Los métodos para el aislamiento, cultivo y caracterización funcional de los miocitos del nodo sinusal ratones adultos

Resumen

Métodos se demuestran para el aislamiento de miocitos nódulo sinoauricular (SAMs) de ratones adultos para estudios de electrofisiología de pinzamiento zonal o de formación de imágenes. Las células aisladas se pueden utilizar directamente o se pueden mantener en cultivo para permitir la expresión de proteínas de interés, tales como la prensa codificados genéticamente.

Resumen

miocitos nodo sinusal (SAMs) actúan como los marcapasos naturales del corazón, iniciando cada latido del corazón mediante la generación de potenciales de acción espontáneos (APs). Estos puntos de acceso de marcapasos reflejan la actividad coordinada de numerosas corrientes de membrana y el ciclo de calcio intracelular. Sin embargo, los mecanismos precisos que impulsan la actividad de marcapasos espontánea en SAMs siendo difícil de alcanzar. Aguda SAMs aisladas son una preparación esencial para experimentos para diseccionar la base molecular de marcapasos cardíaco. Sin embargo, la anatomía indistinto, microdisección compleja, y las condiciones de digestión enzimática meticulosos han impedido el uso generalizado de forma aguda aislada SAM. Además, los métodos no estaban disponibles hasta hace poco para permitir el cultivo a largo plazo de las SAM para estudios de expresión de proteínas. Aquí nos proporcionan una demostración de protocolo y de vídeo paso a paso para el aislamiento de las SAM de ratones adultos. Un método también se demuestra para el mantenimiento de ratón adulto SAMs in vitro y para expressien de proteínas exógenas a través de la infección adenoviral. Aguda aislados y SAMs cultivadas preparadas mediante estos métodos son adecuados para una variedad de estudios electrofisiológicos y de formación de imágenes.

Introducción

miocitos marcapasos en el nodo sinusal del corazón (miocitos sinoauricular, "SAM") generan, los potenciales de acción espontáneos rítmicos (APs) que se propagan a través del miocardio para iniciar cada latido del corazón. Los experimentos utilizando SAMs aisladas de forma aguda a partir de muchas especies han sido esenciales para el esclarecimiento de los mecanismos que contribuyen a la generación de actividad marcapasos. SAM son cardiomiocitos altamente especializadas que difieren sustancialmente de sus contrapartes en el miocardio auricular y ventricular en términos de morfología, función y expresión de la proteína. El sello distintivo de los puntos de acceso espontáneas en SAMs es una despolarización espontánea durante la diástole que impulsa el potencial de membrana de umbral para activar la siguiente AP ^1,2. Este "potencial marcapasos" depende de la actividad coordinada de muchos diferentes corrientes de membrana incluyendo la "divertida actual" (I _f), T y de tipo L corrientes de calcio, y el curr intercambiador de sodio-calcioent (I _NCX), que es impulsada por la liberación ^de Ca2 ⁺ desde el retículo sarcoplásmico ^3,4.

Si bien de forma aguda aislado ratón SAMs son una preparación experimental esencial para el estudio de marcapasos, el aislamiento de SAMs de ratones puede ser un método difícil de adoptar porque la anatomía indistinta y el pequeño tamaño del ratón SAN requiere una microdisección matizada y la enzimática combinada y mecánico la disociación de las células requiere una cuidadosa optimización.

Proporcionamos aquí una demostración de vídeo detallada de un protocolo que ha sido utilizado con éxito para aislar SAMs de ratones adultos para las grabaciones de patch clamp ^5-8. Hasta donde sabemos, no existe tal demostración visual disponible de cualquier otra fuente. Además, un nuevo método se demuestra en las que los aislados SAMs de ratones adultos se pueden mantener in vitro durante varios días, lo que permite la introducción de proteínas, codificados genéticamenteLas moléculas indicadoras o ARNi a través de la infección por adenovirus ^9.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Colorado Anschutz Medical Campus. El protocolo estándar por debajo se ha optimizado el uso de macho C57BL / 6J de 2-3 meses de edad.

1. Preparar existencias y suministros de soluciones en anticipación de Experimentos

NOTA: Consulte la Tabla materiales para el equipo y los suministros necesarios.

