Méthodes pour l'isolement, la culture et la caractérisation fonctionnelle des sinoatrial Node myocytes de souris adultes

Résumé

Les méthodes sont mises en évidence pour l'isolement des myocytes nœud sino-auriculaire (SAMS) provenant de souris adulte pour les études électrophysiologiques de patch-clamp ou d'imagerie. Les cellules isolées peuvent être utilisés directement ou peuvent être maintenues en culture pour permettre l'expression de protéines d'intérêt, comme rapporteurs codés génétiquement.

Résumé

myocytes nœud sinusal (GSB) agissent comme les stimulateurs cardiaques naturelles du cœur, initiant chaque battement de coeur en générant des potentiels d'action spontanés (AP). Ces points d'accès du stimulateur reflètent l'activité coordonnée de nombreux courants membranaires et intracellulaires vélo de calcium. Cependant, les mécanismes précis qui animent l'activité pacemaker spontanée dans SAMs demeurent insaisissables. Pleinement SAMs isolées sont une préparation essentielle pour les expériences de disséquer la base moléculaire de pacemaker cardiaque. Cependant, l'anatomie indistincte, microdissection complexe, et les conditions de digestion enzymatique tatillonnes ont empêché l'utilisation généralisée de aiguë isolée GSB. En outre, les méthodes ne sont pas disponibles jusqu'à récemment pour permettre la culture à long terme de SAMs pour les études d'expression de protéines. Ici, nous fournissons un protocole et vidéo de démonstration étape par étape pour l'isolement des SAMs de souris adultes. Un procédé est également démontrée pour le maintien de la souris adulte GSB in vitro et pour expressisur des protéines exogènes par une infection adénovirale. Pleinement isolées et cultivées SAMs préparées par ces procédés sont appropriés pour une variété d'études électrophysiologiques et d'imagerie.

Introduction

myocytes pacemakers dans le nœud sinusal du cœur (myocytes sinoatrial, "GSB") génèrent, potentiels spontanés rythmiques d'action (PA) qui se propagent à travers le myocarde pour initier chaque battement de cœur. Des expériences utilisant SAMs aiguë isolées de nombreuses espèces ont été essentiels pour l'élucidation des mécanismes qui contribuent à la génération de l'activité pacemaker. SAMs sont cardiomyocytes hautement spécialisées qui diffèrent sensiblement de leurs homologues de l'auriculaire et ventriculaire myocardique en termes de morphologie, la fonction et l'expression des protéines. La marque de points d' accès spontanés dans GSB est une dépolarisation spontanée pendant la diastole qui conduit le potentiel de membrane au seuil pour déclencher le prochain point d' accès de ^1,2. Ce «potentiel de stimulateur" dépend de l'activité coordonnée de nombreux courants différents de la membrane , y compris la «drôle de courant" (I _f), T et de type L courants de calcium et le sodium-calcium échangeur current (I _NCX), qui est entraîné par Ca la libération du réticulum sarcoplasmique ^3,4.

Alors que la souris aiguë isolée SAMs sont une préparation expérimentale essentielle pour l'étude de pacemaker, l'isolement des SAMs de souris peut être une méthode difficile à adopter, car l'anatomie indistincte et la petite taille du SAN souris nécessite une microdissection nuancée et enzymatique combiné et mécanique dissociation des cellules nécessite une optimisation minutieuse.

Nous fournissons ici une vidéo de démonstration détaillée d'un protocole qui a été utilisé avec succès pour isoler SAMs de souris adultes pour les enregistrements de patch clamp ^5-8. À notre connaissance, il n'y a pas une telle démonstration visuelle disponible à partir de toute autre source. En outre, une nouvelle méthode est mise en évidence dans laquelle isolé GSB de souris adultes peuvent être maintenues in vitro pendant plusieurs jours, ce qui permet l'introduction de protéines codées génétiquementmolécules reporters ou ARNi via une infection adénovirale ^9.

Protocole

Toutes les procédures animales ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université du Colorado Anschutz Medical Campus. Le protocole standard ci-dessous a été optimisé en utilisant mâle C57BL / 6J de 2-3 mois d'âge.

1. Préparer les stocks et les fournitures de solutions à l'avance des expériences

REMARQUE: Se reporter au tableau des matériaux pour le matériel et les fournitures nécessaires.

