El uso de ácidos biliares y Multi-fluorados<em&gt; En Vivo</em&gt; Imagen de Resonancia Magnética para medir el transporte de ácidos biliares

Resumen

Herramientas para el diagnóstico de la malabsorción de ácidos biliares y miden transporte de ácidos biliares in vivo están limitados. Un enfoque innovador de animales vivos se describe que utiliza protones combinado ⁽¹ H), además de flúor ^(19F) de formación de imágenes por resonancia magnética; esta novedosa metodología tiene el potencial de traslación para la detección de problemas de absorción de ácidos biliares en la práctica clínica.

Resumen

Junto con su papel tradicional de detergentes que facilitan la absorción de grasa, literatura emergente indica que los ácidos biliares son potentes moléculas de señalización que afectan a múltiples órganos; modulan la motilidad intestinal y la producción de hormonas, y alterar el tono vascular, metabolismo de la glucosa, el metabolismo de lípidos, y la utilización de energía. Los cambios en los ácidos biliares fecales pueden alterar el microbioma intestinal y promover la patología de colon incluyendo diarrea cholerrheic y el cáncer de colon. reguladores clave de la composición de ácido biliar fecal son la pequeña intestinal Apical Bile Acid Transporter dependiente de sodio (ASBT) y factor de crecimiento de fibroblastos-19 (FGF19). La reducción de expresión y función de ASBT disminuye los ácidos biliares del intestino efectos de adopción. Por otra parte, los datos in vitro sugieren que algunos medicamentos aprobados por la FDA inhiben la función ASBT. liberación de FGF19 deficiente aumenta la síntesis de ácido biliar hepática y la liberación en el intestino a niveles que superan ASBT. De cualquier disfunción o deficiencia ASBT FGF19 aumenta fácidos biliares ECAL y pueden causar diarrea crónica y promover la neoplasia de colon. Lamentablemente, herramientas para medir la bilis malabsorción de ácidos y las acciones de los fármacos sobre el transporte de ácidos biliares in vivo son limitadas. Para entender las complejas acciones de los ácidos biliares, se requieren técnicas que permiten la monitorización simultánea de los ácidos biliares en el intestino y los tejidos metabólicos. Esto nos llevó a concebir un método innovador para medir el transporte de ácido biliar en animales vivos usando una combinación de protones ⁽¹ H) y flúor (F ¹⁹⁾ de formación de imágenes por resonancia magnética (MRI). Trazadores novedosos para flúor ^(19F) a base de resonancia magnética en vivo de los animales fueron creados y probados, tanto in vitro como in vivo. Ventajas de este enfoque incluyen la falta de exposición a la radiación ionizante y el potencial de traslación para la investigación y la práctica clínica.

Introducción

Junto con su función clásica como detergentes que facilitan la absorción de grasa desde el intestino, los ácidos biliares se han convertido en moléculas de señalización potentes que afectan a múltiples órganos, además de los asociados con su ^1,2 circulación enterohepática. Además de controlar su propio metabolismo, los ácidos biliares modulan varios aspectos de la fisiología gastrointestinal (por ejemplo, la motilidad intestinal y la producción de la hormona incretina, fisiología colon, y la susceptibilidad al cáncer) y tienen efectos sistémicos sobre el tono vascular, la glucosa y el metabolismo de los lípidos, y la utilización de energía. Mientras que algunos de estos efectos están mediados en el intestino, otros se deben a cambios en los niveles postprandiales de ácidos biliares sistémicos, como se señaló en los pacientes obesos o después de la cirugía gástrica de derivación. Para dilucidar las acciones metabólicas complejas de los ácidos biliares se requiere nueva tecnología que permite la monitorización simultánea de los niveles de ácidos biliares en diferentes compartimentos anatómicos, en el tracto gastrointestinal y metatejidos metabólicos (hígado, páncreas, músculo esquelético y tejido adiposo). La obtención de dicha información temporal y espacial requiere de una tecnología innovadora - imágenes in vivo utilizando nuevos trazadores de ácidos biliares como se describe aquí es un enfoque novedoso.

composición de ácidos biliares y la distribución en los compartimentos anatómicos están regulados por factores que modulan su síntesis hepática y la absorción ileal, incluyendo la dieta, la cirugía, el uso de antibióticos y los cambios en la flora intestinal. Un regulador clave de la absorción de ácidos biliares intestinal para su circulación enterohepática ³ (Figura 1) es el ileal apical dependiente de sodio del ácido biliar Transporter (ASBT; SLC10A2). Aunque la absorción pasiva se produce a través de los intestinos, ASBT media la absorción de 95% de ácidos biliares intestinales de modo que normalmente existe derrame limitado de ácidos biliares en las heces. ASBT deficientes (Slc10a2 ^{- / -)} ratones han aumentado los ácidos biliares fecales y una disminución de la aci bilisd Piscina ^4.