1. Preparar 1 L cada una de las soluciones siguientes como se indica en la Tabla 1:, Low Ca ^{2 +} / Mg2 ⁺ Tyrode de, Modificado Kraft-Brühe (KB) de soluciones, y albúmina de suero bovino (BSA) Solución completa de Tyrode. Uso ultrapura filtra agua desionizada para todas las soluciones. Dividir cada solución en alícuotas de 50 ml y se almacena a 20 ° C durante un máximo de seis meses. Descongelar alícuotas individuales inmediatamente antes de los experimentos, y almacenar hasta por una semana a 46; C.
2. Preparar 50 ml de NaCl 10 mM y CaCl ₂ mM Solución Adaptación 1,8 disolviendo NaCl y CaCl ₂ en ultrapura filtrada agua desionizada (Tabla 1). Almacenar a temperatura ambiente durante un máximo de seis meses.
3. Preparar alícuotas 4.75 unidad de actividad enzimática (U) de la elastasa con la pipeta en tubos de microcentrífuga. Almacenar a 4 ° C durante un máximo de tres meses.
4. Preparar 375 g alícuotas (en _H2O ultrapura) de la mezcla de enzimas colagenasa-proteasa con la pipeta en tubos de microcentrífuga. Almacenar a -20 ° C durante un máximo de tres meses.
5. Preparar dos pipetas Pasteur pulidas al fuego, uno para la transferencia de tejido (~ 1,5 mm diámetro de la abertura final; Figura 1Aiv y la Figura 1C) y una para la disociación (~ 2 mm de diámetro; Figura 1Aiii y la Figura 1C).
   1. Score pipetas Pasteur con un cortador de vidrio y encajan a presión a lo largo de la puntuación para producir una apertura ligeramente más grande que el tamaño deseado. Fuego-Polaco el extremo cortado de cada pipeta de ~ 30-60 segundos a fuego lento en un mechero Bunsen para producir una pared pulida de espesor y una abertura del diámetro deseado. Asegúrese de que la abertura pulida al fuego está libre de grietas o asperezas.
6. Preparar dos platos de disección mediante la adición de ~ 25 ml de elastómero de silicona mezclado de acuerdo con las instrucciones del fabricante a cada 100 mm placa de Petri (Figura 1ai y la Figura 1B). Deje curar a temperatura ambiente durante 48 hr.
7. Para la cultura única: preparar a 25-50 ml cada medio de baño y Medio de cultivo según la Tabla 2 de la tienda para un máximo de dos semanas a 4 ° C..

2. Preparar soluciones que han de utilizarse en el Día de aislamiento de células

NOTA: Las siguientes son las cantidades para el aislamiento de miocitos sinoauricular de un ratón.

1. Añadir 2,5 ml de bajo Ca ^{2 +} / Mg2 ⁺ de Tyrode (pH 6,9) a cada uno de tres tubo de cultivo pequeño, de fondo redondos. Colocar los tubos en baño de agua a 35 ± 1 ° C.
2. Añadir 2,5 ml de Baja Ca ²⁺ / a un gran tubo de cultivo de fondo redondo de Mg ²⁺ Tyrode. Para este tubo, añadir 1 parte alícuota (4,75 T) elastasa y una alícuota (375 mg) mezcla de enzimas colagenasa-proteasa. Agitar para mezclar. Colocar el tubo en el 35 ± 1 ° C baño de agua.
3. Añadir 2,5 ml de KB medio a tres, tubos de cultivo adicionales pequeñas-de fondo redondo y un tubo adicional grande, de fondo redondo de cultura. Colocar los tubos en baño de agua a 35 ± 1 ° C.
4. Añadir ~ 7 ml de solución de BSA a una gran tubo de cultivo con fondo. Mantenga este tubo a temperatura ambiente.
5. Coloque 20-40 ml de solución de Tyrode completo en un vaso de 50 ml (Figura 1Aii). Añadir 10 USP / ml de heparina, agitar para mezclar y colocar el vaso de precipitados en el baño de agua ° C 35 ± 1.

3. Preparar soluciones y materiales adicionales para células cultivadas (omitir estos pasos para células aisladas de forma aguda)

1. En una campana de cultivo de tejido estéril, colocar dos de 12 mm cubreobjetos de vidrio redondos por ratón en pocillos individuales de una placa de 24 pocillos.
   NOTA: La placa de 24 pocillos se utiliza debido a que los pozos son de un tamaño conveniente, que sirve para limitar el volumen de las infecciones virales posteriores.
2. Pipeta aproximadamente 200 l de una solución de 100 ng / ml de laminina de ratón diluido en tampón fosfato salino (PBS) a cada cubreobjetos.
3. Incubar cubreobjetos con laminina para la duración del aislamiento (al menos 1 hr) en una incubadora a 37 ° C.
4. Pre-caliente el medio de baño y medio de cultivo (del Paso 1.7 y en la Tabla 3) a 37 ° C.

