Standardized Colon Ascendens Stent Peritonitis in Rats - 패혈성 급성 신장 손상을 유도하는 간단하고 실현 가능한 동물 모델

요약

급성 신장 손상(AKI)은 중증 환자에게 발생하는 심각한 합병증이며 사망률 증가와 관련이 있습니다. 여기에서는 패혈성 AKI의 발병기전을 이해하는 데 기여할 수 있는 염증성 조건에서 AKI를 모방하는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 생체 내 모델을 제시합니다.

초록

패혈증 환자의 AKI는 병태생리학에 대한 이해를 개선하려는 많은 노력에도 불구하고 사망률 증가 및 나쁜 결과와 관련이 있습니다. 여기에서는 AKI를 유도하기 위한 표준화된 패혈성 초점과 집중 치료(ICU) 설정을 결합하여 인간 패혈증에 필적하는 고급 혈역학적 모니터링 및 요법을 제공하는 생체 내 모델을 제시합니다. 패혈증은 표준화된 결장 상승 스텐트 복막염(sCASP)에 의해 유발됩니다. AKI는 혈액 및 소변 샘플의 측정을 통해 기능적으로 조사되고 조직병리학적 점수의 평가를 통해 조직학적으로 조사됩니다. 또한 고급 혈류역학 모니터링과 반복적인 혈액 가스 샘플링의 가능성을 통해 유도 패혈증의 중증도에 대한 차별화된 분석을 수행할 수 있습니다.

sCASP 방법은 정화조 AKI를 유도하는 표준화되고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 방법입니다. 집중 치료 설정, 지속적인 혈역학 및 가스 교환 모니터링, 낮은 사망률, 신장 기능 및 손상에 대한 자세한 분석 기회는 이 설정의 장점입니다. 따라서, 기술된 방법은 정화조 AKI의 실험적 조사를 위한 새로운 표준이 될 수 있다.

서문

패혈증은 여전히 비심장 집중 치료실(ICU)의 주요 사망 원인으로 남아 있으며 사망률은 ≈ 30 - 50%^1,2,3입니다. 중증 패혈증과 패혈성 쇼크의 특징은 급성 신장 손상으로, 심장 및 호흡 부전과 같은 원격 장기 기능 장애와 관련될 때 사망률을 더욱 증가시킨다 ^4,5,6. 중환자실 환자의 전체 AKI 발병률은 20%에서 50%까지 다양합니다⁷. 패혈증의 결과 및 사망률에 관한 AKI의 중추적인 역할에도 불구하고 근본적인 병리 메커니즘은 여전히 잘 이해되지 않고 있습니다.

전반적으로 AKI 발달에 기여하는 염증, 독성 손상 및 혈역학적 변화의 3가지 주요 구성 요소가 있습니다⁷. 혈역학적 변화에는 신혈류(RBF) 감소와 전반적 또는 국소 신허혈이 포함됩니다. 여기서, 패혈증은 전신성 저혈압 및/또는 내피 장벽 파괴로 인해 신장 미세순환 장애를 유발할 수도 있다는 점을 고려해야 한다⁸. 따라서 패혈성 AKI에 대한 연구에는 항상 혈류역학적 모니터링이 포함되어야 합니다. AKI에 대한 최근의 생체 내 연구는 주로 신장 허혈-재관류 손상 또는 양측 신장 절제술과 같은 동물 모델을 사용했습니다. 이러한 연구는 일반적으로 혈류역학적 모니터링과 집중 치료가 부족함을 보여주었다.

패혈성 AKI의 잠재적인 새로운 병리 메커니즘 및 치료법에 대한 조사에는 정의된 패혈성 초점, 집중 치료 설정, 예측 가능한 결과 및 장기 손상 ^9,10,11,12를 가진 생체 내 모델이 필요합니다. 여기에서는 앞서 언급한 요구 사항을 충족하는 정화조 AKI에 대한 혁신적인 설치류 모델에 대해 설명합니다. 패혈성 AKI는 표준화된 결장 상승 스텐트 복막염(sCASP)에 의해 유발됩니다. 사용된 sCASP 모델은 장 대변 누출에 의한 복부 패혈증을 유발하여 세균 침입 및 다발성 장기 부전을 유발한다¹³. CASP 후 병태생리학적 변화는 인간 패혈증의 변화와 유사하며, 따라서 CASP는 패혈증 연구에서 임상적으로 관련된 모델을 나타내는 것으로 나타났습니다^11,14.

