La aplicación de barreras impermeables combinadas con empapó las bolas Factor Candidato para el Estudio de señales inductivas en el polluelo

Resumen

Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

Resumen

El embrión de pollo proporciona un modelo excelente de vertebrados que se puede utilizar para diseccionar preguntas de desarrollo en una manera directa. Su accesibilidad y la robustez después de la intervención quirúrgica son las fortalezas clave experimentales. Placas de mica fueron las primeras barreras utilizadas para prevenir polluelo extremidad iniciación del capullo ^1. Se describen protocolos que utilizan papel de aluminio como barrera impermeable al brote del ala o la inducción del brote o la pierna y la iniciación. Combinamos esta técnica con la colocación lateral del talón para la barrera que forma exógena factores endógenos candidatos de alimentación que han sido bloqueados por la barrera. Los resultados se analizaron mediante hibridación in situ de la expresión génica posterior. Nuestra atención se centra en la función de señalización del ácido retinoico en la inducción y posterior inicio de un primer plano de embrión de pollo y las extremidades traseras. Utilizamos BMS 493 (un agonista inverso de los receptores del ácido retinoico (RAR)) perlas empapadas implantados en la placa lateral mesodermo (LPM) para imitar el efecto de una barraportador colocado entre los somitas (una fuente de ácido retinoico (RA)) y la LPM de la que crecen yemas de las extremidades. Las versiones modificadas de estos protocolos también podrían utilizarse para abordar otras preguntas sobre el origen y la sincronización de las señales inductivas. Siempre que la región del embrión de pollo es accesible en la etapa de desarrollo correspondiente, una barrera podría ser colocado entre los dos tejidos y los consiguientes cambios en el desarrollo estudiados. Los ejemplos pueden ser encontrados en el cerebro, la extensión del eje en desarrollo y en el desarrollo de órganos, como el hígado o el riñón inducción.

Introducción

embriólogos clásicos tradicionalmente se emplean técnicas físicas para interrogar a los mecanismos que controlan el desarrollo embrionario. En los años 1960 y 1970, los investigadores desarrollaron técnicas que utilizan barreras impermeables insertados entre los tejidos del embrión en desarrollo para demostrar la importancia de las señales inductivas durante la embriogénesis. Nuestro interés se centra en el desarrollo de extremidades de los vertebrados y, en particular, qué eventos preceden consecuencia primordio de la extremidad. Por ejemplo, la inserción de una barrera puede evitar que la extremidad del brote consecuencia que se produzcan en un lado del embrión de pollo, mientras que lo que le permite proceder normalmente en el lado contralateral, no operado. Los materiales usados ​​para hacer estas barreras variada; por ejemplo, placas de mica ¹ y ² de tantalio de aluminio. Estas barreras separan eficazmente el lateral mesodermo de la placa (LPM), de la que las formas yema de la extremidad, de los somitas forman a partir del mesodermo paraxial. técnicas de injerto quirúrgico demuestran que la estrecha asociación ingenioh la somitas es esencial si la iniciación primordio de la extremidad que va a ocurrir en el LPM ^{3 4.} En los años 80 y 90 los biólogos del desarrollo descubrieron difusible moléculas que son esenciales en el control de los procesos de desarrollo de señalización. Beads empapados con estas moléculas de señalización pueden ser implantados en regiones específicas del embrión y producen alteraciones en el desarrollo embrionario. Por ejemplo, el ácido retinoico (RA) ocupado por los granos de intercambio iónico se libera durante un periodo de 24 horas cuando se implanta en un embrión de pollo y puede producir la duplicación de imagen especular de los dígitos ^5. Los granos de acrílico de heparina que contienen la proteína FGF pueden iniciar extremidad del brote consecuencia de la LPM intramiembro ^6.

Más recientemente ratón y pescado genética han tomado el estudio de la iniciación de los vertebrados extremidad en una nueva era (revisado en ^7). Existe buena evidencia de que la AR presente en los somitas antes de iniciar el primordio de la extremidad es la señal difusible esencial requerido por el LPM para iniciar la brotación extremidad. Quisimos aprovechar la accesibilidad y la robustez experimental del embrión de pollo para diseccionar el efecto de la implantación de barrera sobre la expresión génica en el LPM alrededor del momento de la iniciación primordio de la extremidad. Una adaptación de la novela de nuestro método es combinar una barrera que bloquea las señales de los tejidos axiales con la colocación de talón lateral para la barrera a factores endógenos candidatos suministro exógenamente que han sido bloqueados por la barrera. Los protocolos siguientes son las desarrolladas para desentrañar los mecanismos de inducción esbozo del miembro y la iniciación.

