata y/o las recomendaciones del organismo de supervisión de la investigación con animales y/o el equipo veterinario de la institución local. Coloque a la rata en posición supina sobre una almohadilla térmica automática.
   Nota: La hipotermia y la lesión térmica influyen en los parámetros macro y microhemodinámicos y deben evitarse para obtener un resultado fiable. Se recomienda utilizar una almohadilla térmica con mecanismo de control que esté conectada a la rata a través de una sonda rectal flexible para mantener la temperatura corporal en el rango fisiológico.
3. Después de la desinfección del cuello y la garganta con la solución desinfectante adecuada, incidir la piel de la garganta medial con un bisturí y hacer una incisión de unos 2 cm. Girar la rata y realizar una incisión de aproximadamente 1 cm con tijeras quirúrgicas en el cuello aproximadamente 1 cm distal del occipucio.
4. Vuelve a colocar a la rata en posición supina. Diseccionar suavemente la vena yugular derecha y la arteria carótida izquierda con las tijeras y bastoncillos de algodón. Disecciona las vasijas de las estructuras vecinas. Evite arrastrar demasiado y prepárese más con movimientos de separación cuidadosos.
   Nota: Mantenga los recipientes siempre húmedos mediante la aplicación de solución salina estéril precalentada.
5. Diseccionar suavemente y con movimientos extendidos por vía subcutánea desde los vasos hasta el cuello para conseguir una conexión entre las dos incisiones. Inserte abrazaderas en cada túnel formado.
6. Enjuague el eslabón giratorio y los catéteres, provenientes del dispositivo giratorio con NaCl al 0,9%. Inserte los catéteres en un resorte de acero inoxidable.
   Nota: Los catéteres deben lavarse con cloruro de sodio antes de insertarlos, ya que la aplicación mínima de aire puede provocar la muerte súbita debido a la embolia gaseosa.
7. Gire la rata y sujete los catéteres con las pinzas insertadas. Deslice los catéteres desde el cuello hasta la garganta. Fije el resorte con una correa de botón de plástico a aproximadamente 1 cm distal del occipucio con 6 suturas singulares (por ejemplo, 4/0) en el cuello.
8. Vuelva a colocar la rata en posición supina. Coloque hilos de algodón de unos 4 cm distal y proximal a cada vaso preparado. Cortar la arteria proximal con un microclip, que generalmente se usa para recortar aneurismas subaracnoideos. Alternativamente, deje el clip y detenga el flujo sanguíneo arterial apretando uno de los hilos.
9. Incidir la arteria con unas microtijeras quirúrgicas, mantener la incisión abierta con un gancho en una mano e insertar el catéter arterial en el vaso utilizando fórceps con la otra mano. Abra el clip o el hilo estirado, empuje el catéter aproximadamente 1 cm hacia adelante en el vaso hacia el corazón y fíjelo con nudos quirúrgicos usando los hilos de algodón colocados.
10. Repita el paso 1.8 en la vena yugular y deje el clip, ya que la vena no es tan sólida como la arteria.
11. Una vez fijados ambos catéteres en línea recta en los vasos, cierre la herida en la garganta con suturas.

2. Procedimiento sCASP

1. Mantenga a la rata en posición supina, afeitar el abdomen y desinfectar la región abdominal con las soluciones desinfectantes adecuadas.
   Nota: Utilice siempre la técnica aséptica.
2. Realizar una incisión de la línea media abdominal de la piel de unos 2 cm de longitud con unas tijeras quirúrgicas y posteriormente de nuevo a lo largo de la línea alba para abrir la caverna peritoneal.
3. Identifique el polo cecal y extraiga el ciego suavemente con bastoncillos de algodón.
4. Perforar el colon ascendente alrededor de 2 cm distal de la válvula ileocecal, con una sutura (6/0) [sutura 1] en el lado antimesentérico y fijarlo con dos nudos quirúrgicos. Evite las lesiones de los vasos del colon.
5. Corte el extremo distal, aproximadamente 1,5 cm, de un catéter de succión de 10 FR. Corta este trozo del catéter con las tijeras para formar una solapa rectangular con una longitud de unos 0,5 cm. Prepare el colgajo con una sutura (6/0) [sutura 2] en el centro del colgajo.
6. Coloque el colgajo sobre una aguja de 14G y punción del colon ascendente con la aguja donde se fijó la sutura 1¹⁵.
7. Inserte el tubo de plástico preparado en el colon sobre la aguja. Al mismo tiempo, retire la aguja suavemente. Coloque la sonda de manera que el colgajo quede fuera del colon y el resto del tubo dentro del colon.
   1. Después de la colocación exacta del tubo de plástico, fije el colgajo con la sutura 2 ya existente suturando la pared colónica y los nudos quirúrgicos. Evitar de nuevo cualquier lesión de los vasos del colon. Coloque los extremos libres de la sutura 1 alrededor del resto del tubo de plástico que sale del colon y realice 2 nudos quirúrgicos.
8. Ordeñar las heces desde el ciego hacia el stent colónico mediante el uso de bastoncillos de algodón hasta que aparezcan las heces a la salida del stent.
9. Vuelva a colocar el intestino delgado y el colon en la caverna abdominal. De este modo, el tubo de plástico con las heces debe estar en contacto con el peritoneo. Enjuague el stent con 2 mL de NaCl al 0,9% para distribuir las heces en la caverna peritoneal.
10. Cerrar la caverna abdominal con una sutura continua (4/0) del peritoneo y posteriormente con una sutura continua (4/0) de la piel.