1. Préparer 1 litre chacune des solutions suivantes , comme indiqué dans le tableau 1, faible teneur en Ca ²⁺ / Mg ²⁺ Tyrode, modifié Kraft Brühe (KB) de solutions et de sérumalbumine bovine (BSA) Solution complète Tyrode. Utiliser ultrapure filtrée l'eau déminéralisée pour toutes les solutions. Divisez chaque solution dans 50 ml aliquotes et stocker à 20 ° C pendant jusqu'à six mois. Décongeler aliquotes individuelles immédiatement avant les expériences, et de stocker jusqu'à une semaine à 46; C.
2. Préparer 50 ml de NaCl 10 mM et 1,8 mM de CaCl ₂ Adaptation solution en dissolvant du NaCl et CaCl ₂ dans ultrapure filtrée de l' eau déminéralisée (tableau 1). Stocker à température ambiante pendant un maximum de six mois.
3. Préparer 4,75 unité d'activité enzymatique (U) aliquotes de élastase par pipetage dans des tubes de microcentrifugation. Conserver à 4 ° C pendant jusqu'à trois mois.
4. Préparer des aliquotes de 375 ug (dans ultrapure H ₂ O) de mélange enzymatique de collagénase-protéase par pipetage dans des tubes de microcentrifugation. Conserver à -20 ° C pendant jusqu'à trois mois.
5. Préparer deux pipettes Pasteur polies au feu, l' un pour le transfert du tissu (~ diamètre d'ouverture finale de 1,5 mm, la figure 1Aiv et la figure 1c) et une pour la dissociation (~ de 2 mm de diamètre, la figure 1Aiii et la figure 1C).
   1. Score pipettes Pasteur avec un coupe-verre et enclenchent le long de la partition pour produire une ouverture légèrement plus grande que la taille souhaitée. Feu-Polonais la fin de chaque pipette de coupe pour ~ 30-60 sec sur une petite flamme sur un brûleur Bunsen pour produire une paroi épaisse et polie d'une ouverture du diamètre désiré. Assurez-vous de l'ouverture polie au feu est exempt de toute fissure ou bords rugueux.
6. Préparer deux plats de dissection en ajoutant ~ 25 ml d' élastomère de silicone mélangé selon les instructions du fabricant à chaque plat de 100 mm de Pétri (Figure 1AI et la figure 1B). Laisser sécher à la température ambiante pendant 48 heures.
7. Pour la culture seulement: préparer 25-50 ml chaque Placage moyen et milieu de culture selon le tableau 2 magasin jusqu'à deux semaines à 4 ° C..

2. Préparer des solutions à utiliser sur la Journée de la cellule d'isolement

REMARQUE: Les montants suivants sont pour l'isolement des myocytes sinoatrial d'une souris.

1. Ajouter 2,5 ml de faible Ca ²⁺ / Mg ²⁺ (le pH 6,9) de Tyrode à chacun des trois petits tubes de culture, à fond ronds. Placer les tubes dans un bain d'eau 35 ± 1 ° C.
2. Ajouter 2,5 ml de faible Ca ²⁺ / à un grand tube de culture à fond rond de Mg ²⁺ Tyrode. Pour ce tube, ajoutez 1 aliquote (4,75 U) élastase et une aliquote (375 ug) enzyme de mélange de collagénase-protéase. Agiter pour mélanger. Placer le tube dans 35 ± 1 ° C bain d'eau.
3. Ajouter 2,5 ml de KB moyenne à trois petits tubes de culture à fond rond supplémentaires et un grand tube supplémentaire, à fond rond culture. Placer les tubes dans un bain d'eau 35 ± 1 ° C.
4. Ajouter ~ 7 ml de solution de BSA à un grand tube de culture à fond. Gardez ce tube à la température ambiante.
5. Placer 20-40 ml de solution de Tyrode complète dans un bécher de 50 ml (figure 1Aii). Ajouter 10 USP / ml d'héparine, agiter pour mélanger, et placer le bécher dans le bain ° C de l'eau 35 ± 1.

3. Préparer des solutions et des matériaux supplémentaires pour les cellules cultivées (Passer ces étapes pour les cellules isolées Aiguë)

1. Dans une culture de tissu hotte stérile, placer deux 12 mm lamelles de verre rondes par souris dans des puits individuels d'une plaque de 24 puits.
   NOTE: La plaque 24 puits est utilisée parce que les puits sont d'une taille convenable, qui sert à limiter le volume pour les infections virales ultérieures.
2. Introduire à la pipette environ 200 ul d'une solution à 100 ng / ml de laminine de souris dilué dans du phosphate stérile saline tamponnée (PBS) sur chaque lamelle.
3. Incuber avec des lamelles couvre-laminine pour la durée de l'isolement (au moins 1 heure) dans un incubateur à 37 ° C.
4. Préchauffer le Placage moyen et milieu de culture (de l' étape 1.7 et le tableau 3) à 37 ° C.