El estudio de la iniciación esbozo del miembro que consiste en utilizar embriones en etapa temprana. Muchos de los huevos de pollo ventana investigadores mediante la eliminación de primera parte de la albúmina a través del saco de aire con una aguja hipodérmica. El embrión, que se encuentra en la parte superior de la yema de huevo, entonces estar más baja en el huevo. Esto es una ventaja para algunas técnicas, tales como la electroporación, pero puede ser una desventaja si se desea una manipulación quirúrgica del embrión.Nos encontramos teniendo el embrión lo más cerca posible de la abertura en el huevo como sea posible es una ventaja.

Aún quedan preguntas con respecto a las señales que controlan la inducción esbozo del miembro de vertebrados e iniciación y los protocolos siguientes son adecuados para abordarlos. Somos los primeros en desarrollar un protocolo para la inserción de las barreras para evitar que la extremidad de pollo brote consecuencia en una etapa anterior a la etapa 12 ^8. Las versiones modificadas de estos protocolos también podrían utilizarse para abordar otras preguntas sobre el origen y la sincronización de las señales inductivas donde un tejido inducción accesible se encuentra adyacente al que se indujo el primordio. Siempre que la región del embrión es accesible en la etapa de desarrollo correspondiente, a continuación, una barrera podría ser colocado entre los dos tejidos y los consiguientes cambios en el desarrollo estudiados. Los ejemplos pueden ser encontrados en el desarrollo del cerebro, la extensión del eje y el desarrollo, posiblemente, de órganos tales como el hígado o el riñón inducción.

Protocolo

El siguiente protocolo utiliza embriones de pollo a menos de diez días de incubación. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con el Kings College de Londres, Reino Unido y las pautas para el cuidado de los animales del Ministerio del Interior del Reino Unido.