4. Aislamiento Sinoatrial Nodo

1. En una campana de humos químicos, coloca un ratón en una cámara de una caja de dos cámaras y anestesiar con ~ 200 l isoflurano líquido introducido a través de un hisopo de algodón en la otra cámara. Confirmar la anestesia (generalmente dentro de ~ 30-60 seg) con una pizca dedo del pie. La eutanasiaratón por dislocación cervical.
   NOTA: Una caja de punta de la pipeta 1 ml vacío se puede usar para formar la caja de dos cámaras; gire el bastidor boca abajo en la caja para crear el compartimiento separado para el isoflurano para evitar que el ratón entre en contacto con él directamente.
2. Retire la piel del pecho con las tijeras y la costilla transecto jaula para exponer la cavidad torácica utilizando pinzas externas de tejido (Figura 1Aviii) y tijeras de disección (Figura 1Avix). Bañar la cavidad torácica con ~ 2 ml calentaron completa de Tyrode con heparina usando una pipeta de transferencia.
   NOTA: Continuar cavidad torácica baño cuando sea necesario, no permita que la preparación se seque.
3. Bajo un microscopio de disección, retirar con cuidado los pulmones y el timo con una tijera internos (Figura 1Avi) y pinza de disección (Figura 1Avii).
4. Mientras sujeta suavemente el ápice del corazón con las pinzas de disección internos, cortar cuidadosamente la vena cava inferior y la unaorta con las tijeras internos para eliminar el corazón de la cavidad torácica. Transferir el corazón de uno de los platos de disección de silicona y se bañan con ~ 4 ml calentado heparinizada completa de Tyrode usando la pipeta de transferencia.
5. Oriente el corazón de tal manera que los vasos posteriores son visibles y mirando hacia arriba, con la aurícula derecha del animal a la derecha del experimentador y la aurícula izquierda a la izquierda del experimentador. Una vez orientado, inmovilizar el corazón tras cubrir a través del vértice en el plato de la disección de silicona.
6. Busque la ranura entre los ventrículos y las aurículas (claro anillo encima de los ventrículos).
7. Uso de las tijeras de disección internos, hacer una incisión en la ranura, manteniendo más cerca de los ventrículos que las aurículas. Enjuague la ranura y la incisión con Tyrode completa heparinizada calentado adicional de que sea necesario para permitir una visión clara de las aurículas y las válvulas. Continuar el corte a lo largo de la ranura para separar las aurículas de los ventrículos.
8. Transferir el tejido auricular para el segundo plato de la disección de silicona y bañarse con ~ 3 ml calentado heparinizada completa de Tyrode.
9. Oriente el tejido de manera que aurícula derecha del animal ya está a la izquierda del experimentador, y la aurícula izquierda está a la derecha.
   NOTA: La aurícula derecha es más transparente, mientras que la aurícula izquierda tiene más de un tono rojo oscuro.
10. Pin el tejido a través de la vena cava inferior y superior y la derecha y la izquierda apéndices auriculares, que se extiende suavemente la preparación. Eliminar cualquier tejido graso u otro restante para permitir una visión clara de la preparación (tener cuidado de no cortar en la pared auricular, ya que el nodo sinusal es muy delicada y puede dañarse fácilmente).
11. Abra la pared anterior de la aurícula cortando a través de la vena cava. Vuelva a colocar los pines como sea necesario para visualizar el tabique interauricular.
12. Corte a lo largo del tabique interauricular para eliminar la aurícula izquierda. Re-Pin la preparación, estirando suavemente.
13. Retire tque orejuela derecha y liberar el nodo sinusal cortando a lo largo del terminalis crestas, que aparece como una raya de color naranja oscuro bordeando el apéndice auricular.
14. Vuelva a fijar el tejido ganglionar y cortar lateralmente (perpendicular a la cresta terminal) para producir tres franjas de igual tamaño.

