Verfahren zur Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung von Sinoatrialknoten Myozyten aus erwachsenen Mäusen

Zusammenfassung

Es sind Verfahren zur Isolierung von Sinusknoten Myozyten (SAMs) von erwachsenen Mäusen für Patch-Clamp-Elektrophysiologie oder Bildgebungsstudien demonstriert. Isolierte Zellen können direkt oder aufrechterhalten werden kann in Kultur zu ermöglichen, die Expression von Proteinen von Interesse, beispielsweise genetisch codierten Reporter verwendet.

Zusammenfassung

Sinoatrialknoten Myozyten (SAMs) fungieren als natürliche Schrittmacher des Herzens, jedes Herz durch die Erzeugung spontanen Aktionspotentiale (APs) schlagen zu initiieren. Diese Schrittmacher APs reflektieren die koordinierte Aktivität zahlreicher Membranströme und intrazellulären Calcium Radfahren. Allerdings sind die genauen Mechanismen, die eine spontane Schrittmacheraktivität in SAMs fahren bleiben schwer zu fassen. Akut isoliert SAMs sind eine wesentliche Vorbereitung für Experimente, die molekulare Basis von Herzschrittmacher zu sezieren. Allerdings ist die undeutliche Anatomie, komplexe Mikrodissektion und pingelig enzymatische Verdauung Bedingungen haben eine weit verbreitete Verwendung von akut isolierten SAMs verhindert. Außerdem wurden Verfahren erst kürzlich längerfristige Kultur von SAMs für die Proteinexpression Studien zu ermöglichen. Hier bieten wir eine Schritt-für-Schritt-Protokoll und Video-Demonstration für die Isolierung von SAMs von erwachsenen Mäusen. Ein Verfahren ist auch für die Aufrechterhaltung der erwachsenen Maus SAMs in vitro und für expressi demonstriertauf exogener Proteine ​​über Adenovirus-Infektion. Akut isoliert und mittels dieser Verfahren hergestellt SAMs sind für eine Vielzahl von elektrophysiologischen und Bildgebungsuntersuchungen geeignet.

Einleitung

Schrittmachers Myozyten im Sinusknoten des Herzens (sinoatrial myocytes "SAMs") erzeugen spontane rhythmische Aktionspotentiale (APs), die durch das Myokard ausbreiten jedem Herzschlag zu initiieren. Experimente mit akut isoliert SAMs aus vielen Arten zur Aufklärung von Mechanismen wesentlich gewesen, die auf die Erzeugung von Schrittmacheraktivität beitragen. SAMs sind hoch spezialisierte Kardiomyozyten, die im Wesentlichen von ihren Kollegen in der atriale und ventrikuläre Myokard in Bezug auf die Morphologie, Funktion und Proteinexpression unterscheiden. Das Markenzeichen der spontanen APs in SAMs ist eine spontane Depolarisation während der Diastole, die das Membranpotential zu Schwelle treibt die nächste AP ^1,2 auszulösen. Dieses "Schrittmacher Potential" hängt von der koordinierten Aktivität vieler verschiedener Membranströme , einschließlich der "lustige Strom" (I _f), T- und L-Typ - Calciumströme und der Natrium-Kalzium - Austauscher current (I _NCX), die ^3,4 von Ca ²⁺ Freisetzung aus dem Retikulum angetrieben wird.

Während akut isolierten Maus SAMs eine wesentliche experimentelle Vorbereitung für die Untersuchung von Schrittmacher- sind, kann die Isolierung von SAMs von Mäusen ein herausforderndes Methode zu übernehmen, weil die undeutliche Anatomie und die geringe Größe des Maus-SAN eine nuancierte Mikrodissektion und das kombinierte enzymatische und mechanische erfordert Dissoziation der Zellen erfordert eine sorgfältige Optimierung.

Wir bieten hier eine detaillierte Video - Demonstration eines Protokolls, das für Patch - Clamp - Aufnahmen erfolgreich zur Isolierung ^5-8 von erwachsenen Mäusen SAMs wurde. Unseres Wissens gibt es keine solche visuelle Demonstration zur Verfügung aus einer anderen Quelle. Zusätzlich wird ein neues Verfahren gezeigt , in denen getrennt SAMs von erwachsenen Mäusen können in vitro für einige Tage aufrechterhalten werden, wodurch die Einführung von Proteinen, genetisch kodierteReportermoleküle oder RNAi über Adenovirus - Infektion ^9.

