Методы изоляции, культуры и функциональная характеристика САУ миоцитов от взрослых мышей

Резюме

Методы продемонстрированы для выделения САУ миоцитов (Sams) от взрослых мышей для патч зажим электрофизиологии или визуализации исследований. Выделенные клетки могут быть использованы непосредственно или могут быть сохранены в культуре, чтобы обеспечить экспрессию белков, представляющих интерес, таких как генетически кодируемых репортеров.

Аннотация

САУ миоциты (Sams) действуют как естественные кардиостимуляторы сердца, инициируя каждым ударом сердца путем генерации спонтанных потенциалов действия (APS). Эти кардиостимуляторов точки доступа отражают согласованную деятельность многочисленных мембранных токов и внутриклеточного кальция езды на велосипеде. Однако точные механизмы, которые управляют спонтанное кардиостимулятора активности в SAMs остаются неуловимыми. Остро изолированные SAMs являются существенной подготовки для экспериментов рассекать молекулярной основы сердца pacemaking. Тем не менее, нечеткие анатомия, комплекс микродиссекции и привередливые ферментативные условия пищеварения предотвратили широкое применение остро изолированной ЗУР. Кроме того, методы не были доступны до недавнего времени, чтобы обеспечить долгосрочную культуру SAMs для экспрессии белка исследований. Здесь мы предлагаем протокол и демонстрации видео шаг за шагом для выделения SAMs от взрослых мышей. Способ также демонстрируется для поддержания взрослой мыши Sams в пробирке и для Expressiна экзогенных белков через аденовирусной инфекции. Остротоксичные выделяли и культивировали МССП, приготовленные с помощью этих методов пригодны для различных электрофизиологических и визуализации исследований.

Введение

Кардиостимулятор миоциты в САУ сердца (синусовый миоциты, "SAMs") порождают спонтанные, ритмические потенциалы действия (AP), которые распространяются через миокард инициировать каждый сердцебиение. Эксперименты с использованием остро изолированных Sams из многих видов были необходимы для выяснения механизмов, которые способствуют генерации пейсмекерной активности. SAMs являются узкоспециализированными кардиомиоциты, которые существенно отличаются от их аналогов в предсердий и желудочков миокарда с точки зрения морфологии, функции и экспрессии белка. Отличительной чертой спонтанных точек доступа в SAMs является спонтанной деполяризации во время диастолы , что приводит мембранный потенциал к порогу , чтобы вызвать следующую AP ^1,2. Этот "кардиостимулятор потенциал" зависит от скоординированной деятельности многих различных мембранных токов в том числе "забавной тока" (I _F), t- и L-типа токи кальция и обменник Curr натриево-кальциевоголор (I _NCX), который приводится в действие Ca ²⁺ освобождения из саркоплазматического ретикулума ^3,4.

В то время как остро изолированные мыши SAMs являются существенной экспериментальной подготовки для изучения pacemaking, выделение SAMs у мышей может быть сложным способом принять, потому что нечеткие анатомии и небольшой размер мыши SAN требует нюансированный микродиссекции и комбинированный ферментативных и механических диссоциации клеток требует тщательной оптимизации.

Мы предлагаем здесь подробное видео - демонстрацию протокола , который был успешно использован для выделения Sams от взрослых мышей для патч зажим записи ^5-8. Насколько нам известно, нет такой визуальной демонстрации доступны из любого другого источника. Кроме того, новый метод демонстрируется , в котором изолированный Sams от взрослых мышей может поддерживаться в пробирке в течение нескольких дней, позволяя тем самым введение белков, генетически кодируемыхрепортерные молекулы или RNAi через аденовирусной инфекции ^9.

протокол

Все процедуры на животных были проведены в соответствии с протоколами, утвержденными Institutional Animal Care и использование комитета Университета Колорадо Медицинский центр Anschutz мимо. Стандартный протокол ниже был оптимизирован с использованием самцов C57BL / 6J 2-3-месячного возраста.

1. Подготовка запасов и расходных материалов Solution в преддверии экспериментов

Примечание: Обратитесь к материалам таблице для необходимого оборудования и расходных материалов.