Figura 1: la circulación enterohepática de los ácidos biliares.
Ilustración de circulación enterohepática mediante el cual los ácidos biliares se sintetizan en el hígado, se excreta en el árbol biliar, almacena en la vesícula, libera en el intestino delgado proximal con las comidas, y activamente absorbido a través de ASBT en el íleon distal. Mientras que las pequeñas cantidades de ácidos biliares se absorben de forma pasiva a lo largo del intestino, aproximadamente el 95% de los ácidos biliares intestinales son transportados activamente por ASBT lo que resulta en una pérdida mínima (aproximadamente 5%) en las heces que es compensada por una cantidad similar de síntesis de ácidos biliares nuevo en el hígado, manteniendo de este modo un conjunto de ácidos biliares en el estado estacionario. Las flechas a la derecha identificar los factores que pueden afectar la estabilidad de ácidos biliares nativo y marcado con flúor, incluyendo el ácido gástrico, de páncreas y de las enzimas de la mucosa intestinal, y, lo más importantlY, enzimas hidrolíticas liberadas por las especies clostridiales que colonizan el intestino delgado y el colon distal. (Modificado con permiso ¹⁶⁾ Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

malabsorción de ácidos biliares se pueden clasificar en tres tipos, cada uno de lo que aumenta los ácidos biliares fecales dihidroxi, lo que provoca diarrea intermitente o crónica. Tipo 1 que resulta de la patología del íleon bruto (por ejemplo, la resección, la enfermedad de Crohn) ^5. Tipo 3 resultados de la colecistectomía, vagotomía, la enfermedad celíaca, el sobrecrecimiento bacteriano, y la insuficiencia pancreática. Por el contrario, las personas con (tipo 2) malabsorción de ácidos biliares "primaria" plantear un reto diagnóstico formidable, ya que carecen de tales condiciones antecedentes y no tienen evidencia de patología en el íleon. Por lo tanto, problemas de absorción de ácido biliar primario se diagnostica erróneamente comúnmente como diarrea-pEl síndrome del intestino irritable predominante hacía (SII-D), tal vez la razón más común para las visitas relacionadas gastroenterología-ambulatorios. Se ha estimado que un tercio de los pacientes con SII-D tienen problemas de absorción de ácido biliar primaria; en los EE.UU., esto puede representar varios millones de personas ^5. ideas recientes indican que BAM primaria se deriva de la inhibición por retroalimentación alteración de la síntesis de ácidos biliares hepáticos por intestinal factor de crecimiento fibroblástico 19 (FGF19), no de la expresión o función de ASBT reducida.

En malabsorción de ácidos biliares primarios, los bajos niveles plasmáticos de FGF19 no se interrumpe la síntesis de ácido biliar hepática - el aumento resultante de los ácidos biliares intestinales satura los transportadores de ácidos biliares, incluyendo ASBT, y el vertido aumentada de ácidos biliares en las heces causa diarrea ⁶ (Figura 2). Los ratones deficientes en FGF15 (FGF19 murino) tienen un conjunto de ácidos biliares ampliado y el aumento de los ácidos biliares fecales ^7.

Figura 2: Mecanismos de malabsorción intestinal de ácidos biliares.
Normalmente, como se muestra en el panel A, aproximadamente el 95% de los ácidos biliares intestinales son absorbidos por el transporte activo en el íleon distal a través de ASBT. Cuando la expresión o actividad ASBT se ve disminuida (panel B), alteraciones intestinales resultados de absorción de ácidos biliares en el derrame de ácidos biliares en el colon. Con una alteración de la señalización FGF19 (grupo C), la falta de inhibición por retroalimentación de la bilis hepática resultados de la síntesis de ácido en el aumento de las concentraciones de ácidos biliares intestinales que agotan la capacidad de transporte ASBT con derrame de ácidos biliares en el colon. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

A largo plazo, la elevación crónica en aci biliares fecalesds puede promover la neoplasia de colon. neoplasia de colon surge de la displasia de la mucosa progresiva asociada a mutaciones genéticas somáticas, pero los factores ambientales que aumentan los ácidos biliares fecales pueden acelera y aumenta este proceso. En los roedores, el aumento de los ácidos biliares fecales ya sea como consecuencia de la administración exógena o deficiencia ASBT promover la displasia de colon y la formación de tumores ^8-10.