Protokoll

Alle Tier Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Protokollen von der Institutional Animal Care und Use Committee der University of Colorado Anschutz Medical Campus genehmigt durchgeführt. Das Standardprotokoll unten wurde unter Verwendung von männlichen C57BL / 6J-Mäuse von 2-3 Monate alt optimiert.

1. Bereiten Lösung Stocks und Zubehör im Vorfeld der Experimente

HINWEIS: Siehe Werkstoff - Tabelle für die notwendige Ausrüstung und Zubehör.

1. Bereiten Sie 1 L jeder der folgenden Lösungen , wie in Tabelle 1 angegeben: Komplette Tyrode, Low Ca ²⁺ / Mg ²⁺ Tyrode, modifizierte Kraft-Brühe (KB) Lösung und Rinderserumalbumin (BSA) Lösung. Verwenden Sie Reinst-VE-Wasser für alle Lösungen gefiltert. Teilen Sie jede Lösung in 50 ml Aliquots und lagern bei 20 ° C für bis zu sechs Monate. Tauen Sie sofort einzelne Aliquots vor Experimenten und speichern bis zu einer Woche bei 46; C.
2. Vorbereitung 50 ml 10 mM NaCl und 1,8 mM CaCl ₂ Adaptation Lösung durch NaCl und CaCl ₂ in ultrareinem gefiltertes entionisiertes Wasser gelöst (Tabelle 1). Lagerung bei Raumtemperatur für bis zu sechs Monate.
3. Bereiten 4,75 Enzymaktivität (U) Aliquots von Elastase durch Pipettieren in Mikrozentrifugenröhrchen. Lagerung bei 4 ° C für bis zu drei Monaten.
4. Bereiten 375 ug Aliquoten (in ultrareinem H ₂ O) von Kollagenase-Protease - Enzym - Mischung durch Pipettieren in Mikrozentrifugenröhrchen. Lagerung bei -20 ° C für bis zu drei Monaten.
5. Bereiten Sie zwei feuerpolierten Pasteur - Pipetten, eine für Gewebetransfer (~ 1,5 mm Abschlussöffnungsdurchmesser, Figur 1Aiv und 1C) und eine für Dissoziation (~ 2 mm Durchmesser; Abbildung 1Aiii und 1C).
   1. Score Pasteurpipetten mit einem Glasschneider und Snap entlang der Partitur eine Öffnung etwas größer ist als die gewünschte Größe zu erzeugen. Feuer-Polnisch das abgeschnittene Ende jeder Pipette für ~ 30-60 sec auf kleiner Flamme auf einem Bunsenbrenner eine dicke polierte Wand und eine Öffnung des gewünschten Durchmesser zu erzeugen. Sicherstellen, dass die feuerpolierte Öffnung frei von Rissen oder Ecken und Kanten ist.
6. Bereiten Sie zwei Dissektion Gerichte durch Zugabe von ~ 25 ml Silikon - Elastomer gemäß den Anweisungen des Herstellers zu jeweils 100 mm Petrischale (Abbildung 1Ai und 1B). Man lässt 48 Stunden bei Raumtemperatur aushärten.
7. Für Kultur nur: Vorbereitung 25-50 ml je Plating Medium und Kulturmedium gemäß Tabelle 2 Speicher für bis zu zwei Wochen bei 4 ° C..

2. Bereiten Sie Lösungen zu verwenden zum Tag der Zellisolation

HINWEIS: Die folgenden Mengen sind für die Isolierung von sinoatrial Myozyten von einer Maus.

