Peritonite padronizada do stent Colon Ascendens em ratos - um modelo animal simples e viável para induzir lesão renal aguda séptica

Resumo

A lesão renal aguda (LRA) é uma complicação grave em pacientes críticos e está relacionada a um aumento da mortalidade. Aqui, apresentamos um modelo in vivo confiável e reprodutível para mimetizar LRA em condições inflamatórias que podem contribuir para a compreensão da patogênese da LRA séptica.

Resumo

A LRA em pacientes sépticos está associada ao aumento da mortalidade e desfecho desfavorável, apesar dos grandes esforços para refinar a compreensão de sua fisiopatologia. Aqui, é apresentado um modelo in vivo que combina um foco séptico padronizado para induzir LRA e uma configuração de terapia intensiva (UTI) para fornecer um monitoramento hemodinâmico avançado e terapia comparável na sepse humana. A sepse é induzida por peritonite padronizada do stent ascendente do cólon (sCASP). A LRA é investigada funcionalmente pela medição de amostras de sangue e urina, bem como histologicamente pela avaliação de escores histopatológicos. Além disso, a monitorização hemodinâmica avançada e a possibilidade de amostragem repetitiva de gasometria permitem uma análise diferenciada da gravidade da sepse induzida.

O método sCASP é um método padronizado, confiável e reprodutível para induzir LRA séptica. A configuração de terapia intensiva, o monitoramento hemodinâmico e de troca gasosa contínuo, a baixa taxa de mortalidade, bem como a oportunidade de análises detalhadas da função renal e comprometimentos são vantagens dessa configuração. Portanto, o método descrito pode servir como um novo padrão para investigações experimentais de LRA séptica.

Introdução

A sepse ainda continua sendo a principal causa de morte em unidades de terapia intensiva (UTI) não cardíacas, com taxas de mortalidade de ≈ 30 a 50%^1,2,3. Uma característica marcante da sepse grave e do choque séptico é a lesão renal aguda que causa um aumento adicional da taxa de mortalidade quando associada a disfunção de órgãos distantes, como insuficiência cardíaca e respiratória ^4,5,6. A incidência geral de LRA em pacientes de UTI varia de 20 a 50%⁷. Apesar do papel fundamental da LRA em relação ao desfecho e mortalidade na sepse, o mecanismo patológico subjacente ainda é pouco compreendido.

No geral, existem os 3 componentes principais: inflamação, lesão tóxica e alterações hemodinâmicas que contribuem para o desenvolvimento da LRA⁷. As alterações hemodinâmicas englobam redução do fluxo sanguíneo renal (RBF) e isquemia renal global ou regional. Aqui, deve-se considerar que a sepse também pode causar comprometimento da microcirculação renal devido à hipotensão sistêmica e/ou ruptura da barreira endotelial⁸. Portanto, o estudo da LRA séptica deve sempre incluir a monitorização hemodinâmica. Estudos in vivo recentes sobre LRA usaram principalmente modelos animais, como lesão renal de isquemia-reperfusão ou nefrectomia bilateral. Esses estudos geralmente mostraram falta de monitorização hemodinâmica e cuidados intensivos.

A investigação de potenciais novos mecanismos patológicos e terapias da LRA séptica requer um modelo in vivo com um foco séptico definido, uma configuração de terapia intensiva, um resultado previsível e uma lesão de órgão 9,10,11,12. Aqui, descrevemos um modelo inovador de roedor para LRA séptica que atende aos requisitos mencionados anteriormente. A LRA séptica é induzida por peritonite padronizada do stent ascendente do cólon (sCASP). O modelo sCASP utilizado causa sepse abdominal por vazamento fecal intestinal, levando à invasão bacteriana e falência de múltiplos órgãos¹³. Foi demonstrado que as alterações fisiopatológicas após a CASP são semelhantes às da sepse humana e, portanto, a CASP representa um modelo clinicamente relevante na pesquisa da sepse^11,14.

Além disso, uma configuração de terapia intensiva (UTI) que compreende um monitoramento hemodinâmico avançado e terapia de UTI é estabelecida no protocolo experimental. A configuração da UTI permite ressuscitação fluídica, aplicação de analgesia por via intravenosa e análise repetitiva de gases sanguíneos. A função renal é avaliada pela medição de valores padrão, como creatinina, e pela depuração do ácido aminohipúrico (PAH) e da inulina. Informações adicionais são fornecidas por escores patohistológicos de tecidos e órgãos colhidos no final do experimento. O modelo sCASP para induzir LRA séptica já foi avaliado e revelou novos insights na patologia renal¹⁵. A aplicação adicional deste protocolo apresentado abaixo pode ajudar a refinar a compreensão da LRA séptica.