또한, 고급 혈류역학 모니터링 및 ICU 요법으로 구성된 집중 치료(ICU) 설정이 실험 프로토콜에 설정되어 있습니다. ICU 설정은 수액 소생술, 진통제 정맥 주사 적용 및 반복적인 혈액 가스 분석을 가능하게 합니다. 신장 기능은 크레아티닌과 같은 표준 값의 측정과 이눌린 및 p-아미노히푸릭산(PAH) 청소에 의해 평가됩니다. 추가 정보는 실험이 끝날 때 수확된 조직 및 장기의 병리학적 점수에 의해 전달됩니다. 패혈성 AKI를 유도하기 위한 sCASP 모델은 이미 평가되어 신장 병리학에 대한 새로운 통찰력을 보여주었습니다¹⁵. 아래에 제시된 이 프로토콜의 추가 적용은 정화조 AKI에 대한 이해를 구체화하는 데 도움이 될 수 있습니다.

프로토콜

모든 동물 절차는 독일 운터프랑켄 지구의 실험실 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 헬싱키 선언에 따라 수행되었습니다.

1. 침습적 모니터링 및 지속적인 약물 투여의 외과적 준비 및 설치

1. 정밀 기화기로 전달되는 이소플루란을 사용하여 Sprague-Dawley 쥐를 지역 기관의 동물 연구 감독 기관 및/또는 수의학 팀이 승인한 농도 및 유속으로 마취합니다. 느려지고 깊어지는 호흡 속도를 관찰하여 적절한 마취 깊이를 확인하고 꼬리/발가락 꼬집음 후 무반응을 확인합니다. 면도기로 목과 위를 면도하십시오.
   메모: 호흡 속도의 급격한 감소는 마취 과다 복용의 지표가 될 수 있으며 결국 서경, 저혈압 및 사망으로 이어질 수 있습니다.
2. 쥐를 가열 패드에 누운 자세로 놓습니다. 눈이 건조해지지 않도록 수의사 연고를 눈에 바르십시오. 쥐의 수술 중 모니터링 및/또는 지역 기관의 동물 연구 감독 기관 및/또는 수의학 팀의 권장 사항을 기반으로 이소플루란 농도 및 유속을 사용하여 적절한 마취 깊이를 유지합니다. 쥐를 자동 가열 패드에 누운 자세로 놓습니다.
   참고: 저체온증 및 열 손상은 거시 및 미세혈역학적 매개변수에 영향을 미치므로 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 피해야 합니다. 체온을 생리적 범위로 유지하기 위해 유연한 직장 프로브를 통해 쥐와 연결된 제어 메커니즘이 있는 가열 패드를 사용하는 것이 좋습니다.
3. 적절한 소독액으로 목과 목을 소독 한 후 메스로 목 내측의 피부를 절개하고 2cm 정도의 절개를 합니다. 쥐를 돌려 수술용 가위로 후두부 원위 약 1cm의 목을 약 1cm 절개합니다.
4. 쥐를 다시 누운 자세로 놓습니다. 가위와 면봉으로 오른쪽 경정맥과 왼쪽 경동맥을 부드럽게 절개합니다. 인접한 구조물에서 혈관을 해부합니다. 너무 많은 드래그를 피하고 조심스럽게 펴는 동작으로 더 준비하십시오.
   메모: 예열된 멸균 식염수를 적용하여 혈관을 항상 촉촉하게 유지하십시오.
5. 혈관에서 목까지 피하로 부드럽게 퍼뜨리는 움직임으로 절개하여 두 절개 부위를 연결합니다. 형성된 각 터널에 클램프를 삽입합니다.
6. 회전 장치에서 나오는 회전대와 카테터를 0.9% NaCl로 세척합니다. 카테터를 스테인리스 스틸 스프링에 삽입합니다.
   메모: 카테터는 삽입하기 전에 염화나트륨으로 세척해야 하며, 최소한의 공기 적용으로 인해 공기 색전증으로 인한 돌연사로 이어질 수 있습니다.
7. 쥐를 돌리고 삽입된 클램프를 사용하여 카테터를 고정합니다. 카테터를 목에서 목구멍으로 밉니다. 목에 6개의 단일 봉합사(예: 4/0)가 있는 후두부 원위 약 1cm의 플라스틱 단추 밧줄로 스프링을 고정합니다.
8. 쥐를 다시 누운 자세로 놓습니다. 준비된 각 혈관에 약 4cm의 원위부와 근위부의 면사를 놓습니다. 마이크로 클립으로 근위부 동맥을 클립하며, 일반적으로 지주막하 동맥류를 클립하는 데 사용됩니다. 또는 클립을 그대로 두고 실 중 하나를 조여 동맥 혈류를 멈춥니다.
9. 수술용 마이크로 가위로 동맥을 절개하고 한 손에는 고리로 절개 부위를 열어 두고 다른 손으로는 집게를 사용하여 동맥 카테터를 혈관에 삽입합니다. 클립이나 당겨진 실을 열고 카테터를 심장 쪽으로 혈관 안으로 약 1cm 앞으로 밀어 넣은 다음 놓인 면실을 사용하여 수술 매듭으로 고정합니다.
10. 경정맥에 대해 1.8단계를 반복하고 정맥이 동맥만큼 단단하지 않으므로 클립을 그대로 둡니다.
11. 두 카테터를 혈관에 일직선으로 고정한 후 봉합사로 목구멍의 상처를 봉합합니다.