4. nœud sinusal Isolation

1. Dans une hotte chimique, placer une souris dans une chambre d'une boîte à deux chambres et anesthésier avec ~ 200 pi isoflurane liquide introduit par l'intermédiaire d'un coton-tige dans l'autre chambre. Confirmer l'anesthésie (généralement dans ~ 30-60 sec) avec une pincée d'orteil. Euthanasiersouris par dislocation cervicale.
   NOTE: Un 1 ml boîte de pointe de la pipette vide peut être utilisé pour former la boîte à deux compartiments; tourner la grille à l'envers dans la boîte pour créer le compartiment séparé pour l'isoflurane pour empêcher la souris de la mise en contact directe.
2. Retirer la fourrure de la poitrine avec des ciseaux et transect cage thoracique afin d' exposer la cavité thoracique en utilisant des pinces externes de tissus (Figure 1Aviii) et des ciseaux de dissection (Figure 1Avix). Baignez la cavité thoracique avec ~ 2 ml réchauffés complète Tyrode avec Héparine à l'aide d'une pipette de transfert.
   REMARQUE: Continuer la cavité thoracique de baignade lorsque cela est nécessaire, ne permet pas la préparation de sécher.
3. Sous un microscope à dissection, retirer soigneusement les poumons et le thymus avec des ciseaux internes (Figure 1Avi) et des pinces de dissection (Figure 1Avii).
4. Tout en tenant délicatement la pointe du cœur avec la pince de dissection internes, découpez soigneusement la veine cave inférieure et unorta avec les ciseaux internes pour retirer le coeur de la cavité thoracique. Transférer le cœur à l'un des plats de dissection de silicone et se baigner avec ~ 4 ml réchauffait les héparinisés complète Tyrode à l'aide de la pipette de transfert.
5. Orient au cœur de telle sorte que les vaisseaux postérieurs sont visibles et vers le haut, avec l'oreillette droite de l'animal sur le droit de l'expérimentateur et l'oreillette gauche sur la gauche de l'expérimentateur. Une fois orienté, immobiliser le coeur en épinglant par le sommet dans le plat silicone de dissection.
6. Localisez la rainure entre les ventricules et les oreillettes (anneau clair au- dessus des ventricules).
7. À l'aide des ciseaux de dissection internes, faire une incision à la gorge, en gardant plus près des ventricules que les oreillettes. Rincer la gorge et incision avec ce que nécessaire supplémentaire réchauffé hépariné Tyrode complète pour permettre une vue dégagée sur les oreillettes et les valves. Continuer à couper le long de la rainure pour séparer les oreillettes des ventricules.
8. Transférer le tissu auriculaire pour le deuxième plat silicone de dissection et se baigner avec ~ 3 ml réchauffait les héparinisés Tyrode complet de.
9. Orientez le tissu de telle sorte que l'oreillette droite de l'animal est maintenant sur la gauche de l'expérimentateur et l'oreillette gauche est sur la droite.
   NOTE: L'oreillette droite est plus transparent, tandis que l'oreillette gauche a plus d'un ton rouge foncé.
10. Pin le tissu à travers la veine cave inférieure et supérieure et le droit et les appendices auriculaires gauche, étirant doucement la préparation. Retirez tout le tissu adipeux ou d'autres restant pour permettre une vision claire de la préparation (attention à ne pas couper dans la paroi de l'oreillette, le nœud sinusal est assez délicate et peut facilement être endommagé).
11. Ouvrez la paroi antérieure de l'oreillette en coupant à travers des veines caves. Re-positionner les broches que nécessaire pour visualiser le septum interauriculaire.
12. Couper le long du septum interauriculaire pour enlever l'oreillette gauche. Re-épingler la préparation, étirant doucement.
13. Retirer til oreillette droite appendice et libérer le nœud sinusal en coupant le long de la terminalis cristae, qui apparaît comme une traînée orange foncé en bordure de l'appendice auriculaire.
14. Re-épingler le tissu nodal et le couper latéralement (perpendiculairement à la crête terminale) pour produire trois bandes de taille égale.