En particular, los resultados indican que la provocación medicamentos de uso común aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) inhiben potencialmente transporte de ácidos biliares por ASBT in vitro ^11. Si estos medicamentos reducen el transporte de ácidos biliares del intestino delgado en vivo y aumentan los niveles de ácidos biliares fecales, el impacto potencial sobre la patología de colon sería preocupante. Incluso un pequeño aumento en la patología de colon atribuye al uso de un medicamento de este tipo podría tener un importante impacto en la salud. Un conjunto de herramientas que pueden evaluar la plausibilidad de estos resultados in vitro y ob epidemiológicavaciones podrían estimular la investigación adicional, incluyendo los estudios de seguridad posteriores a la comercialización.

A pesar de la necesidad, los ensayos prácticos para identificar a las personas con mala absorción de ácidos biliares son insuficientes. La medición directa de los ácidos biliares fecales fue rechazada hace años como engorroso, poco práctico y poco fiable ^5. Los enfoques alternativos incluyen la medición de la retención de un derivado radioactivo selenio marcado con ácido cólico ⁽⁷⁵ SeHCAT) y los niveles plasmáticos de 7α-hidroxi-4-colesten-3-ona (C4), o un ensayo terapéutico de aglutinante de ácidos biliares. ⁷⁵ pruebas SeHCAT tiene disponibilidad limitada en Europa y no está aprobado por la FDA o estén disponibles para su uso en los EE.UU. Además, incluso modesta exposición a la radiación (0,26 mSv / ⁷⁵ prueba SeHCAT) a partir de diagnóstico presentan preocupaciones, y el sobrecrecimiento bacteriano y la enfermedad hepática avanzada pueden confundir ⁷⁵ resultados SeHCAT. pruebas C4 es potencialmente atractiva ya que sólo se requiere plasma, pero tiene baja val predictivo positivoue y la prueba no está ampliamente disponible. La medición de los niveles séricos de FGF19 tiene limitaciones similares. Con frecuencia los médicos recurren a un ensayo terapéutico de secuestradores de ácidos biliares, pero este método no puede proporcionar un diagnóstico definitivo de la malabsorción de ácidos biliares ^5.

Por estas razones, un enfoque novedoso MRI fue concebido para medir el transporte de ácido biliar y la distribución in vivo usando ácidos biliares multi-fluorados innovadores (MFBA-RM). MFBA que contiene tres átomos de flúor ⁽¹⁹ F), un isótopo estable del 100% de abundancia natural, son transportados de manera similar a los ácidos biliares nativas ^12, y se puede utilizar para visualizar el transporte de ácidos biliares con una combinación de protones ⁽¹ H) y flúor ( ¹⁹ M) MRI, un método sensible, seguro y sin exposición a la radiación ionizante ^13,14.

Protocolo

El siguiente protocolo se adhiere a las directrices aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Universidad de Maryland Escuela de Medicina (IACUC Protocolo # 0415011, aprobada el 18 de junio de, 2015).