1. se requiere preparación previa en Chick Embryo Operación

1. Reúna los siguientes instrumentos quirúrgicos necesarios para las operaciones, para la cosecha y para la fijación de los embriones de pollo: Dos pares de pinzas de relojero Nº 5, un par de pinzas fuertes, por ejemplo, de tipo AA, tijeras curvadas, con hoja de 2,5 cm de largo, curvado extremos romos fórceps con extremos aproximadamente 0,5 cm de largo, y también dos pares de No. 4 pinzas de relojero para usar al hacer barreras de papel de aluminio (1.6.3).
2. Hacer un cuchillo micro de un perno de acero (0,3 mm de diámetro) afiló usando el aceite en una piedra de afilar. El uso de un microscopio binocular, afilar la punta del pasador a una hoja plana. Coloque el pasador en un soporte de la aguja y proteger su extremo afilado de ser golpeado y dented.
   NOTA: Las envolturas el cuchillo con una punta de pipeta de 1.000 l es una opción simple para esto.
3. Preparar etanol al 70% en una botella de lavado de plástico. Utilice un chorro de esto en un pañuelo de papel para limpiar los instrumentos quirúrgicos y el cuchillo micro antes y después de su uso para esterilizar y limpiar ellos.
4. Compre 5 cm de ancho cinta adhesiva transparente y un dispensador adecuado. Encontrar o fabricar un descanso adecuado para contener un huevo de gallina constante en su lado.
5. Marca y soluciones para almacenaje de granos de remojo.
   1. Preparar una solución de 0,35 mg / ml de proteína del factor de crecimiento de fibroblastos 4 (FGF4) de 1 mg madre congelada / ml diluyendo con agua y se almacena a -20 ° C en alícuotas de 30 l.
   2. soluciones Preparar (ya sea 0,05 o 0,1 mg / ml) de todo-trans-retinoico ácido (RA) diluido con sulfóxido de dimetilo (DMSO) en tubos de microcentrífuga oscuros de una 5 mg / ml de stock. Almacenar el caldo y 100 ml de alícuotas a -20 ° C.
   3. Preparar soluciones (ya sea 2,5 o 5 mg / ml) de BMS 493 (un ag inversaperonista de los RAR) diluido con DMSO en tubos de microcentrífuga oscuros de un 10 mg / ml de stock. Almacenar el caldo y 100 ml de alícuotas a -20 ° C.
6. Hacer barreras de papel de aluminio.
   NOTA: La lámina se utiliza para hacer las barreras es papel de catering estándar (medida por micrómetro como 0,013 mm de espesor). Cualquier papel de aluminio doméstico probablemente sería adecuado.
   1. Cortar un trozo cuadrado de 1 cm de papel de aluminio y esterilizarlo frotándola con un 70% de etanol en un tejido. Colocarlo en un 6 cm de plástico estéril placa de Petri. Desechar la tapa y hacer una tapa para el plato de papel de aluminio.
      NOTA: Esto evitará que las barreras de corte más tarde se pegue a la tapa de plástico de la placa debido a la estática.
   2. Coloque la placa de Petri en la parte superior de una retícula etapa (1 cm de largo se separaron en 100 secciones) bajo un microscopio binocular con un aumento ajustado a 1,6 veces. Usar una hoja No.15 pequeño bisturí, cortar tiras de la lámina a una anchura exacta, por ejemplo, 0,7 mm o 1,3 mm.
   3. Separar la láminatiras usando dos pares de pinzas de relojero Nº 4. A continuación, hacer una curva en ángulo recto en el centro de la barrera de lámina de tal manera que se asemeja a una bisagra de la anchura específica.
      NOTA: Esta forma de barrera se toma de ^{9, 10.} Una barrera articulada se mantiene en su lugar mejor que una barrera recta y plana. Nº 4 fórceps son relativamente romo y se utilizan porque son menos propensos a hacer abolladuras o las puntuaciones en las barreras de papel de aluminio.
   4. Alineación de las barreras en el centro de la placa de Petri con un lado plano contra el plato y el otro hacia arriba fuera del plato, moviendo la lámina sin cortar restante a un lado. Preparar 20 o más barreras antes del día de la operación. Coloque la tapa de lámina sobre el plato y almacenar las barreras en un lugar donde no se verá afectado.
      NOTA: A pesar de un ligero golpe puede inclinar las barreras más o significar que se pegan con la estática de los lados del plato.
7. Se incuban los huevos de gallina fertilizados en sus lados en bandejas de cartón de huevos a los 38 °C para la longitud de tiempo apropiado antes de día funcionamiento de modo que los embriones estará en el ⁸ etapa deseada.