1. Hinzufügen 2,5 ml Low Ca ²⁺ / Mg ²⁺ Kulturröhrchen Tyrode-(pH 6,9) in jede von drei kleinen, Rundbodens. Die Röhrchen in 35 ± 1 ° C Wasserbad.
2. In 2,5 ml Low Ca ²⁺ / Mg ²⁺ Tyrode zu einem großen Rundbodenkulturröhrchen. Zu diesem Rohr, fügen Sie 1 Aliquot (4,75 U) Elastase und eine aliquote Menge (375 ug) Kollagenase-Protease-Enzym-Mischung. Swirl zu mischen. Das Röhrchen in 35 ± 1 ° C Wasserbad.
3. In 2,5 ml KB Medium zu drei weitere kleine, runde Bodenkulturröhrchen und einem zusätzlichen großen Rundbodenkulturröhrchen. Die Röhrchen in 35 ± 1 ° C Wasserbad.
4. In ~ 7 ml BSA-Lösung zu einem großen Boden versehenen Kulturröhrchen. Halten Sie dieses Rohr bei Raumtemperatur.
5. Platzieren 20-40 ml komplettem Tyrode-Lösung in einem 50 ml Becherglas (Abbildung 1Aii). In 10 USP / ml Heparin, Wirbel zu mischen, und das Becherglas in der C-Wasserbad 35 ± 1 °.

3. Bereiten Weitere Lösungen und Materialien für die kultivierten Zellen (für Akut isolierte Zellen diese Schritte überspringen)

1. In einer sterilen Kultur Haube Gewebe, indem Sie zwei 12 mm runden Glasplättchen pro Maus in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Platte.
   HINWEIS: Die 24-Well-Platte verwendet wird, da die Vertiefungen eine bequeme Größe sind, die das Volumen für eine nachfolgende virale Infektionen zu begrenzen, dient.
2. Pipette etwa 200 ul einer 100 ng / ml Lösung von Laminin der Maus verdünnt in steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf jedem Deckglas.
3. Inkubieren Deckgläser mit Laminin für die Dauer der Trennung (mindestens 1 Stunde) in einem Inkubator bei 37 ° C.
4. Vorwärmen die Plating Medium und Kulturmedium (aus Schritt 1.7 und Tabelle 3) bis 37 ° C.

4. Sinoatrialknoten Isolation

1. In einer chemischen Abzugshaube, legen Sie eine Maus in einer Kammer eines Zweikammer-Box und betäuben mit ~ 200 & mgr; l Flüssigkeit Isofluran über ein Wattestäbchen in die andere Kammer eingeführt. Bestätigen Anästhesie (in der Regel innerhalb von ~ 30-60 sec) mit einer Zehe Prise. euthanizeMaus durch zervikale Dislokation.
   HINWEIS: Eine leere 1 ml Pipettenspitze Box kann die Zwei-Kammer-Box zu bilden, verwendet werden; drehen Sie das Rack den Kopf in der Box das separate Fach für die Isofluran erstellen, um die Maus zu verhindern, dass es direkt zu kontaktieren.
2. Entfernen Pelz von der Brust mit einer Schere und transect Brustkorb der Brusthöhle mit externen Gewebezange (Abbildung 1Aviii) und Dissektion Schere (Abbildung 1Avix) aussetzen. Bathe die Brusthöhle mit ~ 2 ml Komplett Tyrode mit Heparin unter Verwendung einer Transferpipette erwärmt.
   HINWEIS: Badebrusthöhle Weiter, wenn nötig, nicht zulassen, dass die Zubereitung zu trocknen.
3. Unter einem Binokular, entfernen Sie sorgfältig in die Lunge und Thymus mit internen Schere (Abbildung 1Avi) und Dissektion Pinzette (Abbildung 1Avii).
4. Während sanft die Spitze des Herzens mit den internen Dissektion Pinzette, schneiden Sie vorsichtig die untere Hohlvene und die eineorta mit den inneren Schere das Herz aus der Brusthöhle zu entfernen. Übertragen Sie das Herz eines der Silikon-Dissektion Gerichte und baden mit ~ 4 ml Komplett Tyrode mit der Transferpipette heparinisiert erwärmt.
5. Richten Sie das Herz, so dass die hinteren Gefäße sichtbar sind und nach oben, mit dem rechten Vorhof des Tieres auf der rechten Abwehr Experimentator und linken Vorhof auf der linken Seite des Experimentators. Einmal ausgerichtet ist, zu immobilisieren Gericht das Herz durch Pinning durch die Spitze in die Silikon-Dissektion.
6. Suchen Sie die Nut zwischen den Ventrikeln und den Vorhöfen (clear Ring über dem Ventrikel).
7. Unter Verwendung der internen Dissektion Schere, machen einen Schnitt an der Nut, halten näher an den Ventrikel als die Vorhöfe. Spülen Sie die Nut und Schnitt mit zusätzlichen gewärmt heparinisiert komplette Tyrode bei Bedarf einen klaren Blick auf die Vorhöfe und die Ventile zu ermöglichen. Weiter entlang der Nut zu schneiden die Vorhöfe von den Ventrikeln zu trennen.
8. Übertragen Sie das Vorhofgewebe in die zweite Silikon-Dissektion Schüssel und baden mit ~ 3 ml komplette Tyrode-heparinisiert gewärmt.
9. Richten Sie das Gewebe, so dass der rechte Vorhof des Tieres ist nun auf der linken Seite des Experimentators, und der linke Vorhof ist auf der rechten Seite.
   HINWEIS: Der rechte Vorhof mehr transparent ist, während der linke Vorhof mehr von einem dunkelroten Ton hat.
10. Pin das Gewebe durch die untere und obere Hohlvene und den rechten und linken Vorhof Anhängsel, Stretching die Vorbereitung sanft. Entfernen Sie alle verbleibenden Fett oder andere Gewebe eine klare Sicht auf die Vorbereitung zu ermöglichen (Vorsicht, nicht in die Vorhofwand geschnitten, wie der Sinusknoten recht empfindlich ist und leicht beschädigt werden kann).
11. Öffnen Sie die vordere Wand der Vorhöfe durch Schneiden durch die Hohlvenen. Re-Positionierung der Stifte als notwendig, um die Vorhofscheidewand zu visualisieren.
12. Schneiden Sie entlang der Vorhofscheidewand des linken Vorhofs zu entfernen. Re-Pin die Vorbereitung, Stretching sanft.
13. entfernen ter im rechten Vorhof Anhängsel und befreien den Sinusknoten durch entlang der Cristae terminalis Schneiden, die als dunkelorange Streifen erscheint das Herzohrs angrenzt.
14. Re-Pin über den Knotengewebe und schneiden Sie es seitlich (senkrecht zur Crista terminalis) drei gleich große Streifen zu erzeugen.