5. sinusal Nœud Digestion

1. Utilisation de la poli-feu étroite pipette (Figure 1Aiv), transférer les trois bandes de tissu de nœud sinusal dans le premier de trois petit tube, à fond rond contenant 2,5 ml de faible teneur en Ca ²⁺ / Mg ²⁺ Tyrode dans le 35 ± 1 ° bain-marie. Incuber pendant 5 min.
2. Bandes de tissu de transfert au second petit tube, à fond rond contenant 2,5 ml à faible Ca ²⁺ / Mg ²⁺ Tyrode dans la salle de bain ° C de l' eau 35 ± 1, en utilisant la même pipette étroite. Laver les bandes de tissu en douce tourbillonnant le tube ou en pipetant doucement avec la pipette étroite. Ne invert le tube.
3. Bandes de tissu de transfert à la troisième petit tube, à fond rond contenant 2,5 ml à faible Ca ²⁺ / Mg ²⁺ Tyrode, et répéter l'étape de lavage décrite à l' étape 5.2.
4. Des bandes de transfert dans le grand tube à fond rond contenant 2,5 ml d' une faible teneur en Ca ²⁺ / Mg ²⁺ de Tyrode avec des enzymes (élastase ainsi que la collagénase-protéase mélange) dans le bain d'eau à 35 ° C. Veiller à ce que les trois bandes de tissu sont présents. Incuber pendant 10-15 min à 35 ± 1 ° C. Mélanger tous les 5 min en remuant doucement le tube. Ne pas inverser le tube.

6. sinusal Nœud myocytes Dissociation

1. Suite à la digestion enzymatique, utilisez l'étroite pipette polie au feu pour transférer doucement les bandes de tissu au premier petit tube, à fond rond contenant 2,5 ml KB solution à 35 ± 1 ° C. Laver le tissu en remuant doucement le tube.
   Remarque: des bandes de tissus apparaissent peu translucides et peuvent se regrouper au thest le point. Poignée très doucement après digestion enzymatique pour éviter de perdre des cellules.
2. Transférer le tissu au second petit tube à fond rond contenant 2,5 ml KB à 35 ± 1 ° C. Agiter doucement pour se laver.
3. Transférer le tissu à la troisième petit tube à fond rond contenant 2,5 ml KB à 35 ± 1 ° C. Agiter doucement pour se laver.
4. Transférer le tissu au tube large, à fond rond contenant 2,5 ml KB à 35 ± 1 ° C.
5. Utilisation de la plus grande pipette polie au feu (Figure 1Aiii et la figure 1C), dissocier les cellules dans le grand tube à fond rond par trituration constante à environ 0,5-1 Hz pendant 5-10 minutes, en prenant soin de garder le tube de dissociation immergée dans le 35 ± 1 ° C bain d'eau et d'éviter l'introduction de bulles dans la solution.
   Note: Le temps Trituration varie avec le diamètre de la pipette de dissociation et la force de pipetage. Le temps devrait être ajustée de sorte que les morceaux de tissu restant à til fin de la dissociation semble mince, transparent et vaporeux. Si le tissu conserve toutes les couleurs, la dissociation est susceptible d'être incomplète. Fréquence (0,5-1 Hz) est déterminé par la main.
6. Retirer le tube à fond rond contenant dissocié SAMs du bain d'eau et équilibrer à la température ambiante pendant 5 min.

7. sinusal Nœud Calcium Re-adaptation (Joué à température ambiante)

NOTE: Pour SAMs destiné à des expériences de culture, les procédures décrites dans la section suivante doivent être effectuées dans une hotte de culture tissulaire stérile. Si les SAM doivent être utilisés pour des expériences aiguës, il n'y a pas besoin d'effectuer ces opérations dans un environnement stérile.