2. Preparación del polluelo Los embriones y los granos en el Día de Operación

1. 'Ventana' incuba los huevos de gallina.
   NOTA: El siguiente método para la apertura de los huevos fue transmitida por Dennis Summerbell (no publicado).
   1. Con el huevo acostado de lado, perforar el extremo romo (finales de los sacos aéreos) del huevo con unas pinzas tipo AA fuertes asegurándose de que la membrana de la cáscara interior se ha roto. Para ello captar la pinza firmemente juntos y usar un movimiento punzante controlada mientras sostiene el huevo con la mano libre.
   2. Tome el huevo, aún acostado de lado, con las dos manos (una a cada lado) convertirlo a través de 180 ° en el eje horizontal y sustituirlo en la bandeja de huevos de manera que el lado que era superior es ahora junto a la bandeja.
      NOTA: Esto afloja el embrión de las membranas de la cáscara y se significa que el embrión es less probable que se corte cuando se retira la carcasa por encima del embrión.
   3. Tome un pedazo de cinta adhesiva transparente de aproximadamente 5 cm cuadrados y se adhieren esta estrechamente sobre la superficie superior del huevo para detener la cáscara del huevo se desintegrara en el embrión cuando se abre el huevo.
   4. Use las tijeras curvas para romper suavemente a través de la cáscara y las membranas en el centro de la parte superior del huevo, hacer un agujero muy pequeño con una hoja de la tijera de modo que el aire pueda entrar en el huevo sobre el embrión (que se encuentra justo debajo la parte más superior de la cáscara).
      NOTA: Por simplemente rompiendo las membranas de la cáscara y no romper cualquiera de las membranas que cubren el embrión, el aire que entra en el huevo se separará el embrión de la cáscara y el embrión vendrá a descansar en la parte superior de la yema aproximadamente 0,5 a 1 cm de la cáscara .
   5. Use las tijeras curvas para agrandar el agujero en la cáscara de un círculo con un diámetro de aproximadamente 1 cm. Retire el trozo de cáscara extirpado y cubrir el agujero en el huevo con unapedazo de cinta adhesiva transparente de aproximadamente 5 cm cuadrados. Para retirar fácilmente esta cinta, presione la cinta para pegar sólo en el borde del agujero, dejando la cinta que queda libre. La cinta en blanco a continuación, puede ser comprendida de desprecintar el huevo.
2. embriones en estadio de
   1. Después de incubación a 38 ° C (véase el paso 1.7) y de ventanas (paso 2.1), usar un microscopio binocular para organizar los embriones de pollo de acuerdo con ^8. Hacer esto justo antes de que los huevos se sellan después de ventanas. Escribe la etapa de cada embrión en la cáscara del huevo. Devolver los huevos a la incubadora.
      NOTA: Los embriones en etapas entre 8 y 15 son apropiados para la barrera y de talón experimentos. Los embriones tienen más probabilidades de sobrevivir si no se han quedado fuera de la incubadora durante demasiado tiempo antes de la operación.
3. perlas de remojo antes de la operación.
   1. FGF4
      1. Tome el número de perlas de gel de cromatografía de afinidad (150 a 300 micras) que se adhieren a la final de una punta de pipeta 1.000 l y estabah en 1 ml de buffer fosfato salino (PBS) en un tubo de microcentrífuga para eliminar la azida que se almacenan en. Centrifugar durante 5 seg, desechar el PBS y se repite el proceso dos veces.
      2. Remojar las perlas de gel en una caída de 30 l de 0,35 mg de proteína FGF4 / ml en una placa de Petri estéril en hielo durante 30 min. Recoger los granos de aproximadamente 150 micras de diámetro con No. 5 microforceps para la inserción en el embrión.
         NOTA: la manija perlas de resina de intercambio iónico usadas en los siguientes pasos con el número 5 y microforceps agarre ellos muy suavemente porque las perlas son frágiles y pueden romperse si exprimido con demasiada fuerza. Esta advertencia se aplica a todas las operaciones y 2.3.2-2.3.3 perla de resina.
   2. REAL ACADEMIA DE BELLAS ARTES
      1. Descongelar una alícuota de 0,05 o 0,1 mg / ml, todo-trans-RA diluye con DMSO y se coloca una gota de 100 l en una placa de Petri estéril (9 cm de diámetro), que ha sido previamente cubierto de papel de aluminio para proteger la RA de la luz. Tome una punta de pipeta de 10 l y recoger un poco de intercambio iónico en forma de cloruroperlas de resina en su extremo y tomar estos en la caída de RA protegido de la luz a temperatura ambiente durante 20 min.
      2. Enjuagar las perlas en tres gotas sucesivas de 100 l de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) colocados en el mismo plato Petri al menos 1 cm de separación.
         NOTA: Las perlas ocupan el colorante rojo de fenol de la DMEM. Este método se basa en ^5.
      3. Recoger los granos de aproximadamente 100 micras de diámetro (perlas varían en tamaño desde 75 hasta 180 micras cuando está mojado) para la inserción en el embrión, el uso de un portaobjetos de retícula platina del microscopio bajo los microforceps placa de Petri y No.5 para contener las perlas. Al recoger el talón de la caída de 100 l de DMEM, primero lugar el cordón hacia abajo sobre la placa de Petri y eliminar cualquier DMEM restante de ella, ya sea por empujando el cordón fuera de la gota o mediante la colocación de las pinzas cerradas al lado del talón (capilar acción se basa el líquido lejos de la perla).
   3. BMS 493
      1. En cuanto a la AR (2.3.2), en remojo interc ionesperlas de resina ange en una caída de 100 l de 2,5 o 5,0 mg / ml BMS 493 en DMSO a temperatura ambiente durante 20 min y después se enjuagan en 100 gotas mu l de DMEM. Recoger los granos de aproximadamente 100 micras de diámetro para la inserción en el embrión.
   4. control de DMSO
      1. En cuanto a la RA (2.3.2), en remojo perlas de resina de intercambio iónico en una caída de 100 l de DMSO a temperatura ambiente durante 20 min y luego enjuague en 100 gotas mu l de DMEM. Recoger los granos de aproximadamente 100 micras de diámetro para la inserción en el embrión.