5. Nodo sinoauricular Digestión

1. Utilizando el estrecho pipeta pulida al fuego (Figura 1Aiv), la transferencia de las tres tiras de tejido nodo sinusal en el primero de los tres pequeño tubo de fondo redondo que contiene 2,5 ml de baja Ca2 ⁺ / Mg2 ⁺ Tyrode en el 35 ± 1 ° C baño de agua. Incubar durante 5 min.
2. Tiras de tejido de transferencia al segundo tubo inferior pequeño y redondo que contiene 2,5 ml de baja Ca2 ⁺ / Mg2 ⁺ Tyrode en el baño de agua ° C 35 ± 1, utilizando la misma pipeta estrecha. Se lavan las tiras de tejido suave por girar el tubo o pipeteando suavemente con la pipeta estrecha. No Invert el tubo.
3. Tiras de tejido transferencia al tercer tubo inferior pequeño y redondo que contiene 2,5 ml de baja Ca2 ⁺ / Mg2 ⁺ Tyrode, y repetir la etapa de lavado se describe en el paso 5.2.
4. Tiras de transferencia en el tubo grande de fondo redondo que contiene 2,5 ml de baja Ca2 ⁺ / Mg2 ⁺ de Tyrode con enzimas (elastasa, más mezcla de colagenasa-proteasa) en el 35 ° C baño de agua. Asegúrese de que las tres tiras de tejido están presentes. Incubar durante 10-15 minutos a 35 ± 1 ° C. Mezclar cada 5 min agitando suavemente el tubo. No invierta el tubo.

6. Nodo sinoauricular miocitos disociación

1. Después de la digestión con enzimas, utilice el estrecho pipeta pulida al fuego para transferir suavemente las tiras de tejido a la primera pequeño tubo de fondo redondo que contiene 2,5 ml de solución de KB a 35 ± 1 ° C. Lavar el tejido girando suavemente el tubo.
   Nota: Las tiras de tejido por parecer algo translúcidos y pueden agruparse en el thes el punto. Manejar con mucho cuidado después de la digestión enzimática para evitar la pérdida de células.
2. Transferir el tejido para el segundo tubo de fondo redondo pequeño que contiene 2,5 ml KB a 35 ± 1 ° C. Agitar suavemente para lavar.
3. Transferir el tejido a la tercera pequeño tubo de fondo redondo que contiene 2,5 ml KB a 35 ± 1 ° C. Agitar suavemente para lavar.
4. Transferir el tejido al tubo grande, de fondo redondo que contiene 2,5 ml KB a 35 ± 1 ° C.
5. Usando la pipeta pulida al fuego más grande (Figura 1Aiii y la Figura 1C), disociar las células en el tubo grande de fondo redondo por trituración constante en aproximadamente 0,5 a 1 Hz durante 5-10 minutos, teniendo cuidado de mantener el tubo de disociación sumergido en el 35 ± 1 ° C baño de agua y para evitar la introducción de burbujas en la solución.
   Nota: El tiempo de trituración varía con el diámetro de la pipeta de la disociación y la fuerza de la pipeta. El tiempo debe ajustarse de modo que las piezas de tejido restante en tél final de la disociación parece delgada, transparente y tenue. Si el tejido retiene cualquier color, la disociación es probable que sea incompleta. Frecuencia (0,5-1 Hz) se determina con la mano.
6. Retire el tubo de fondo redondo que contiene disociado SAMs del baño de agua y se equilibre a temperatura ambiente durante 5 min.

7. Sinoatrial calcio Nodo Readaptación (Realizado a temperatura ambiente)

NOTA: Para SAMs destinado a los experimentos de cultivo, los procedimientos descritos en la sección siguiente se debe realizar en una campana de cultivo de tejido estéril. Si SAMs se van a utilizar para los experimentos agudos, no hay necesidad de realizar estos pasos en un ambiente estéril.