1. Ajouter 75 ul de NaCl / CaCl solution d'adaptation ₂ (tableau 2). Agiter doucement pour mélanger et incuber pendant 5 min.
2. Ajouter 160 pi de NaCl / CaCl ₂ Solution d'adaptation. Agiter doucement pour mélanger et incuber pendant 5 min.
3. Ajouter 390 ul de BSA solution (Tableau 2). Agiter doucement pour mélanger et incuber pendant 4 min.
4. Ajouter 1,25 ml de solution de BSA. Agiter doucement pour mélanger et incuber pendant 4 min.
5. Ajouter 4,37 ml de solution de BSA. Agiter doucement pour mélanger et incuber pendant 4 min.
   Remarque: La concentration finale en calcium sera de 1,8 mM.
6. Après calcium ré-adaptation, collecter des SAMs en permettant de régler par gravité pour ~ 10 min ou par centrifugation à ~ 2.000 g pendant 3 min.
   1. Pour les cellules aiguë isolées, retirez délicatement et jeter environ 5 ml du surnageant à l'aide d'une pipette Pasteur en verre, en laissant les cellules dans un volume de ~ 2 ml. Conservez ces cellules à la température ambiante jusqu'à environ 8 h pour les enregistrements de patch-clamp.
   2. Pour les cellules en culture, retirer autant de surnageant que possible à l'aide d'une pipette Pasteur en verre stérile. Resuspendre le culot cellulaire dans 1 ml préchauffé (37 ° C) plaquant moyenne (tableau 2).

8. Placage et Culture de sinusal Myocytes (Aller pour les cellules isolés de manière aiguë)

1. Éliminer la solution de laminine à partir de lamelles de l'étape 3.3 avec une pipette Pasteur. ensemencer immédiatement 500 pi (~ 50-100 cellules) sur chaque lamelle de laminine revêtu (de l'étape 3).
   NOTE: Le 2,3-butanedione monoxime inhibiteur contractile (BDM) est inclus dans les milieux d'étalement et de la culture afin d' éviter la contraction, ce qui provoque l' usure des cellules ^9.
2. Remettre la plaque de 24 puits contenant SAMs nouvellement ensemencées dans l'incubateur et maintenir à 37 ° C dans une atmosphère de 95% d' air / 5% de CO _2. Permettre aux cellules d'adhérer à lamelles pour 4-6 heures dans les médias de placage (tableau 2).
3. Retirez délicatement Placage moyen à l'aide d'une pipette Pasteur stérile. Remplacer avec 500 pi par puits de pré-chauffé (37 ° C) Milieu de culture (tableau 2).

9. transduction adénovirale des adultes Cultures myocytes sinusal (Aller pour les cellules isolées Aiguë)

1. Estimer nombre de CEIIs par lamelle couvre-objet immédiatement avant l'application d'adenovirus en comptant les cellules dans un champ de vision sous un microscope, pour ajuster le grossissement. Comptez toutes les cellules, non seulement GSB.
2. Diluer adénovirus dans du milieu 199 et ajuster la dilution pour le titre viral de telle sorte que l'application de 1 à 10 ul est nécessaire pour obtenir une multiplicité finale d'infection (MOI) de 100 unités virales par cellule. Ajouter la solution adénovirale dans un goutte à goutte directement sur plaqué GSB.
3. Incuber les cellules avec le milieu pendant une nuit contenant le virus (~ 12-14 h). Puis échanger avec un milieu de culture frais. Maintenir les cellules dans un incubateur, en changeant le milieu de culture toutes les 48 h jusqu'à ce que l'expression de la protéine désirée soit obtenue.

10. Evaluation fonctionnelle des Aiguë Isolated ou Cultured SAMs

NOTE: Le protocole suivant est un exemple des évaluations fonctionnelles des isolés SAMs en utilisant la technique amphotéricine perforé-patch pour enregistrer les deux points d'accès spontanés et moi _{f de la même cellule (voir référence ^9).}