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Protocolo

Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório do Distrito de Unterfranken, Alemanha, e realizados de acordo com a Declaração de Helsinque.

1. Preparo cirúrgico e instalação de monitorização invasiva e medicação contínua

1. Anestesiar ratos Sprague-Dawley usando isoflurano administrado por vaporizador de precisão em uma concentração e vazão aprovadas pelo órgão de supervisão de pesquisa animal da instituição local e/ou equipe veterinária. Confirme a profundidade adequada da anestesia observando a frequência respiratória, que se torna mais lenta e profunda, e verifique a falta de resposta após o beliscão da cauda/dedo do pé. Raspe a garganta e o estômago com uma navalha.
   Nota: A redução maciça da frequência respiratória pode ser um indicador de uma overdose de anestesia e levar a bradipneia, hipotensão e, finalmente, morte.
2. Coloque o rato em decúbito dorsal em uma almofada de aquecimento. Aplique pomada veterinária nos olhos para evitar que os olhos sequem. Manter a profundidade anestésica adequada usando concentração e vazão de isoflurano com base no monitoramento intraoperatório de ratos e/ou recomendações do órgão de supervisão de pesquisa animal e/ou equipe veterinária da instituição local. Coloque o rato em decúbito dorsal em uma almofada de aquecimento automatizada.
   Nota: A hipotermia e a lesão térmica influenciam os parâmetros macro e micro-hemodinâmicos e devem ser evitadas para obter um resultado confiável. Recomenda-se o uso de uma almofada de aquecimento com mecanismo de controle que é ligado ao rato por meio de uma sonda retal flexível para manter a temperatura corporal na faixa fisiológica.
3. Após a desinfecção do pescoço e da garganta com a solução desinfetante apropriada, incisar a pele da garganta medial com um bisturi e fazer uma incisão de cerca de 2 cm. Vire o rato e faça uma incisão de cerca de 1 cm com tesoura cirúrgica no pescoço cerca de 1 cm distal do occipital.
4. Coloque o rato de volta em decúbito dorsal. Disseque suavemente a veia jugular direita e a artéria carótida esquerda com a tesoura e os cotonetes. Disseque os vasos das estruturas vizinhas. Evite muito arrasto e prepare-se ainda mais com movimentos cuidadosos de espalhamento.
   Nota: Mantenha os vasos sempre úmidos pela aplicação de solução salina estéril pré-aquecida.
5. Disseque suavemente e com movimentos de propagação subcutânea dos vasos até o pescoço para obter uma conexão entre as duas incisões. Insira grampos em cada túnel formado.
6. Lave o giro e os cateteres, provenientes do dispositivo giratório com NaCl 0,9%. Insira os cateteres em uma mola de aço inoxidável.
   Nota: Os cateteres devem ser lavados com cloreto de sódio antes de serem inseridos, pois a aplicação mínima de ar pode levar à morte súbita devido à embolia gasosa.
7. Vire o rato e prenda os cateteres usando as pinças inseridas. Deslize os cateteres do pescoço para a garganta. Fixe a mola com uma corda de botão de plástico cerca de 1 cm distal do occipital com 6 suturas singulares (por exemplo, 4/0) no pescoço.
8. Coloque o rato novamente em decúbito dorsal. Coloque fios de algodão de cerca de 4 cm distais e proximais a cada recipiente preparado. Corte a artéria proximal com um microclipe, geralmente usado para clipagem de aneurismas subaracnoides. Como alternativa, deixe o clipe e interrompa o fluxo sanguíneo arterial apertando um dos fios.
9. Incisar a artéria com uma microtesoura cirúrgica, manter a incisão aberta com um gancho em uma mão e inserir o cateter arterial no vaso usando uma pinça com a outra mão. Abra o clipe ou o fio puxado, empurre o cateter cerca de 1 cm para a frente no vaso em direção ao coração e fixe-o com nós cirúrgicos usando os fios de algodão colocados.
10. Repita o passo 1.8 na veia jugular e deixe o clipe, pois a veia não é tão sólida quanto a artéria.
11. Depois de fixar os dois cateteres em linha reta nos vasos, feche a ferida na garganta com suturas.