1. Añadir 75 l de NaCl / CaCl solución ₂ adaptación (Tabla 2). Agitar suavemente para mezclar e incubar durante 5 minutos.
2. Añadir 160 l de NaCl / CaCl solución ₂ adaptación. Agitar suavemente para mezclar e incubar durante 5 minutos.
3. Añadir 390 l de BSA al solution (Tabla 2). Agitar suavemente para mezclar e incubar durante 4 min.
4. Añadir 1,25 ml de solución de BSA. Agitar suavemente para mezclar e incubar durante 4 min.
5. Añadir 4,37 ml de solución de BSA. Agitar suavemente para mezclar e incubar durante 4 min.
   Nota: La concentración final de calcio será de 1,8 mM.
6. Después de calcio readaptación, recoger las SAM, permitiendo que conformarse por gravedad por unos 10 minutos o por centrifugación a 2.000 xg durante ~ 3 min.
   1. Para las células aisladas de forma aguda, suavemente retirar y desechar aproximadamente 5 ml del sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio, dejando las células en un volumen de ~ 2 ml. Almacenar estas células a temperatura ambiente durante un máximo de ~ 8 horas para las grabaciones de patch clamp.
   2. Para las células cultivadas, eliminar la mayor cantidad del sobrenadante como sea posible usando una pipeta Pasteur de vidrio estéril. Resuspender pellet de células en 1 ml de pre-calentado (37 ° C) Revestimiento del Medio (Tabla 2).

8. Chapado y Cultura de Sinoatrial Myocitos (Saltar de células aisladas de forma aguda)

1. Retire la solución de laminina de cubreobjetos de la Etapa 3.3 con una pipeta Pasteur. Inmediatamente sembrar 500 l (~ 50-100 células) en cada cubreobjetos recubiertos de laminina (procedente de la etapa 3).
   NOTA: El inhibidor contráctil 2,3-butanodiona monoxima (BDM) está incluido en los medios de comunicación de placas de cultivo y para evitar la contracción, lo que provoca el desgaste de las células ^9.
2. Devolver la placa de 24 pocillos que contiene SAM recién sembrados a la incubadora y mantener a 37 ° C en una atmósfera de 95% de aire / 5% de CO _2. Permitir que las células se adhieran a cubreobjetos durante 4-6 h en medio de siembra (Tabla 2).
3. Retire con cuidado medio de baño con una pipeta Pasteur estéril. Reemplazar con 500 l por pocillo de pre-calentado (37 ° C) Medio de cultivo (Tabla 2).

9. Transducción adenoviral de adulto Los cultivos de miocitos sinoauricular (Pase de células aisladas de forma aguda)

1. Estimar el número de ceLLS por cubreobjetos inmediatamente antes de aplicar adenovirus contando las células en un campo de visión en el microscopio, con ajuste de ampliación. Contar todas las células, no sólo SAM.
2. Diluir adenovirus en un medio 199 y ajustar la dilución para el título viral lo que se requiere que la aplicación de 1 a 10 l para lograr una multiplicidad final de la infección (MOI) de 100 unidades virales por célula. Añadir solución adenoviral de una manera gota a gota directamente sobre SAMs plateado.
3. Se incuban las células con el medio durante la noche que contiene el virus (~ 12-14 hr). Entonces intercambiar con medio de cultivo fresco. Mantener las células en la incubadora, el cambio de medio de cultivo cada 48 horas, hasta que se obtiene la expresión de proteína deseado.

10. La evaluación funcional de forma aguda aislada o cultivada SAMs

NOTA: El siguiente protocolo es un ejemplo de las evaluaciones funcionales de las SAM aislado utilizando el anfotericina técnica de parche perforado para grabar ambos puntos de acceso espontáneas y yo _{f de la misma célula (véase la referencia ^9).}