2. sCASP 절차

1. 쥐를 누운 자세로 유지하고 복부를 면도하고 적절한 소독 용액으로 복부 부위를 소독하십시오.
   메모: 항상 무균 기술을 사용하십시오.
2. 수술용 가위로 약 2cm 길이의 피부를 복부 정중선 절개한 후 다시 리네아 알바를 따라 복막 동굴을 엽니다.
3. caecal pole을 확인하고 면봉을 사용하여 caecum을 부드럽게 당겨 빼냅니다.
4. 회장 판막에서 원위 약 2cm 떨어진 상행 결장을 항장간막 쪽에 봉합사(6/0)[봉합사 1]로 뚫고 두 개의 수술 매듭으로 고정합니다. 결장 혈관의 병변을 피하십시오.
5. 10 FR 흡입 카테터의 말단 끝(약 1.5cm)을 자릅니다. 가위로 이 카테터 조각을 잘라 약 0.5cm 길이의 직사각형 덮개를 형성합니다. 플랩 중간에 봉합사(6/0) [봉합사 2]로 플랩을 준비합니다.
6. 14G 바늘 위에 플랩을 놓고 봉합사 1이 고정된 바늘로 상행 결장을 뚫습니다¹⁵.
7. 준비된 플라스틱 튜브를 바늘 위의 결장에 삽입합니다. 동시에 바늘을 부드럽게 제거합니다. 플랩이 결장 외부에 놓이고 튜브의 나머지 부분이 결장 내부에 놓이도록 튜브를 배치합니다.
   1. 플라스틱 튜브를 정확하게 배치한 후 결장 벽과 수술 매듭을 꿰매어 이미 존재하는 봉합사 2로 플랩을 고정합니다. 결장 혈관의 병변을 다시 피하십시오. 봉합사 1의 자유 끝을 결장 외부로 이어지는 나머지 플라스틱 튜브에 끼우고 2개의 수술 매듭을 수행합니다.
8. 스텐트의 배출구에 대변이 나타날 때까지 면봉을 사용하여 caecum에서 결장 스텐트 쪽으로 우유 대변을 만듭니다.
9. 소장과 결장을 복부 동굴에 다시 넣는다. 이로써 대변이 있는 플라스틱 튜브는 복막과 접촉해야 합니다. 스텐트를 2mL 0.9% NaCl로 세척하여 대변을 복막 동굴로 분배합니다.
10. 복막의 지속적인 봉합사(4/0)로 복부도를 봉합한 후 피부의 연속 봉합사(4/0)로 복부도를 봉합합니다.