2. Procedimento sCASP

1. Mantenha o rato em decúbito dorsal, raspe o abdômen e desinfete a região abdominal com as soluções de desinfecção apropriadas.
   Nota: Utilize sempre a técnica asséptica.
2. Realizar uma incisão abdominal na linha média da pele de cerca de 2 cm de comprimento com tesoura cirúrgica e depois novamente ao longo da linha alba para abrir a caverna peritoneal.
3. Identifique o pólo cecal e puxe o ceco suavemente usando cotonetes.
4. Perfure o cólon ascendente cerca de 2 cm distal da válvula ileocecal com uma sutura (6/0) [sutura 1] no lado antimesentérico e fixe-o com dois nós cirúrgicos. Evite lesões de quaisquer vasos do cólon.
5. Corte a extremidade distal - cerca de 1,5 cm - de um cateter de sucção de 10 FR. Corte este pedaço do cateter com a tesoura para formar uma aba retangular com um comprimento de cerca de 0,5 cm. Prepare o retalho com uma sutura (6/0) [sutura 2] no meio do retalho.
6. Colocar o retalho sobre uma agulha 14G e puncionar o cólon ascendente com a agulha onde foi fixada a sutura¹⁵.
7. Insira o tubo de plástico preparado no cólon sobre a agulha. Remova simultaneamente a agulha com cuidado. Posicione o tubo de forma que o retalho fique fora do cólon e o resto do tubo dentro do cólon.
   1. Após o posicionamento exato do tubo plástico, fixe o retalho com a sutura 2 já existente, costurando a parede do cólon e os nós cirúrgicos. Evite novamente qualquer lesão dos vasos do cólon. Coloque as extremidades livres da sutura 1 ao redor do resto do tubo de plástico que sai do cólon e faça 2 nós cirúrgicos.
8. Ordenhe as fezes do ceco em direção ao stent colônico usando cotonetes até que as fezes apareçam na saída do stent.
9. Coloque o intestino delgado e o cólon de volta na caverna abdominal. Assim, o tubo de plástico com as fezes deve estar em contato com o peritônio. Lave o stent com 2 mL de NaCl a 0,9% para distribuir as fezes na caverna peritoneal.
10. Feche a caverna abdominal com uma sutura contínua (4/0) do peritônio e depois com uma sutura contínua (4/0) da pele.

3. Procedimento pós-operatório

1. Pare a inalação de isoflurano e coloque o rato de volta em sua gaiola.
2. Inicie a analgesia intravenosa através da linha venosa usando fentanil (2,0 μg / 100 g de peso corporal / h).

4. Preparando as medições no segundo dia

1. 24 h após o procedimento sCASP, aplicar 0,5-1,0 mg de midazolam por via intravenosa. Manter a profundidade anestésica adequada usando concentração e vazão de isoflurano com base no monitoramento intraoperatório de ratos e/ou recomendações do órgão de supervisão de pesquisa animal e/ou equipe veterinária da instituição local.
2. Depois de desinfetar novamente com álcool e solução, realizar uma traqueostomia com o tubo de plástico de uma cânula venosa de 14 G para fornecer oxigenação e ventilação suficientes.
   1. Portanto, abra a sutura na garganta com uma tesoura cirúrgica e abra suavemente da linha média até a traqueia. Incise a traqueia verticalmente entre duas cartilagens de cerca de 2 mm de comprimento com uma tesoura cirúrgica - apenas o suficiente para inserir uma tesoura cirúrgica. Alargue a incisão sem rodeios até cerca de metade do diâmetro da traqueia com a tesoura. Insira 1 cm de um tubo de plástico de 14 G e fixe-o com 2 suturas. ¹⁶
      Nota: Se a incisão da traqueia for maior que a metade da circunferência, os vasos que acompanham a traqueia podem ser prejudicados, resultando em hemorragia grave, aspiração de sangue ou bradicardia letal.
   2. Iniciar ventilação mecânica com ventilador de roedores com F_iO₂ de 0,28 e 0,7 Vol. % isoflurano e iniciar anestesia venosa com midazolam (0,7 mg/100 g PV/h) e fentanil (7 μg/100 g PV/h). Realize análises de gases sanguíneos para garantir ventilação e oxigenação suficientes. Portanto, retire cerca de 0,7 mL de sangue através do cateter arterial e meça-o com um analisador de gases sanguíneos.
      Nota: A anestesia intravenosa deve ser iniciada apenas se a ventilação controlada mecanicamente for estabelecida.
3. Depois de ter sido barbeado e desinfetado de maneira semelhante à do item 2.1, fazer uma incisão longitudinal de 1 cm na pele da perna direita, 0,5 cm proximal do joelho. Disseque a artéria das estruturas vizinhas usando tesouras cirúrgicas e cotonetes sem rodeios.
   Nota: Se a artéria femoral for rompida, ainda é possível a inserção do cateter em posição proximal. Assim, recomenda-se iniciar o implante o mais distal possível.
4. Insira um cateter de termodiluição na artéria femoral abrindo a artéria com um gancho e inserindo o cateter com uma pinça.
5. Comece a medir o débito cardíaco pelo método de termodiluição. Portanto, infundir 1 mL de NaCl resfriado rapidamente manualmente através do cateter venoso após ter iniciado a medição de um software de medição do índice cardíaco. Efetue esta medição duas vezes.