1. Los ratones con el gavage Etiquetada ^{F-19 de} los ácidos biliares

1. Los ratones de alimentación por sonda con 150 mg / kg de peso corporal ¹⁹ ácidos biliares marcados-F. Llene una jeringa de 1 ml para el volumen necesario con ¹⁹ marcado con F solución de ácido biliar de la [cólico ácido-trifluoro-acetil lisina (CA-lys-TFA; en 1: 1 de polietilenglicol 400: fosfato de Dulbecco de solución salina tamponada) o cholylsarcosine- trifluoro-N-metil-acetamida (CA-sar-TFMA; en 60% de polietilenglicol 400 y 40% tampón fosfato salino de Dulbecco] y adjuntar una de calibre 20 de 1,5 pulgadas aguja de sonda gástrica bulbo con punta curvada Asegúrese de que la aguja de sonda. es el tiempo suficiente para alcanzar el nivel de cartílago xifoides del ratón cuando se inserta en el esófago hasta el cubo de la aguja
2. firmemente graspar el animal por la piel suelta en la parte posterior del cuello entre los dedos pulgar e índice y el uso de los dedos restantes de captar la piel en la parte baja de la espalda y la cola.
3. Mantenga pulsado el ratón en posición vertical y pasar la aguja de sonda a lo largo del lateral y el techo de la boca hacia el esófago y hasta el estómago. Si la resistencia se encuentra en la faringe, cambiar la posición de la aguja hasta 'traga' el animal que - no empujar contra la resistencia.
4. Si se requiere anestesia para la alimentación forzada, colocar el ratón en una campana de vidrio que contenía 5 ml de isoflurano y cerrar. Cuando el ratón se cae sobre su lado, esperar 7 seg, eliminar el ratón y realizar sonda. Para proteger al personal de los vapores anestésicos, utilice la campana de vidrio sólo en una campana de humos.
5. Observe que el animal se recupere de isoflurano en unos pocos minutos.
   NOTA: Dado que el isoflurano se metaboliza en el hígado, una señal de flúor que emana de la droga intacta o sus metabolitos se excreta en el sistema biliar y la vesícula biliar puede confundir fluoRine señales procedentes de ¹⁹ ácidos biliares marcados ^F-15. Una alternativa es el uso de ketamina más xilacina (ver sección 3.1 para las dosis).

2. La recolección de la vesícula biliar, el hígado y la sangre para las mediciones de ácidos biliares Uso de cromatografía líquida / espectrometría de masas

1. Para conseguir un llenado de la vesícula biliar máxima, los ratones en ayunas durante al menos 6 horas antes de recoger los órganos. Preparar ketamina y xilacina en solución salina tamponada con fosfato (100 l ketamina, xilazina 62,5 l, 840 l de PBS).
2. Usando una jeringa estéril de 1 ml, inyectar una hr por vía subcutánea ratón 1 antes de la cosecha de órganos con 15 l / g de peso corporal de una solución de ketamina / xilazina (150 mg de ketamina y 18 mg de xilazina por kg de peso corporal).
3. Una hora después de la administración de ketamina / xilazina confirmar anestesia adecuada por pizca dedo del pie y coloque el ratón anestesiado supino.
4. Usar 5 o 6 pulgadas tijeras para hacer una incisión en la piel abdominal en la línea media desde el pubis hasta el xifoides y fitijeras ne (4 pulgadas) para cortar el revestimiento peritoneal y exponer los órganos abdominales - no para perforar el diafragma.
5. Agarre el proceso xifoides con una abrazadera de 5 pulgadas y levantar de nuevo a través del pecho para exponer la cavidad abdominal superior. El uso de fórceps y un instrumento romo para diseccionar y mover el hígado a un lado, dejando al descubierto la vesícula biliar.
   NOTA: No lacerar el hígado o la vesícula biliar tocar ya que el primero va a causar una hemorragia severa y este último puede estimular la contracción de la vesícula biliar y el vaciado.
6. Coloque una abrazadera de 4 pulgadas a través del conducto biliar común (Figura 3, las flechas de trazos). Cortar el ligamento unir el polo superior de la vesícula biliar hasta el diafragma y mover suavemente la vesícula biliar hacia el lado derecho del abdomen.

Figura 3: anatómicos y de protones por resonancia magnética Vistas del ratón de la vesícula biliar.
El panel izquierdo muestra los ME expuestae vesícula biliar a la izquierda de la línea media después de la incisión abdominal. La pinza agarra el proceso xifoides. La vesícula biliar ayuno bilis llena se indica mediante la flecha grande y el conducto biliar común sujeta por las flechas de trazos. [Recuadro: extirpado la vesícula biliar intacta con el conducto biliar común fijada. La regla está marcada en milímetros (mm).] El panel derecho muestra una imagen de resonancia magnética ponderada en densidad de protones de alta resolución de la vesícula biliar murino en ayunas (flecha). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