3. 수술 후 절차

1. 이소플루란의 흡입을 멈추고 쥐를 우리에 다시 넣는다.
2. 펜타닐(2.0μg/체중 100g/시)을 사용하여 정맥선을 통해 진통제를 정맥 주사를 시작합니다.

4. 둘째 날에 측정 준비

1. sCASP 시술 후 24시간 후에 0.5-1.0mg 미다졸람을 정맥 주사합니다. 쥐의 수술 중 모니터링 및/또는 지역 기관의 동물 연구 감독 기관 및/또는 수의학 팀의 권장 사항을 기반으로 이소플루란 농도 및 유속을 사용하여 적절한 마취 깊이를 유지합니다.
2. 알코올과 용액으로 다시 소독한 후 14G 정맥 캐뉼라의 플라스틱 튜브로 기관절개술을 수행하여 충분한 산소 공급과 환기를 제공합니다.
   1. 따라서 수술용 가위로 목구멍의 봉합사를 열고 정중선에서 기관까지 부드럽게 엽니다. 수술용 가위로 약 2mm 길이의 두 연골 사이에 기관을 수직으로 절개하여 수술용 가위를 삽입할 수 있을 정도만 삽입합니다. 가위로 절개 부위를 기관 직경의 약 절반 정도까지 뭉툭하게 넓힙니다. 14G 플라스틱 튜브 1cm를 삽입하고 2개의 봉합사로 고정합니다. ¹⁶세
      메모: 기관 절개 부위가 둘레의 절반보다 크면 기관을 따라 이동하는 혈관이 손상되어 심한 출혈, 혈액 흡인 또는 치명적인 서맥이 발생할 수 있습니다.
   2. F_iO₂ 가 0.28 및 0.7 Vol. % 이소플루란인 설치류 인공호흡기로 기계 환기를 시작하고 미다졸람(0.7mg/100g BW/h) 및 펜타닐(7μg/100g BW/h)로 정맥 마취를 시작합니다. 충분한 환기와 산소 공급을 보장하기 위해 혈액 가스 분석을 수행합니다. 따라서 동맥 카테터를 통해 약 0.7mL의 혈액을 채취하고 혈액 가스 분석기로 측정하십시오.
      메모: 정맥 마취는 기계적으로 제어되는 인공호흡이 확립된 경우에만 시작해야 합니다.
3. 2.1과 같은 방법으로 면도 및 소독을 한 후 무릎 0.5cm 오른쪽 다리 피부를 1cm 세로 절개합니다. 수술용 가위와 면봉을 사용하여 주변 구조와 동맥을 무뚝뚝하게 절개합니다.
   메모: 대퇴 동맥이 찢어진 경우에도 근위 위치에 카테터를 삽입할 수 있습니다. 따라서 가능한 한 원위부에서 이식을 시작하는 것이 좋습니다.
4. 고리로 동맥을 열고 집게로 카테터를 삽입하여 열희석 카테터를 대퇴동맥에 삽입합니다.
5. 열희석법으로 심박출량을 측정하기 시작합니다. 따라서 심장 지수 측정 소프트웨어의 측정을 시작한 후 정맥 카테터를 통해 수동으로 냉각된 NaCl 1mL를 빠르게 주입하십시오. 이 측정을 두 번 수행합니다.

5. 신장 기능 평가

1. 가위로 피부와 복막의 봉합사를 열어 개복술을 수행합니다. 수술용 가위로 방광을 절개하고 작은 플라스틱 카테터로 카테터를 삽입할 수 있을 만큼만 방광을 절개합니다. 방광에 약 7cm의 면실을 놓고 실을 고정하고 매듭으로 카테터를 고정하고 마지막으로 카테터를 통해 가능한 한 많은 소변을 수집합니다.
2. 플루오레세인-이소티오시아네이트-이눌린(FITC-Inulin)을 0.9% NaCl에 녹이고 p-아미노히푸르산 나트륨염(PAH)을 0.9% NaCl에 용해시켜 2mg/mL 이눌린, 5mg/mL PAH의 농도를 얻습니다.
3. 75 μL i.v.의 두 물질의 혼합물 볼루스를 적용한 다음 3.7 μL/h/300 g BW의 비율로 두 물질을 지속적으로 정맥 주입합니다.
4. 안정 상태에 도달한 후⁽¹⁷ ) FITC-이눌린과 PAH를 주입하여 20분 동안 소변을 채취합니다. 혈액 가스 분석 수행에 관한 4.2.1에 설명된 대로 동맥 카테터를 통해 혈액 샘플을 채취합니다.
5. 형광 분광법으로 소변과 혈장의 이눌린 농도를 측정하고 anthrone method¹⁷을 사용하여 광분광법으로 PAH를 측정합니다.