1. Готовят 1 л каждого из следующих растворов , как указано в таблице 1: Низкая, Ca ²⁺ / Mg ²⁺ Тирода, модифицированная сульфатная-Brühe (KB) Раствор, и бычьего сывороточного альбумина (БСА) Раствор Complete Тирода. Использование сверхчистых фильтруется деионизованной воды для всех растворов. Разделите каждое решение на аликвоты по 50 мл и хранят при температуре 20 ° С в течение до шести месяцев. Оттепель отдельные аликвоты непосредственно перед экспериментами, и хранить до одной недели на 46; С.
2. Приготовьте 50 мл 10 мМ NaCl и 1,8 мМ CaCl ₂ Адаптации раствора путем растворения NaCl и CaCl ₂ в сверхчистой фильтруется деионизированной воды (таблица 1). Хранить при комнатной температуре на срок до шести месяцев.
3. Подготовка 4,75 фермента единица активности (U) аликвот эластазы пипеткой в ​​микроцентрифужных пробирках. Хранить при температуре 4 ° С в течение до трех месяцев.
4. Приготовьте 375 мкг аликвот (сверхчистых H ₂ O) коллагеназы-фермента протеазы смесь с помощью пипетки в микроцентрифужных пробирках. Хранить при температуре -20 ° С в течение до трех месяцев.
5. Приготовьте два пожарных полировкой пипетки Пастера, один для переноса ткани (~ 1,5 мм Окончательный диаметр отверстия; Рисунок 1Aiv и рисунок 1С) и один для диссоциации (~ 2 мм в диаметре; рис и 1Aiii Рисунок 1C).
   1. Score пипетки Пастера с резаком стекла и сменной вдоль счет, чтобы произвести отверстие немного больше, чем требуемый размер. Огонь-Польское обрезанный конец каждого пипетку в течение ~ 30-60 сек на слабом огне на горелку, чтобы произвести толстую полированную стенку и отверстие нужного диаметра. Убедитесь, что открытие огня полированного свободен от каких-либо трещин или шероховатостей.
6. Подготовьте два рассечение блюда путем добавления ~ 25 мл силиконового эластомера смешивают в соответствии с инструкциями производителя к каждому 100 мм чашки Петри (рис 1ai и рис 1В). Дайте отвердеть при комнатной температуре в течение 48 ч.
7. Для культуры только: подготовить 25-50 мл каждый Покрытие среднего и культура Средние согласно Таблице 2 Хранение до двух недель при температуре 4 ° С..

2. Готовят растворы для использования на День карцер

Примечание: Следующие суммы предназначены для изоляции синоатриальной миоцитов от одной мыши.

1. Добавить 2,5 мл Низкий Ca ²⁺ / Mg ²⁺ Тирода (рН 6,9) к каждому из трех небольших, с круглым дном трубки культурыs. Место труб в ванне 35 ± 1 ° C воды.
2. Добавить 2,5 мл Low Ca ²⁺ / Mg ²⁺ Тирода в один большой с круглым дном культуры трубки. Для этой трубки, добавьте 1 аликвоты (4,75 U) эластазы и одну аликвоту (375 мкг) коллагеназы-протеазы фермента смесь. Вихревой перемешать. Место трубки в 35 ± 1 ° С водяной бане.
3. Добавить 2,5 мл KB средней до трех дополнительных небольших, с круглым дном пробирки культуры и один дополнительный большой, с круглым дном трубки культуры. Место труб в ванне 35 ± 1 ° C воды.
4. Добавить ~ 7 мл раствора БСА в одну большую Bottomed культуральную пробирку. Держите эту трубку при комнатной температуре.
5. Поместите 20-40 мл раствора Complete Тироде в 50 мл стакане (рис 1Aii). Добавьте 10 USP / мл гепарина, вихрем перемешать и поместить стакан в C водяной бане в 35 ° ± 1.