3. Procedimiento postoperatorio

1. Detenga la inhalación de isoflurano y vuelva a colocar a la rata en su jaula.
2. Iniciar la analgesia intravenosa por vía venosa con fentanilo (2,0 μg/100 g de peso corporal/h).

4. Preparación de las mediciones el segundo día

1. 24 h después del procedimiento sCASP, aplique 0,5-1,0 mg de midazolam por vía intravenosa. Mantener la profundidad anestésica adecuada utilizando la concentración y el caudal de isoflurano basándose en el monitoreo intraoperatorio de la rata y/o las recomendaciones del organismo de supervisión de la investigación con animales y/o el equipo veterinario de la institución local.
2. Una vez desinfectado con alcohol y solución de nuevo, realizar una traqueotomía con el tubo de plástico de una cánula venosa de 14 G para proporcionar suficiente oxigenación y ventilación.
   1. Por lo tanto, abra la sutura en la garganta con tijeras quirúrgicas y ábrala suavemente desde la línea media hasta la tráquea. Haga una incisión vertical en la tráquea entre dos cartílagos de una longitud de unos 2 mm con unas tijeras quirúrgicas, lo suficiente para insertar las tijeras quirúrgicas. Ensancha la incisión sin filo hasta aproximadamente la mitad del diámetro de la tráquea con las tijeras. Inserte 1 cm de un tubo de plástico de 14 G y fíjelo con 2 suturas. ¹⁶
      Nota: Si la incisión de la tráquea es más grande que la mitad de la circunferencia, los vasos que van a lo largo de la tráquea pueden dañarse, lo que resulta en una hemorragia grave, aspiración de sangre o bradicardia letal.
   2. Iniciar ventilación mecánica con ventilador para roedores con un F_iO₂ de 0,28 y 0,7 % Vol. de isoflurano e iniciar anestesia intravenosa con midazolam (0,7 mg/100 g PC/h) y fentanilo (7 μg/100 g PC/h). Realizar análisis de gases en sangre para garantizar una ventilación y oxigenación suficientes. Por lo tanto, extraiga aproximadamente 0,7 ml de sangre a través del catéter arterial y mídala con un analizador de gases en sangre.
      Nota: La anestesia intravenosa debe comenzar solo si se establece la ventilación controlada mecánicamente.
3. Después de haber afeitado y desinfectado de forma similar a la 2.1, realice una incisión longitudinal de 1 cm de la piel de la pierna derecha, 0,5 cm proximal de la rodilla. Disecciona la arteria de las estructuras vecinas con tijeras quirúrgicas y bastoncillos de algodón sin rodeos.
   Nota: Si la arteria femoral se desgarra, aún es posible la inserción del catéter en posición proximal. Por lo tanto, se recomienda iniciar la implantación lo más distal posible.
4. Inserte un catéter de termodilución en la arteria femoral abriendo la arteria con un gancho e insertando el catéter con pinzas.
5. Comience a medir el gasto cardíaco mediante el método de termodilución. Por lo tanto, infunda 1 mL de NaCl enfriado rápidamente y manualmente a través del catéter venoso después de haber iniciado la medición de un software de medición del índice cardíaco. Realice esta medición dos veces.