1. Preparar soluciones de grabación como se describe en la Tabla 3.
2. Preparar una solución madre de 20 mg / ml de anfotericina-B en DMSO fresco en el día de la grabación. Guardar la acción a temperatura ambiente y protegido de la luz. Diluir anfotericina-B de valores en solución intracelular a una concentración final de 200 ug / ml, justo antes del uso. Mantener la solución de la pipeta final sobre hielo y protegerlo de la luz.
   NOTA: La solución de la pipeta que contiene anfotericina-para los experimentos se debe preparar fresco cada hora mediante la dilución de una parte alícuota de la solución madre en la solución intracelular y agitación en vórtex durante al menos 1 min.
3. Transferir una alícuota de la suspensión celular agudamente disociado SAM o un fragmento de cubreobjetos de vidrio que lleva cultivadas SAMs a una cámara de registro que contiene la solución de Tyrode a 35 ± 1 ° C. Perfundir células con solución de Tyrode durante al menos 2 minutos antes de la recordin electrofisiológicogs para eliminar cualquier BDM residual restante del medio de cultivo.
   NOTA: las contracciones espontáneas deben ser evidentes inmediatamente después de la transferencia a la solución de Tyrode. SAMs para la grabación puede ser identificado por una combinación de características que incluyen la actividad contráctil espontánea, morfología característica (por ejemplo., Figura 2), la falta de estrías, la expresión de la proteína HCN4, la presencia de corriente _If, capacitancia de la membrana <50 pF, y espontáneas APs con formas de onda que incluyen una fase de despolarización diastólica y una carrera ascendente lenta.
4. El uso de pipetas de vidrio de borosilicato con resistencias de 1,5-3,0 mO, llenar la punta con una solución intracelular faltaba anfotericina por inmersión durante 10-30 seg. A continuación, volver a llenar la pipeta con la solución que contiene anfotericina. Una junta unida por células GΩ se debe obtener lo más rápidamente posible. Si la formación del sello es difícil, aumentar el tiempo de llenado en la punta.
   NOTA: La resistencia de acceso debe ser continuamentemonitorizados después de la formación de la junta unida a células, y las grabaciones sólo deben iniciarse después de la obtención de una resistencia acceso estable de <10 mO.
5. Para grabar los puntos de acceso espontáneas, conmutar el amplificador a modo de corriente-clamp rápido sin inyección de corriente.
   NOTA: 1 nM isoproterenol se incluye en la solución de Tyrode extracelular durante la grabación de los puntos de acceso para estabilizar la tasa de disparo, como se informó anteriormente ^10.

Resultados

Los protocolos descritos aquí se han empleado anteriormente para aislar SAMs espontáneamente activo a partir de ratones adultos que son adecuados para una variedad de estudios de fijación diferente de parche ^5-8. Además, los protocolos permiten SAMs aislados que se pueden mantener en cultivo durante hasta una semana. La transferencia de genes en las células cultivadas se puede lograr a través de la infección adenoviral ^9. Los resultados presentados en esta se...

Discusión

Este artículo presenta los protocolos detallados para el aislamiento y cultivo de miocitos completamente diferenciadas nodo sinusal a partir de ratones adultos. El protocolo de aislamiento produce de forma fiable SAMs espontáneamente activas de ratón adecuados, ya sea para el análisis electrofisiológico inmediata o posterior cultivo. Protocolos similares han sido reportados por muchos otros grupos (por ejemplo, véanse las referencias ^{11,12,10,13-17).} Sin embargo, nuestro protocolo para el mantenimiento ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgruard/Elastomer Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Borosilicate 9" pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20C
Small, round bottomed culture tubes	Fisher Scientific	352059
Large, round bottomed culture tubes	Corning	14-959-11B
Elastase	Worthington Biochemical	LS002279
Liberase TM	Roche	5401119001	Tissue dissociation solution
Heparin	SAGENT Pharmaceuticals	NDC 25021-400-10
Mouse Laminin	Corning	CB-354232
12 mm round glass coverslips	Fisher	12-545-80
24-well culture plate	Fisher	08-772-1
Ad-mCherry	Vector Biolabs	1767
Ad-eGFP	Vector Biolabs	1060
Plastic, disposable transfer pipette	Fisher Scientific
Micro scissors	Fisher Scientific	17-467-496
Dumont #4 Forceps	Roboz Instruments	RS-4904
Tissue Forceps	Roboz Instruments	RS-8164
Dissecting Iris Scissors	WPI, Inc.	501264
Dissecting Pins	Fine Science Tools	26002-20
NaCl	Sigma	71376
KCl	Sigma	60128
KH2PO4	Sigma	60353
HEPES	Sigma	54457
glucose	Sigma	G0350500
MgCl2	Sigma	M8266
CaCl2	Sigma	C1016
taurine	Sigma	T0625
BSA	Sigma	A2153
K-glutamate	Sigma	G1501
K-aspartate	Sigma	A6558
MgSO4	Sigma	M7506
creatine	Sigma	C0780
EGTA	Sigma	E3889
Mg-ATP	Sigma	A9187
Amphotericin-B	Fisher Scientific	1397-89-3
Isoproterenol	Calbiochem	420355
Media199	Sigma	M4530
2,3-butanedione monoxime (BDM)	Sigma	B0753
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	SH30071
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A5611
Insulin	Sigma	I3146
Transferrin	Sigma	I3146
Selenium	Sigma	I3146
Penicillin	GE Healthcare	SV30010
Streptomycin	Hyclone	SV30010