3. Подготовить дополнительные решения и материалы для культивируемых клеток (пропустить эти шаги для Остротоксичные изолированных клеток)

1. В стерильной культуре ткани капот, поместите два 12 мм круглые покровные стекла на мышь в отдельные лунки 24-луночного планшета.
   Примечание: Пластина 24 также используется, поскольку колодцы представляют собой удобный размер, который служит для ограничения объема для последующих вирусных инфекций.
2. Пипетка приблизительно 200 мкл 100 нг / мл раствора ламинин мыши, разведенного в стерильный физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS), на каждом покровном.
3. Инкубируйте покровные с ламинин на время изоляции (по крайней мере 1 ч) в термостате при 37 ° С.
4. Предварительно теплый гальванического покрытия среднего и культуральную среду (с шага 1.7 и таблице 3) до 37 ° С.

4. САУ Изоляция

1. В химическом вытяжном шкафу, поместите курсор в одной камере коробки двухкамерной и обезболить с ~ 200 мкл жидкого изофлуран, введенного с помощью ватного тампона в другую камеру. Подтверждение анестезии (обычно в пределах ~ 30-60 сек) с носком крайнем случае. Эвтаназиимышь шейным смещением.
   Примечание: пустой 1 мл пипетки коробка может быть использована для формирования коробки двухкамерным; повернуть стойку вниз головой в коробке, чтобы создать отдельный отсек для изофлуран, чтобы предотвратить мышь от контакта его непосредственно.
2. Удалить мех из груди с ножницами и разрезам грудной клетки , чтобы разоблачить грудной полости с помощью щипцов внешние ткани (рис 1Aviii) и рассечение ножницами (рис 1Avix). Купайтесь грудной полости с ~ 2 мл нагретый Complete Тирода с гепарин с использованием пипетки передачи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте купания грудной полости, когда это необходимо, не позволяют препарат высохнуть.
3. Под микроскопом рассекает, тщательно удалить легкие и тимуса с использованием внутренних ножниц (рис 1Avi) и рассечение пинцет (рис 1Avii).
4. В то время как нежно держа верхушку сердца с внутренними щипцов рассечение, тщательно вырезать нижнюю полую вену и Aорта с внутренними ножницами, чтобы удалить сердце из полости грудной клетки. Перенести сердце одному из рассечение блюд силиконовых и омыться ~ 4 мл утепленные гепарин Полная Тирода с помощью пипетки передачи.
5. Orient сердце таким образом, что задние сосуды видны и лицевой стороной вверх, с правом предсердии животного на правом экспериментатора и левого предсердия на левом экспериментатора. После того, как ориентированные, иммобилизации сердце закрепив через вершину в силиконовую рассечение блюдо.
6. Расположить паз между желудочками и предсердиями (прозрачный кольца над желудочками).
7. Используя внутренние ножницы рассечение, сделать надрез в канавке, держа ближе к желудочков, чем предсердия. Промыть канавку и надрез с дополнительным нагретый гепарин Полная Тирода по мере необходимости, чтобы обеспечить четкое представление о предсердия и клапанов. Продолжайте разрезать вдоль канавки, чтобы отделить предсердия от желудочков.
8. Передача предсердной ткани ко второму силиконовое рассечение блюдо и омыться ~ 3 мл утепленные гепарин Полная Тирода.
9. Orient ткань так, что правое предсердие животного находится теперь на левом экспериментатора, а левое предсердие справа.
   Примечание: правое предсердие является более прозрачным, в то время как левое предсердие имеет больше темно-красного тона.
10. Закрепление ткани через нижнюю и верхнюю полую cavae и правого и левого предсердия придатков, растягивая препарат осторожно. Удалите все оставшиеся жир или другие ткани, чтобы обеспечить четкое представление о подготовке (будьте осторожны, чтобы не врезаться в стенку предсердия, как синусовый узел является весьма сложным и может быть легко повреждена).
11. Откройте переднюю стенку предсердия путем перерезания полых вен. Повторно установите штифты по мере необходимости визуализировать межпредсердной перегородки.
12. Разрежьте вдоль межпредсердной перегородки, чтобы удалить левое предсердие. Re-контактный препарат, растяжка мягко.
13. Удалить тон в правом предсердии придаток и освободить САУ путем разрезания вдоль крист, которая терминальной появляется в виде темно-оранжевой полосой, граничащей с ушка предсердия.
14. Повторно придавить узловую ткань и вырежьте его в поперечном направлении (перпендикулярно кристе терминальной) производить три одинаковых по размеру полос.