5. Sinoatrialknoten Verdauung

1. Mit dem schmalen feuerpolierte Pipette (Abbildung 1Aiv), übertragen Sie die drei Streifen von Sinoatrialknoten Gewebe in die erste von drei kleinen, Röhrchen mit rundem Boden 2,5 ml niedrigen Ca ²⁺ enthält / Mg ²⁺ Tyrode in der 35 ± 1 ° C Wasserbad. Inkubieren für 5 min.
2. Übertragen Gewebestreifen auf den zweiten kleinen Röhrchen mit rundem Boden 2,5 ml niedrigen Ca ²⁺ / Mg ²⁺ Tyrode in der 35 ± 1 ° C Wasserbad, unter Verwendung der gleichen schmalen Pipette enthält. Waschen Sie die Gewebestreifen durch sanftes das Rohr oder durch vorsichtiges Pipettieren mit dem schmalen Pipette wirbeln. Nicht Invert die Röhre.
3. Übertragen Gewebestreifen mit dem dritten kleinen Röhrchen mit rundem Boden 2,5 ml niedrigen Ca ²⁺ / Mg ²⁺ Tyrode, und wiederholen Sie den Waschschritt beschrieben in Schritt 5.2 enthält.
4. Übertragungsstreifen in den großen Rundboden Röhrchen mit 2,5 ml niedrigen Ca ²⁺ enthält / Mg ²⁺ Tyrode mit Enzymen (Elastase und Kollagenase-Protease - Mischung) in dem 35 ° C warmen Wasserbad. Stellen Sie sicher, dass alle drei Gewebestreifen vorhanden sind. Inkubieren für 10-15 min bei 35 ± 1 ° C. Mischen Sie alle 5 min durch das Rohr sanft wirbeln. Das Röhrchen nicht invertieren.