5. Avaliação da função renal

1. Realize uma laparotomia abrindo as suturas da pele e do peritônio com uma tesoura. Incise a bexiga urinária com uma tesoura cirúrgica apenas o suficiente para cateterizá-la com um pequeno cateter de plástico. Depois de colocar um fio de algodão de cerca de 7 cm ao redor da bexiga, prenda o fio, fixe o cateter com nós e, finalmente, colete o máximo de urina possível através do cateter.
2. Dissolva a fluoresceína-isotiocianato-inulina (FITC-inulina) em NaCl a 0,9% e o sal de sódio (PAH) do ácido p-aminohipúrico em NaCl a 0,9% para obter concentrações de 2 mg/mL de inulina, 5 mg/mL de PAH.
3. Aplicar um bolus de uma mistura de ambas as substâncias de 75 μL i.v., seguido de infusão intravenosa constante de ambas as substâncias com uma taxa de 3,7 μL / h / 300 g BW.
4. Depois de ter atingido um estado estacionário¹⁷ com a infusão de FITC-Inulina e PAH coletar a urina por 20 min. Colher amostras de sangue através do cateter arterial, conforme descrito no ponto 4.2.1, para a realização de uma gasometria.
5. Determinar as concentrações de inulina na urina e no plasma por espectrometria de fluorescência e medir o PAH por fotoespectrometria utilizando o método da antrona¹⁷.

6. Fim das experiências

1. Eutanásia do animal de acordo com os regulamentos legais locais.
2. Retire o máximo de sangue possível através do cateter arterial usando seringas.
3. Colha o intestino delgado e grosso cortando a fixação peritoneal do duodeno e do cólon, retire algumas partes deles usando uma tesoura cirúrgica. Prepare e colha os rins preparando retroperitoneal e libere-os de sua cápsula gordurosa e corte o ureter e os vasos anexos. Faça uma toracotomia e corte os pulmões e o coração. Fixe todos os órgãos em formaldeído e faça colorações histológicas conforme publicado anteriormente. ^15,18

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Resultados

Conforme publicado anteriormente por Schick et ^al.8, demonstramos os seguintes resultados.

Indução de sepse sem mortalidade
No modelo CASP, a sepse é induzida por um vazamento contínuo de bactérias localizadas intraluminais do cólon ascendendo para a cavidade abdominal, resultando em peritonite fecal e bacteremia. Assim, o tamanho do cateter impl...

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Discussão

A fisiopatologia da LRA séptica ainda permanece desconhecida em sua complexidade. Pesquisas clínicas e ensaios clínicos em pacientes não permitirão obter novos insights com relação a alterações histopatológicas, distúrbios da microcirculação ou interações medicamentosas em níveis celulares¹⁵. Foi postulado anteriormente que há necessidade de modelos animais novos e aprimorados para investigar a lesão renal aguda associada à sepse

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague-Dawley rats	Janvier Labs, France
Isoflurane CP	cp-pharma, Burgdorf, Germany
polyethylen catheter PE 10; 30m	A. Hartenstein, Wuerzburg, Germany		0.58x0.96 mm
Swivel (375/D/20)	Instech, Plymouth Meeting, PA, USA		(375/D/20)
plastic button tethers	Instech, Plymouth Meeting, PA, USA		LW105S
Perfusor	B. Braun; Melsungen, Germany		Perfusor fm
suction catheter ch. 10	B.Braun Melsungen AG, Germany		suction catheter typy „Ideal“; ch. 10
suture	Syneture; USA		Surgipro; Monofilament Polypropylen 4-0
suture	Ethicon; Scotland		Prolene; Polypropylen 5-0
14G-i.v. catheter	BD Insynte; BD Vialon; Madrid; Spain		14GA i.v. catheter
cotton buds	NOBA Verbandmittel Danz GmbH u Co KG; Wetter; Germany
rodent respirator	Hugo Sachs Elektronik KG, Germany		rodent respirator, Type:7025
Midazolam	Ratiopharm, Germany		Midazolam
Thermodilutioncatheter	ADInstruments, Spechbach, Germany
p-Aminohippuric acid	Sigma-Aldrich; St. Louis; USA		p-Aminohippuric acid sodium salt; A3759-25G
Inulin	Sigma-Aldrich; St. Louis; USA		Inulin-FITC; F3272-1G
Formaldehyde	Otto Fischar GmbH & CoKG; Saarbrücken, Germany		Formaldehyde 3.5%
Cyclopentan	Merck; Darmstadt; Germany		Uvasol: 2-Methylbutan
alcohol based scrub	Schülke & Mayr GmbH, Norderstedt; Germany		kodan Tinktur forte; 45g 2-Propanol, 10g 1-Propanol per 100g
povidone iodine solution	B.Braun Melsungen AG, Germany		Braunol, 7.5g Povidone Iodine per 100g