5. Evaluación de la función renal

1. Realizar una laparotomía abriendo las suturas de la piel y el peritoneo con unas tijeras. Haga una incisión en la vejiga urinaria con unas tijeras quirúrgicas lo suficiente como para cateterizarla con un pequeño catéter de plástico. Después de colocar un hilo de algodón de unos 7 cm alrededor de la vejiga, sujete el hilo, fije el catéter con nudos y, finalmente, recoja la mayor cantidad de orina posible a través del catéter.
2. Disuelva la fluoresceína-isotiocianato-inulina (FITC-inulina) en NaCl al 0,9% y sal sódica (HAP) del ácido p-aminohipúrico en NaCl al 0,9% para obtener concentraciones de 2 mg/mL de inulina, 5 mg/mL de HAP.
3. Aplicar un bolo de una mezcla de ambas sustancias de 75 μL i.v., seguido de una infusión intravenosa constante de ambas sustancias con una tasa de 3,7 μL/h/300 g de peso corporal.
4. Después de haber alcanzado un estado estacionario¹⁷ con la infusión de FITC-Inulina y HAP, recoja la orina durante 20 min. Tomar muestras de sangre a través del catéter arterial como se describe en el punto 4.2.1 con respecto a la realización de un análisis de gases en sangre.
5. Determinar las concentraciones de inulina en la orina y el plasma por espectrometría de fluorescencia y medir la HAP por fotoespectrometría utilizando el método de antrona¹⁷.

6. Fin de los experimentos

1. Sacrificar al animal de acuerdo con las regulaciones legales locales.
2. Extraiga la mayor cantidad de sangre posible a través del catéter arterial mediante el uso de jeringas.
3. Extraiga el intestino delgado y grueso cortando la fijación peritoneal del duodeno y el colon, saque algunas partes de estos con tijeras quirúrgicas. Prepare y extraiga los riñones mediante la preparación retroperitoneal y libere su cápsula grasa y corte a través del uréter y los vasos adjuntos. Realizar una toracotomía y extirpar los pulmones y el corazón. Fijar todos los órganos en formaldehído y realizar tinciones histológicas como se publicó anteriormente. ^15,18

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Como ya se publicó previamente por Schick et ^al.8, demostramos los siguientes resultados.

Inducción de sepsis sin mortalidad
En el modelo CASP, la sepsis es inducida por una fuga continua de bacterias intraluminales localizadas en el colon que ascienden a la cavidad abdominal, lo que resulta en peritonitis fecal y bacteriemia. De este modo, el tamañ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

La fisiopatología de la LRA séptica sigue siendo desconocida en su complejidad. La investigación clínica y los ensayos en pacientes no permitirán obtener nuevos conocimientos con respecto a los cambios histopatológicos, las alteraciones de la microcirculación o las interacciones farmacológicas a nivel celular¹⁵. Se ha postulado previamente que existe la necesidad de modelos animales nuevos y mejorados para investigar la lesión renal aguda asociada a la se...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague-Dawley rats	Janvier Labs, France
Isoflurane CP	cp-pharma, Burgdorf, Germany
polyethylen catheter PE 10; 30m	A. Hartenstein, Wuerzburg, Germany		0.58x0.96 mm
Swivel (375/D/20)	Instech, Plymouth Meeting, PA, USA		(375/D/20)
plastic button tethers	Instech, Plymouth Meeting, PA, USA		LW105S
Perfusor	B. Braun; Melsungen, Germany		Perfusor fm
suction catheter ch. 10	B.Braun Melsungen AG, Germany		suction catheter typy „Ideal“; ch. 10
suture	Syneture; USA		Surgipro; Monofilament Polypropylen 4-0
suture	Ethicon; Scotland		Prolene; Polypropylen 5-0
14G-i.v. catheter	BD Insynte; BD Vialon; Madrid; Spain		14GA i.v. catheter
cotton buds	NOBA Verbandmittel Danz GmbH u Co KG; Wetter; Germany
rodent respirator	Hugo Sachs Elektronik KG, Germany		rodent respirator, Type:7025
Midazolam	Ratiopharm, Germany		Midazolam
Thermodilutioncatheter	ADInstruments, Spechbach, Germany
p-Aminohippuric acid	Sigma-Aldrich; St. Louis; USA		p-Aminohippuric acid sodium salt; A3759-25G
Inulin	Sigma-Aldrich; St. Louis; USA		Inulin-FITC; F3272-1G
Formaldehyde	Otto Fischar GmbH & CoKG; Saarbrücken, Germany		Formaldehyde 3.5%
Cyclopentan	Merck; Darmstadt; Germany		Uvasol: 2-Methylbutan
alcohol based scrub	Schülke & Mayr GmbH, Norderstedt; Germany		kodan Tinktur forte; 45g 2-Propanol, 10g 1-Propanol per 100g
povidone iodine solution	B.Braun Melsungen AG, Germany		Braunol, 7.5g Povidone Iodine per 100g