6. Sinoatrialknoten Muskelzellen Distanzierung

1. Im Anschluss an das Enzym die Verdauung, verwenden Sie die schmale feuerpolierte Pipette vorsichtig auf die Gewebestreifen an der ersten kleinen, Rundboden Röhrchen mit 2,5 ml KB-Lösung bei 35 ± 1 ° C übertragen. Waschen Sie Gewebe durch das Rohr sanft wirbeln.
   Hinweis: Gewebestreifen wird etwas durchscheinend erscheinen und bei th verklumpen kannPunkt. Griff sehr sanft nach der enzymatischen Verdauung zu verlieren Zellen zu vermeiden.
2. Übertragen, um das Gewebe zu der zweiten kleinen Rundbodenröhrchen mit 2,5 ml KB bei 35 ± 1 ° C. Swirl sanft zu waschen.
3. Übertragen, um das Gewebe zu dem dritten kleinen Rundbodenröhrchen mit 2,5 ml KB bei 35 ± 1 ° C. Swirl sanft zu waschen.
4. Übertragen, um das Gewebe zu dem großen Rundbodenröhrchen mit 2,5 ml KB bei 35 ± 1 ° C.
5. Mit dem größeren feuerpolierte Pipette (Abbildung 1Aiii und 1C), distanzieren die Zellen in der großen Rundbodenrohr durch konstante Verreiben bei ca. 0,5-1 Hz für 5-10 min, wobei darauf geachtet , die Dissoziation Röhre in die unter Wasser zu halten 35 ± 1 ° C Wasserbad und Blasen zu vermeiden, in die Lösung einführt.
   Hinweis: Das Verreiben Zeit variiert mit dem Durchmesser der Dissoziation Pipette und die Kraft der Pipettieren. Die Zeit sollte so eingestellt werden, dass die Gewebestücke bei t Rester Ende der Dissoziation erscheinen dünne, transparente und wispy. Wenn Gewebe jede Farbe behält, ist die Dissoziation wahrscheinlich unvollständig. Frequency (0,5-1 Hz) wird von Hand bestimmt.
6. Entfernen Rundbodenrohr dissoziiert SAMs aus dem Wasserbad enthält, und Äquilibrieren für 5 min bei Raumtemperatur.

7. Sinoatrialknoten Calcium Re-Anpassung (bei Raumtemperatur)

HINWEIS: Für SAMs für Kulturexperimente bestimmt, sollten die Verfahren im folgenden Abschnitt in einer sterilen Gewebekulturhaube durchgeführt werden. Wenn SAMs sind bei akuten Experimenten verwendet werden, besteht keine Notwendigkeit, diese Schritte in einer sterilen Umgebung durchzuführen.

1. Hinzufügen , 75 & mgr; l NaCl / CaCl ₂ Anpassungslösung (Tabelle 2). Vorsichtig schwenken zu mischen und 5 min inkubiert.
2. In 160 ul NaCl / CaCl ₂ Anpassung Lösung. Vorsichtig schwenken zu mischen und 5 min inkubiert.
3. In 390 ul BSA solution (Tabelle 2). Vorsichtig schwenken zu mischen und für 4 min inkubiert.
4. Hinzufügen 1,25 ml BSA-Lösung. Vorsichtig schwenken zu mischen und für 4 min inkubiert.
5. In 4,37 ml BSA-Lösung. Vorsichtig schwenken zu mischen und für 4 min inkubiert.
   Anmerkung: Die Endkonzentration an Calcium 1,8 mM sein wird.
6. Im Anschluss an Kalzium Neuanpassung, sammeln SAMs, indem sie durch die Schwerkraft zu regeln für ~ 10 min oder durch Zentrifugation bei ~ 2.000 × g für 3 min.
   1. Für akut isolierten Zellen, sanft zu entfernen und etwa 5 ml des Überstands unter Verwendung einer Glaspasteurpipette, so dass Zellen in einem Volumen von ~ 2 ml verwerfen. Bewahren Sie diese Zellen bei Raumtemperatur für bis zu ~ 8 h für Patch-Clamp-Aufnahmen.
   2. Für kultivierten Zellen, zu entfernen, so viel von dem Überstand wie möglich eine sterile Glaspasteurpipette. Resuspendieren Zellpellet in 1 ml vorgewärmtes (37 ° C) Plating Medium (Tabelle 2).