6. 실험의 종료

1. 현지 법적 규정에 따라 동물을 안락사시킵니다.
2. 주사기를 사용하여 동맥 카테터를 통해 가능한 한 많은 혈액을 추출합니다.
3. 십이지장과 결장의 복막 고정을 절단하여 소장과 대장을 적출하고 수술 용 가위를 사용하여 일부를 제거합니다. 후복막을 준비하여 신장을 준비하고 적출하여 지방 캡슐을 방출하고 요관과 부속 혈관을 절단합니다. 개흉술을 시행하고 폐와 심장을 잘라냅니다. 모든 장기를 포름알데히드로 고정하고 이전에 발표된 대로 조직학적 염색을 수행합니다. ^15,18년

결과

Schick et ^al.8에 의해 이전에 발표된 바와 같이, 다음과 같은 결과를 입증합니다.

사망률 없는 패혈증 유발
CASP 모델에서 패혈증은 결장의 내강내에 위치한 박테리아의 지속적인 누출에 의해 유도되어 복강으로 올라가 분변성 복막염과 균혈증을 유발합니다. 이에 따라 이...

토론

패혈성 AKI의 병태 생리학은 그 복잡성에 대해 아직 알려지지 않았습니다. 환자를 대상으로 한 임상연구와 임상시험은 세포수준에서의 조직병리학적 변화, 미세순환 장애 또는 약물 상호작용에 관한 새로운 통찰을 얻을 수 없게 한다¹⁵. 패혈증과 관련된 급성 신장 손상을 조사하기 위해 개선되고 새로운 동물 모델이 필요하다는 것이 이전에 가정된 바 있...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague-Dawley rats	Janvier Labs, France
Isoflurane CP	cp-pharma, Burgdorf, Germany
polyethylen catheter PE 10; 30m	A. Hartenstein, Wuerzburg, Germany		0.58x0.96 mm
Swivel (375/D/20)	Instech, Plymouth Meeting, PA, USA		(375/D/20)
plastic button tethers	Instech, Plymouth Meeting, PA, USA		LW105S
Perfusor	B. Braun; Melsungen, Germany		Perfusor fm
suction catheter ch. 10	B.Braun Melsungen AG, Germany		suction catheter typy „Ideal“; ch. 10
suture	Syneture; USA		Surgipro; Monofilament Polypropylen 4-0
suture	Ethicon; Scotland		Prolene; Polypropylen 5-0
14G-i.v. catheter	BD Insynte; BD Vialon; Madrid; Spain		14GA i.v. catheter
cotton buds	NOBA Verbandmittel Danz GmbH u Co KG; Wetter; Germany
rodent respirator	Hugo Sachs Elektronik KG, Germany		rodent respirator, Type:7025
Midazolam	Ratiopharm, Germany		Midazolam
Thermodilutioncatheter	ADInstruments, Spechbach, Germany
p-Aminohippuric acid	Sigma-Aldrich; St. Louis; USA		p-Aminohippuric acid sodium salt; A3759-25G
Inulin	Sigma-Aldrich; St. Louis; USA		Inulin-FITC; F3272-1G
Formaldehyde	Otto Fischar GmbH & CoKG; Saarbrücken, Germany		Formaldehyde 3.5%
Cyclopentan	Merck; Darmstadt; Germany		Uvasol: 2-Methylbutan
alcohol based scrub	Schülke & Mayr GmbH, Norderstedt; Germany		kodan Tinktur forte; 45g 2-Propanol, 10g 1-Propanol per 100g
povidone iodine solution	B.Braun Melsungen AG, Germany		Braunol, 7.5g Povidone Iodine per 100g