5. САУ Переваривание

1. Использование узкой огневой полировкой пипетка (рис 1Aiv), передают три полоски ткани синусового узла в первый из трех небольших, с круглым дном пробирку , содержащую 2,5 мл низкой Са ²⁺ / Mg ²⁺ Тироде в 35 ± 1 ° водяная баня C. Инкубировать в течение 5 мин.
2. Передача тканевых полосок на второй маленький, с круглым дном пробирку , содержащую 2,5 мл низкой Са ²⁺ / Mg ²⁺ Тироде в C водяной бане в 35 ° ± 1, используя ту же узкую пипетку. Вымойте полоски ткани, осторожно вращая трубку или осторожно пипеткой с узким пипеткой. Не Инверт трубку.
3. Передача ткани полосы к третьей маленькой, с круглым дном пробирку , содержащую 2,5 мл низкой Са ²⁺ / Mg ²⁺ Тирода, и повторите стадии промывки , описанную в пункте 5.2.
4. Передача полосы в большом круглым дном пробирку , содержащую 2,5 мл низкой Са ²⁺ / Mg ²⁺ Тироде с ферментами (эластаза плюс коллагеназы-протеазы , смесь) в водяной бане от 35 & deg ; C. Убедитесь в том, что все три полоски ткани присутствуют. Выдержите в течение 10-15 мин при температуре 35 ± 1 ° С. Смешайте каждые 5 минут, осторожно взбалтывая трубку. Не инвертировать трубку.

6. САУ миоцитов диссоциация

1. После ферментативного расщепления, использовать узкий огневой полировкой пипетки, чтобы аккуратно перенести полоски ткани на первой маленькой, с круглым дном пробирку, содержащую 2,5 мл раствора КБ при 35 ± 1 ° С. Вымойте ткань, осторожно вращая трубку.
   Примечание: Тканевые полоски будут выглядеть несколько полупрозрачным и могут слипаться в гоявляется точка. Ручка очень осторожно после ферментативного расщепления, чтобы избежать потери клеток.
2. Передача ткани ко второму небольшим круглым дном пробирку, содержащую 2,5 мл кБ при 35 ± 1 ° С. Вихревой аккуратно мыть.
3. Передача ткани к третьему небольшим круглым дном пробирку, содержащую 2,5 мл кБ при 35 ± 1 ° С. Вихревой аккуратно мыть.
4. Передача ткани в большой, с круглым дном пробирку, содержащую 2,5 мл кБ при 35 ± 1 ° С.
5. Используя больший огневой полировкой пипетка (рис 1Aiii и рис 1C), диссоциируют клетки в большом круглым дном трубы с постоянным растиранием приблизительно 0,5-1 Гц в течение 5-10 мин, следя за тем, чтобы держать диссоциации трубки , погруженной в 35 ± 1 ° с и водяную баню, чтобы избежать введения пузырьков в раствор.
   Примечание: растирание время изменяется в зависимости от диаметра диссоциации пипеткой и силы пипеткой. Время должно быть отрегулировано таким образом, чтобы кусочки ткани оставаясь при Тон конец диссоциации появляются тонкие, прозрачные и тонкие. Если ткань сохраняет любой цвет, диссоциация, вероятно, будет неполным. Частота (0,5-1 Гц) определяется вручную.
6. Удалить с круглым дном трубки, содержащей диссоциирует Sams из водяной бани и уравновешивают при комнатной температуре в течение 5 мин.

7. САУ кальция реадаптации (Выполняется при комнатной температуре)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для ЗУР, предназначенных для экспериментов культуры, процедуры, описанные в следующем разделе должны быть выполнены в стерильной капот культуры ткани. Если МССП должны использоваться для острых опытах, нет необходимости выполнять действия в стерильной среде.