8. Auflage und Kultur von Sinuatriale Myozyten (überspringen für Akut isolierte Zellen)

1. Entfernen Laminin Lösung von Deckgläsern aus Schritt 3.3 mit einer Pasteurpipette. Sofort 500 & mgr; l von Saatgut (~ 50-100 Zellen) auf jedes Laminin beschichteten Deckglas (aus Schritt 3).
   HINWEIS: Die Kontraktions Inhibitor 2,3-butandion Monoxim (BAW) in der Plattierung und Kulturmedien enthalten Kontraktion zu verhindern, die ⁹ Abrieb von Zellen verursacht.
2. Bringen Sie die 24-Well - Platte neu ausgesät SAMs in den Inkubator enthält , und halten bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 95% Luft / 5% CO _2. Erlauben Zellen Deckgläser für 4-6 h in plating Medien (Tabelle 2) zu haften.
3. Entfernen Sie vorsichtig Plating Medium mit einer sterilen Pasteurpipette. Ersetzen mit 500 & mgr; l pro Vertiefung vorgewärmten (37 ° C) Kulturmedium (Tabelle 2).

9. adenovirale Transduktion von Adult Sinuatriale Muskelzellen-Kulturen (überspringen für Akut isolierte Zellen)

1. Schätzung Anzahl der cells pro Deckglas unmittelbar vor Adenovirus Anwendung, indem die Zellen in einem Sichtfeld unter einem Mikroskop gezählt, für eine Vergrößerung eingestellt wird. Zählen Sie alle Zellen, nicht nur SAMs.
2. Verdünnte Adenovirus in Medium 199 und der Verdünnung für die Virustiter einzustellen, so dass die Anwendung von 1-10 & mgr; l erforderlich, um eine endgültige Multiplizität der Infektion (MOI) von 100 Viruseinheiten pro Zelle zu erreichen. In adenoviralen Lösung in tropfenweise direkt auf plattiert SAMs.
3. Inkubiere Zellen mit dem Virus enthaltende Medium über Nacht (~ 12-14 h). Dann tauschen mit frischem Kulturmedium. Pflegen Zellen im Inkubator, wechselnde Kulturmedium alle 48 Stunden, bis die gewünschte Proteinexpression erhalten wird.

10. Funktionelle Bewertung von Akut Isolierte oder Cultured SAMs

HINWEIS: Das folgende Protokoll ist ein Beispiel für Funktionsprüfungen von isolierten SAMs mit dem Amphotericin perforiert-Patch-Technik sowohl spontane APs und ich aufzeichnen _{f von derselben Zelle (siehe Referenz ^9).}

1. Bereiten Aufzeichnungslösungen , wie in Tabelle 3 beschrieben.
2. Bereiten Sie eine Stammlösung von 20 mg / ml Amphotericin-B in DMSO frisch am Tag der Aufnahme. Halten Sie Lager bei Raumtemperatur und vor Licht schützen. Verdünnen Sie Amphotericin-B Lager in intrazellulären Lösung bis zu einer Endkonzentration von 200 ug / ml unmittelbar vor der Verwendung. Pflegen Sie die endgültige Pipettenlösung auf Eis und vor Licht schützen.
   HINWEIS: Die Amphotericin enthaltenden Pipettenlösung für Experimente von stündlich frisch zubereitet werden sollte, einen aliquoten Teil der Stammlösung in den intrazellulären Lösung und Verwirbelung für mindestens 1 min verdünnt.
3. Übertragen eines aliquoten Teils der distanzierte akut SAM Zellsuspension oder ein Fragment von Deckglas Lager kultivierten SAMs zu einer Aufzeichnungskammer Tyrode-Lösung bei 35 ± 1 ° C enthält. Perfundieren Zellen mit Tyrode-Lösung für mindestens 2 min vor der elektrophysiologischen recordings restliche BDM zu entfernen aus dem Kulturmedium zu bleiben.
   HINWEIS: Die spontane Kontraktionen unmittelbar nach Übertragung auf die Tyrode-Lösung offensichtlich sein sollte. SAMs zum Aufzeichnen kann durch eine Kombination von Merkmalen , einschließlich spontaner Kontraktionsaktivität, charakteristische Morphologie (z. B. Figur 2), das Fehlen von Riefen, die Expression von HCN4 Protein, das Vorhandensein von I _f Strom, Membrankapazität <50 pF, und die spontane APs identifiziert werden mit Wellenformen, die eine diastolische Depolarisation Phase und eine langsame upstroke umfassen.
4. Mit Borosilikat-Glaspipetten mit Widerständen von 1,5-3,0 MOhm, füllen Sie die Spitze mit intrazellulären Lösung von 10-30 sec Tauchen Amphotericin fehlt. Dann wieder füllen die Pipette mit der Amphotericin-haltigen Lösung. Eine GOhm Cell-Attached-Dichtung sollte so schnell wie möglich erreicht werden. Wenn Dichtung Bildung schwierig ist, erhöhen Sie die Spitze-fill Zeit.
   HINWEIS: Der Zugang Widerstand sollte kontinuierlich seinnach der Bildung der Zell befestigt Dichtung überwacht und Aufnahmen sollte nur nach Erhalt einer stabilen Zugangswiderstand von <10 M & OHgr; begonnen werden.
5. Um spontane APs aufnehmen, schalten Sie den Verstärker mit schnellen Current-Clamp-Modus ohne Stromeinspeisung.
   ANMERKUNG: 1 nM Isoproterenol ist in der extrazellulären Tyrode-Lösung enthalten , wenn APs Aufzeichnen der Befeuerungsrate zu stabilisieren, wie zuvor ¹⁰ gemeldet.