7. Antes de la escisión de la vesícula biliar realizar punción cardíaca, la sangre de la cosecha, y Exsanguinate el animal para verificar la eutanasia.
   NOTA: La cosecha de la vesícula biliar primera puede lacerar el hígado provocando un colapso cardiovascular y el fracaso para obtener una muestra de sangre adecuada (≥ 200 l).
8. Exponer la parte inferior del diafragma izquierda yidentificar la superficie latido del corazón. En el punto de la pulsación cardiaca máxima perforar el diafragma y el corazón con una aguja de calibre 23 unida a una jeringa de 1 ml.
   1. Lentamente retire la jeringa mientras se aspira. Cuando la sangre comienza a llenar la jeringa, retirar detener y mantener la succión para recoger 0,2-0,6 ml de sangre. girando suavemente la aguja o retirándolo poco puede restablecer el flujo si cesa.
   2. La transferencia de la sangre a un tubo heparinizado 1,5 ml y centrifugar a 2000 xg durante 15 min. Precipitar el plasma con cuatro partes de acetonitrilo y se centrifuga a 12.000 xg durante 10 min. Analizar el sobrenadante mediante espectroscopía de cromatografía líquida / masas (LC / MS / MS) ^{11-1312-1412-1412-1412-14.} Si es necesario, almacenar el plasma a -80 ^° C antes del análisis.
9. Utilizando disección roma, liberar la vesícula biliar del hígado. Seccionar el colédoco por debajo de la abrazadera, separación y pesado de la vesícula biliar, y colocarlo en un Microcen 1,5 mltrifuge tubo. Se recoge el hígado.
10. Homogeneizar aproximadamente 100 mg de hígado y la vesícula biliar en todo el hielo en un homogeneizador de tejidos de vidrio de tamaño 21. Se extrae con 75% de acetonitrilo y 25% de agua (800 l para el hígado, los 300 l de vesícula biliar) y se centrifuga a 12.000 xg durante 10 min. Diluir los extractos según sea necesario y cuantificar el contenido de ácidos biliares mediante LC / MS / MS ^11-13.

3. Animales Vivos de protones ⁽¹ H) y flúor (F ¹⁹⁾ Imagen de Resonancia Magnética

1. Para conseguir un llenado de la vesícula biliar máxima, los ratones en ayunas durante al menos 6 horas antes de formación de imágenes. El uso de ketamina y xilazina, anestesiar a los ratones para evitar el movimiento en el escáner de resonancia magnética. Preparar una solución madre de ketamina más xilazina en solución salina tamponada con fosfato (130 ketamina l, xilazina 42,5 l, 827 l de PBS). Una hora antes de la MRI, el uso de una jeringa estéril de 1 ml para inyectar una vía subcutánea al ratón con 5 l / g de peso corporal de esta solución (65 mg de ketamina y 4,25 mg xylazine por kg de peso corporal). Para evitar la sequedad bajo anestesia se aplica un ungüento veterinario a los ojos del animal.
2. Después de la inducción con ketamina / xilazina como anteriormente, una pinza de un área de 1,5 cm ² a la izquierda media inferior del ratón abdomen usando # 40 o hojas de la recortadora eléctrica más finos. Después de la eliminación de la piel, preparar el área con 8 - 12% de solución diluida de yodo lavado quirúrgico y enjuague con alcohol al 70% - repetir las dos etapas. Inserte un calibre 24 por 0,75 pulgadas de aguja / catéter por vía subcutánea y el túnel en la cavidad abdominal. Asegúrese de que el catéter no está en el ciego u otro órgano abdominal tirando el émbolo hacia atrás - no debe haber sangre o materia fecal en el catéter.
3. Retire la aguja y dejar el catéter intraperitoneal. Coloca el ratón sobre una almohadilla térmica con control de temperatura en la cámara de animales escáner de resonancia magnética.
4. Preparar una jeringa de 1 ml estéril que contiene ketamina y xilazina en solución salina tamponada con fosfato (1,000 ketamina l, 300 l de xilazina, 6700 l de PBS) y llenar la longitud deseada del tubo estéril de 72 pulgadas. Conectar el catéter intraperitoneal al tubo estéril precargada y se extienden lejos del escáner de resonancia magnética. Para mantener la anestesia inyectan 50 l de esta solución cada 20 minutos si los signos vitales del ratón son estables.
   NOTA: Antes de imagen, asegúrese de que no hay metales están cerca del escáner de resonancia magnética.
5. Utilice una bobina de MRI volumen lineal de doble sintonizado ¹⁹ F / ¹ H para transmitir y recibir señales de radiofrecuencia a 300,283 MHz para ^1H y 282,524 MHz para ¹⁹ núcleos F.
   1. Realizar la calibración del sistema ^{11, 13} y localización animal con tres cortes (axial, sagital medio, y coronal) imágenes del explorador usando una secuencia de instantáneas de bajo ángulo rápida (FLASH). Para iniciar el experimento, haga clic en el botón de 'semáforo' en la ventana de control de Escaneo en la consola de software.
   2. Adquirir multicorte ¹ H imágenes de RM se utiliza la adquisición rápida con la relajación mejorarción (RARE) secuencia en la vista transversal de la muestra o el cuerpo del animal con el tiempo de repetición de 2.200 ms, tiempo de eco de 8,9 ms, el factor RARO 8, campo de visión 4 x 4 ^cm2, espesor de corte de 1,0 mm, tamaño de la matriz 266 x 266, en el plano de resolución 150 x 150 m ^2, y el número de promedios 6. Para iniciar el experimento, haga clic en el botón de 'semáforo' en la ventana de control de escaneo en la consola de software.
   3. Adquirir ¹⁹ imágenes F utilizando una secuencia FLASH en la misma región de la ^1H RMN con tiempo de repetición de 220 ms, ángulo de rotación = 30 °, tiempo de eco 3.078 ms, tamaño de la matriz 32 x 32, en el plano de resolución 1,25 x 1,25 mm ^2, espesor de corte de 4,0 mm, y el número de promedios 768. Para iniciar el experimento, haga clic en el botón (G o- n- O P ipeline) en la ventana Herramienta de control Espectrómetro en la consola de software 'GOP'.
6. Después de resonancia magnética, sacrificar al ratón con injecti intraperitonealen de 15 l / g de peso corporal de ketamina / xilazina solución (150 mg de ketamina / xilazina 18 mg por kg de peso corporal) seguido por punción cardiaca para la exanguinación.
7. Para recuperar un ratón de la anestesia, retirar el catéter intraperitoneal pero no dejar desatendido el animal hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener decúbito esternal.
8. Para medir las concentraciones de ácidos biliares ¹⁹ marcadas con F ^11-13 de cosecha de órganos, mantener la anestesia con ketamina más xilazina como se ha descrito anteriormente.