1. Добавить 75 мкл NaCl / CaCl ₂ раствора адаптации (таблица 2). Вихревой аккуратно перемешать и инкубировать в течение 5 мин.
2. Добавьте 160 мкл NaCl / CaCl раствора ₂ адаптации. Вихревой аккуратно перемешать и инкубировать в течение 5 мин.
3. Добавить 390 мкл BSA зольсоциологическое загрязнение (таблица 2). Вихревой аккуратно перемешать и инкубировать в течение 4 мин.
4. Добавить 1,25 мл раствора БСА. Вихревой аккуратно перемешать и инкубировать в течение 4 мин.
5. Добавить 4,37 мл раствора БСА. Вихревой аккуратно перемешать и инкубировать в течение 4 мин.
   Примечание: Конечная концентрация кальция будет 1,8 мМ.
6. После кальция реадаптации, собирать Sams, позволяя осесть под действием силы тяжести в течение ~ 10 мин или центрифугированием при ~ 2000 мкг в течение 3 мин.
   1. Для остро выделенные клетки, осторожно удалить и выбросить примерно 5 мл надосадочной жидкости с помощью стеклянной пипетки Пастера, в результате чего клетки в объеме ~ 2 мл. Храните эти клетки при комнатной температуре в течение до ~ 8 часов для патч зажим записи.
   2. Для культивируемых клеток, удалить как можно больше супернатанта, как это возможно с помощью стерильной стеклянной пипетки Пастера. Осадок Ресуспендируют клеток в 1 мл подогретого (37 ° С) Покрытие Средний (Таблица 2).

8. Покрытие и культура синоатриальном Миоcytes (Пропустить для Остротоксичные изолированных клеток)

1. Удалить ламинин решение от покровных из шага 3.3 с помощью пипетки Пастера. Сразу семян 500 мкл (~ 50-100 клеток) на каждом покровном ламининовым покрытием (со стадии 3).
   Примечание: Ингибитор сократительной 2,3-бутандион моноксима (БДМ) входит в осажденных и питательные среды , чтобы предотвратить сжатие, что приводит к убыли клеток ^9.
2. Возвращение 24-луночный планшет , содержащий вновь высевают Sams в инкубатор и выдерживают при 37 ° С в атмосфере 95% воздуха / 5% CO _2. Разрешить клетки придерживаться покровные в течение 4-6 ч в осажденном средах (таблица 2).
3. Осторожно удалите Покрытие среды с использованием стерильной пипетки Пастера. Заменить на 500 мкл на лунку предварительно нагретом (37 ° С) , культуральная среда (таблица 2).

9. аденовируса трансдукция взрослых Синусовый миоцитов культур (Пропустить для Остротоксичные изолированных клеток)

1. Расчетный показатель числа керамзитобLLS на покровное непосредственно перед нанесением аденовируса путем подсчета клеток в поле зрения под микроскопом, регулируя для увеличения. Подсчет всех клеток, а не только Sams.
2. Развести аденовирус в среде 199 и регулировать разбавление для титра вируса, так что применение 1-10 мкл требуется для достижения конечной кратности инфекции (MOI) 100 вирусных единиц на клетку. Добавить аденовирусной раствор по каплям моды непосредственно на гальванопокрытием ЗУР.
3. Инкубируйте клетки с вирусом среде, содержащей в течение ночи (~ 12-14 ч). Затем обмен свежей культуральной средой. Поддерживать клетки в инкубаторе, изменение культуральной среды каждые 48 ч, до тех пор, пока не будет получено желаемое экспрессии белка.

10. Функциональная оценка высокотоксичных изолированной или культивированный SAMs

Примечание: Следующий протокол является примером функциональных оценок изолированной ЗУР с использованием амфотерицина техники просечно-патч для записи как спонтанные точки доступа и I _{F из той же ячейки (см ссылку ^9).}