Ergebnisse

Die Protokolle hier beschrieben wurden bisher eingesetzt zu isolieren spontan aktiven SAMs aus erwachsenen Mäusen , die ^5-8 für eine Vielzahl von verschiedenen Patch - Clamp - Studien geeignet sind. Darüber hinaus ermöglichen die Protokolle für isolierte SAMs, die für bis zu einer Woche in Kultur gehalten werden können. Gentransfer in den kultivierten Zellen kann über adenovirale Infektion ⁹ erreicht werden. Die Ergebnisse in diesem Abschnitt leiten sich aus...

Diskussion

Dieser Beitrag stellt detaillierte Protokolle für die Isolierung und Kultur von vollständig differenzierten Sinoatrialknoten Myozyten aus erwachsenen Mäusen. Die Isolierung Protokoll erzeugt zuverlässig spontan aktive Maus SAMs geeignet für entweder sofort elektro Analyse oder Folgekultur. Ähnliche Protokolle wurden von vielen anderen Gruppen (siehe beispielsweise die Referenzen ^{11,12,10,13-17)} berichtet. Jedoch unser Protokoll für die in vitro erwachsenen Maus SAMs Aufrechterhaltung bewahrt d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgruard/Elastomer Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Borosilicate 9" pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20C
Small, round bottomed culture tubes	Fisher Scientific	352059
Large, round bottomed culture tubes	Corning	14-959-11B
Elastase	Worthington Biochemical	LS002279
Liberase TM	Roche	5401119001	Tissue dissociation solution
Heparin	SAGENT Pharmaceuticals	NDC 25021-400-10
Mouse Laminin	Corning	CB-354232
12 mm round glass coverslips	Fisher	12-545-80
24-well culture plate	Fisher	08-772-1
Ad-mCherry	Vector Biolabs	1767
Ad-eGFP	Vector Biolabs	1060
Plastic, disposable transfer pipette	Fisher Scientific
Micro scissors	Fisher Scientific	17-467-496
Dumont #4 Forceps	Roboz Instruments	RS-4904
Tissue Forceps	Roboz Instruments	RS-8164
Dissecting Iris Scissors	WPI, Inc.	501264
Dissecting Pins	Fine Science Tools	26002-20
NaCl	Sigma	71376
KCl	Sigma	60128
KH2PO4	Sigma	60353
HEPES	Sigma	54457
glucose	Sigma	G0350500
MgCl2	Sigma	M8266
CaCl2	Sigma	C1016
taurine	Sigma	T0625
BSA	Sigma	A2153
K-glutamate	Sigma	G1501
K-aspartate	Sigma	A6558
MgSO4	Sigma	M7506
creatine	Sigma	C0780
EGTA	Sigma	E3889
Mg-ATP	Sigma	A9187
Amphotericin-B	Fisher Scientific	1397-89-3
Isoproterenol	Calbiochem	420355
Media199	Sigma	M4530
2,3-butanedione monoxime (BDM)	Sigma	B0753
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	SH30071
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A5611
Insulin	Sigma	I3146
Transferrin	Sigma	I3146
Selenium	Sigma	I3146
Penicillin	GE Healthcare	SV30010
Streptomycin	Hyclone	SV30010