1. Préparer des solutions d'enregistrement comme décrit dans le tableau 3.
2. Préparer une solution mère de 20 mg / ml d'amphotéricine-B dans le DMSO frais le jour de l'enregistrement. Gardez stock à la température ambiante et protéger de la lumière. Diluer amphotéricine-B disponible en solution intracellulaire à une concentration finale de 200 ug / ml juste avant utilisation. Maintenir la solution de pipette finale sur la glace et protéger de la lumière.
   NOTE: La solution de pipette contenant amphotéricine pour des expériences doit être préparé horaire en diluant une aliquote de la solution mère dans la solution intracellulaire et tourbillonnement pendant au moins 1 min.
3. Transférer une aliquote de l'acuité dissociées SAM suspension cellulaire ou un fragment de la lamelle de verre portant culture GSB à une chambre d'enregistrement contenant une solution de Tyrode à 35 ± 1 ° C. Perfuser les cellules avec une solution de Tyrode pendant au moins 2 minutes avant recordin électrophysiologiquegs pour éliminer tout MBD résiduel restant à partir du milieu de culture.
   REMARQUE: les contractions spontanées devraient être évidents immédiatement après le transfert à la solution de Tyrode. SAMs pour l' enregistrement peut être identifié par une combinaison de fonctionnalités , y compris l' activité contractile spontanée, morphologie caractéristique (par exemple., Figure 2), le manque de striures, expression de la protéine HCN4, présence de I _f courant, membrane capacitance <50 pF, et spontanés AP avec des formes d'onde qui comprennent une phase de dépolarisation diastolique et un upstroke lent.
4. Utilisation de pipettes en verre borosilicate avec des résistances de 1,5-3,0 MQ, remplir la pointe avec une solution intracellulaire manquant de l'amphotéricine par trempage pour 10-30 sec. Puis retour-remplir la pipette avec la solution contenant de l'amphotéricine. Un joint d'étanchéité joint cellulaire-GQ devrait être obtenue aussi rapidement que possible. Si la formation de joint est difficile, augmenter le temps tip-remplissage.
   NOTE: La résistance d'accès doit être continusurveillés après la formation du joint cellule attachée, et les enregistrements ne devraient être intentées après l'obtention d'une résistance d'accès stable de <10 MQ.
5. Pour enregistrer les points d'accès spontanés, passer l'amplificateur en mode courant-clamp rapide sans injection de courant.
   NOTE: 1 nM isoprotérénol est inclus dans la solution de Tyrode extracellulaire lors de l' enregistrement des points d' accès pour stabiliser le taux de tir, comme indiqué précédemment ^10.

Résultats

Les protocoles décrits ici ont été précédemment employés pour isoler GSB spontanément actifs de souris adultes qui sont appropriés pour une variété de brassage de différentes études de blocage ^5-8. En outre, les protocoles permettent de SAMs isolés qui peuvent être maintenues en culture pendant jusqu'à une semaine. Transfert de gène dans les cellules en culture peut être réalisée par l' intermédiaire d'une infection adénovirale ^9. Le...

Discussion

Cet article présente des protocoles détaillés pour l'isolement et la culture de complètement différenciées myocytes nœud sinusal de souris adultes. Le protocole d'isolement produit fiable SAMs de souris spontanément actifs appropriés soit pour l'analyse électrophysiologique immédiate ou la culture subséquente. Des protocoles similaires ont été rapportés par de nombreux autres groupes (par exemple, voir les références ^{11,12,10,13-17).} Cependant, notre protocole pour le maintien de ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgruard/Elastomer Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Borosilicate 9" pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20C
Small, round bottomed culture tubes	Fisher Scientific	352059
Large, round bottomed culture tubes	Corning	14-959-11B
Elastase	Worthington Biochemical	LS002279
Liberase TM	Roche	5401119001	Tissue dissociation solution
Heparin	SAGENT Pharmaceuticals	NDC 25021-400-10
Mouse Laminin	Corning	CB-354232
12 mm round glass coverslips	Fisher	12-545-80
24-well culture plate	Fisher	08-772-1
Ad-mCherry	Vector Biolabs	1767
Ad-eGFP	Vector Biolabs	1060
Plastic, disposable transfer pipette	Fisher Scientific
Micro scissors	Fisher Scientific	17-467-496
Dumont #4 Forceps	Roboz Instruments	RS-4904
Tissue Forceps	Roboz Instruments	RS-8164
Dissecting Iris Scissors	WPI, Inc.	501264
Dissecting Pins	Fine Science Tools	26002-20
NaCl	Sigma	71376
KCl	Sigma	60128
KH2PO4	Sigma	60353
HEPES	Sigma	54457
glucose	Sigma	G0350500
MgCl2	Sigma	M8266
CaCl2	Sigma	C1016
taurine	Sigma	T0625
BSA	Sigma	A2153
K-glutamate	Sigma	G1501
K-aspartate	Sigma	A6558
MgSO4	Sigma	M7506
creatine	Sigma	C0780
EGTA	Sigma	E3889
Mg-ATP	Sigma	A9187
Amphotericin-B	Fisher Scientific	1397-89-3
Isoproterenol	Calbiochem	420355
Media199	Sigma	M4530
2,3-butanedione monoxime (BDM)	Sigma	B0753
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	SH30071
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A5611
Insulin	Sigma	I3146
Transferrin	Sigma	I3146
Selenium	Sigma	I3146
Penicillin	GE Healthcare	SV30010
Streptomycin	Hyclone	SV30010