Resultados

El uso de MFBA de resonancia magnética in vivo "ver" transporte de ácidos biliares en tiempo real tiene un gran potencial para la investigación y uso clínico. Por otra parte, los métodos descritos aquí para la resección de la vesícula biliar y el análisis bioquímico de su contenido utilizando cromatografía líquida y espectrometría de masas proporcionan un medio para confirmar resultados de las imágenes. Sin embargo, la validez de estos métodos requiere u...

Discusión

La síntesis de CA-lys-TFA y CA-sar-TFMA y el análisis in vitro de su transporte utilizando células de riñón canino Madin-Darby transfectadas de forma estable que expresan ASBT y las células embrionarias de riñón humano que expresa el polipéptido / taurocolato co-transporte de sodio (PNCT) se detalla en otras partes ^13,14. Aquí, la atención se centra en la administración oral de MFBA por sonda a los animales vivos, seguido de la cosecha de la vesícula biliar, el hígado y la sangre para e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Duall size-21 all glass tissue grinder	Kimble Chase Life Science, Vineland, NJ	885351-0022
Bruker BioSpec 70/30USR Avance III 7T horizontal bore MR Scanner	Bruker Biospin MRI GmbH, Germany		Use companion Paravision Version 5.1 software (see step 3.5)
Bruker 40 mm 19F/1H dual-tuned linerar volume coil	Bruker Biospin MRI GmbH, Germany		Use companion Paravision Version 5.1 software (see step 3.5)
Waters Acquity UPLC System with Quadrupole Detector	Waters Corporation, Milford, MA
Waters Acquity UPLC ethylene bridged hybrid C8 1.7 μm 2.1 x 50 mm column	Waters Corporation, Milford, MA
Gavage Needle	Braintree Scientific, INC.	N-010	20 G-1.5" curved 2.25 mm ball
2 Stainless Steel Hemostats	VWR	10755-018	4 and 5 inch, straight
Ketamine	MWI Veterinary Supply	501090	Ketamin zetamine 100 mg/ml
Xylazine	Akorn, Inc.		20 mg/ml
Intraperitoneal Catheter	Abbott	AbbocathTM-T.I.V. G720-A01 4535-42	24-G x 0.75"