1. Подготовка записи решения , как описано в таблице 3.
2. Подготовка исходного раствора 20 мг / мл амфотерицина-В в ДМСО свежий в день записи. Хранить запас при комнатной температуре и защищать от света. Развести амфотерицина-В запас внутриклеточной растворе до конечной концентрации 200 мкг / мл непосредственно перед использованием. Поддерживать окончательное решение пипетки на льду и защищенном от света месте.
   Примечание: амфотерицин раствор, содержащий пипетка для экспериментов следует приготовить свежую ежечасно путем разбавления аликвоту исходного раствора во внутриклеточное раствора и встряхиванием в течение не менее 1 мин.
3. Перелить Аликвоту остро диссоциированы клеточной суспензии SAM или фрагмент покровного стекла, несущего культивируемой Sams к записи камеру, содержащую раствор Тироде при 35 ± 1 ° С. Заливать клеток с раствором Тироде в течение по крайней мере 2 мин до электрофизиологического recordinГ.С., чтобы удалить остатки BDM оставшейся от культуральной среды.
   Примечание: спонтанных сокращений должно быть очевидно, сразу же после передачи в растворе в Тирода. SAMs для записи могут быть идентифицированы с помощью комбинации функций , включая спонтанную сократительную активность, характерную морфологию (например, рис . 2), отсутствие страт, экспрессия белка HCN4, наличие I _F тока, мембранная емкость <50 пФ, и спонтанные ApS с формами волны, которые включают в диастолическую фазу деполяризации и медленный ход вверх.
4. Использование боросиликатного стекла пипетки с сопротивлениями 1,5-3,0 МОм, заполнить наконечник с внутриклеточным раствором амфотерицина ИМЕЮЩИМ путем погружения в течение 10-30 сек. Затем обратно заполнить пипетку с амфотерицином раствором, содержащим. Клеточноподобное прилагается уплотнение ГОм должно быть получено как можно быстрее. Если формирование уплотнения трудно, увеличьте время кончик заполнения.
   Примечание: Сопротивление доступа должно быть непрерывномониторинг после образования клеточного прилагается уплотнение, и все записи должны быть начаты только после получения стабильного сопротивления доступа <10 МОм.
5. Для записи спонтанные точек доступа, переключить усилитель в ускоренном режиме ток-зажим, без инжекции тока.
   Примечание: 1 нМ изопротеренол входит в растворе Внеклеточный Тироде при записи точек доступа для стабилизации скорости стрельбы, как сообщалось ранее ^10.

Результаты

Протоколы , описанные здесь , были ранее использованы для выделения спонтанно активных МССП от взрослых мышей, которые подходят для множества различных накладными исследований зажим ^5-8. Кроме того, протоколы позволяют изолированных SAMs, которые можно поддержива?...

Обсуждение

В настоящем документе представлены подробные протоколы для изоляции и культуры полностью дифференцированных САУ миоцитов от взрослых мышей. Протокол изоляции надежно производит спонтанно активные Sams мыши, подходящие для любого немедленного электрофизиологического анализа или пос?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgruard/Elastomer Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Borosilicate 9" pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20C
Small, round bottomed culture tubes	Fisher Scientific	352059
Large, round bottomed culture tubes	Corning	14-959-11B
Elastase	Worthington Biochemical	LS002279
Liberase TM	Roche	5401119001	Tissue dissociation solution
Heparin	SAGENT Pharmaceuticals	NDC 25021-400-10
Mouse Laminin	Corning	CB-354232
12 mm round glass coverslips	Fisher	12-545-80
24-well culture plate	Fisher	08-772-1
Ad-mCherry	Vector Biolabs	1767
Ad-eGFP	Vector Biolabs	1060
Plastic, disposable transfer pipette	Fisher Scientific
Micro scissors	Fisher Scientific	17-467-496
Dumont #4 Forceps	Roboz Instruments	RS-4904
Tissue Forceps	Roboz Instruments	RS-8164
Dissecting Iris Scissors	WPI, Inc.	501264
Dissecting Pins	Fine Science Tools	26002-20
NaCl	Sigma	71376
KCl	Sigma	60128
KH2PO4	Sigma	60353
HEPES	Sigma	54457
glucose	Sigma	G0350500
MgCl2	Sigma	M8266
CaCl2	Sigma	C1016
taurine	Sigma	T0625
BSA	Sigma	A2153
K-glutamate	Sigma	G1501
K-aspartate	Sigma	A6558
MgSO4	Sigma	M7506
creatine	Sigma	C0780
EGTA	Sigma	E3889
Mg-ATP	Sigma	A9187
Amphotericin-B	Fisher Scientific	1397-89-3
Isoproterenol	Calbiochem	420355
Media199	Sigma	M4530
2,3-butanedione monoxime (BDM)	Sigma	B0753
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	SH30071
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A5611
Insulin	Sigma	I3146
Transferrin	Sigma	I3146
Selenium	Sigma	I3146
Penicillin	GE Healthcare	SV30010
Streptomycin	Hyclone	SV30010