3. Operaciones de barrera y del grano

Figura 1. Esquema de embriones de polluelo diversas etapas que muestra dónde y Barreras o los granos deben ser colocados. (A) Etapa 13 embriones de pollo esquema que muestra la posición de barrera (línea verde) entre somitas y LPM en la presunciónAla Nivel tiva (somitas 15-20). (B) El mismo esquema que en (A), lo que indica donde cordón de RA (círculo rojo) se debe colocar antes de la inserción de barrera. (C) Esquema que muestra la posición de barrera (línea verde) a nivel de la pierna presuntiva (somitas 26-32) en un embrión en la etapa 15. (D) El mismo esquema que en (C), lo que indica donde un cordón de RA (círculo rojo) debe ser colocado. (E) Esquema que indica donde BMS 493 perlas (círculos de color púrpura) se deben colocar en la LPM de un embrión de etapa 15. (F) Diagrama esquemático de una etapa 9 embrión de pollo que indica la posición de barrera (línea verde) entre el mesodermo y presomitic LPM a nivel del ala presuntiva. (G) Diagrama esquemático de un embrión de etapa 9, que muestra las posiciones de una barrera (línea verde) y bolas de RA (círculo rojo). (H) Esquema de un embrión de pollo etapa 10, que muestra la posición de barrera (línea verde) a nivel de la pierna presuntiva. (I ) Diagrama esquemático que muestra BMS 493 posición de talón (círculo morado) en la etapa 10 LPM nivel de la pierna. Esta cifra ha sido modificado a partir de ^7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Barrera inserta en la etapa 13 para evitar la iniciación del brote ala.
   1. Tomar un embrión de etapa 13 de la incubadora y colocar el huevo en un resto de huevo con un microscopio binocular se establece en 3,2X aumentos o más si se prefiere. Eliminar la capa superior de cinta adhesiva transparente.
      1. Usando un cuchillo de acero micro, hacer una incisión a través de la membrana vitelina y lateral placa mesodermo (LPM) adyacente a somitas 15 a 20 (Figura 1A) en el lado derecho del embrión (somitas no todos han formado en esta etapa). Cortar adyacente a los últimos cuatro somitas formados y continuar el corte dos longitudes somite en sentido caudal.
      2. Recoge la barrera (0.7-1 mm de ancho) con el número 5 MICROFOrceps en el extremo que sobresale de la placa de Petri y torcer la mano para insertar el extremo libre de la barrera en la incisión. La barrera en forma de bisagra quede plana sobre la membrana vitelina por encima de la LPM con medio de ella que sobresale hacia abajo a través de la incisión distal a los somitas. Tan pronto como sea posible sellar el huevo con cinta adhesiva transparente y devolverlo a la incubadora.
         NOTA: El cuchillo micro y fórceps convertirse en pegajosa en contacto con la membrana vitelina. Es importante limpie con etanol al 70% antes de intentar una operación posterior. Esto se aplica a todas las descripciones de las operaciones posteriores a talón y implantaciones.
      3. Si un cordón se va a insertar en conjunción con una barrera; En primer lugar, tomar el grano en el número 5 microforceps y la inserta en la cara de corte de la LPM en la parte distal de la incisión y luego insertar la barrera en la parte proximal de la incisión a la perla (Figura 1B). Sellar el huevo y devuelvan lo antes posible a la incubadora.
2. Barrera inserta en la etapa 15 para evitar la iniciación del brote de la pierna.
   NOTA: Un ejemplo del resultado de esta operación en Tbox 4 factor de transcripción la expresión (Tbx4) se muestra en la Figura 2D y 2E.
   1. Tomar un embrión de etapa 15 de la incubadora y colocar el huevo en un resto de huevo con un microscopio binocular se establece en 3,2X aumentos o más si se prefiere. Eliminar la capa superior de cinta adhesiva transparente.
      1. Usando un cuchillo de acero micro hacer una incisión a través de la membrana vitelina y LPM adyacente a somitas 26 a 32 (Figura 1C) en el lado derecho del embrión (somitas no todos han formado en esta etapa). Cortar adyacente a los dos últimos formados somitas y continuar el corte cinco longitudes somite en sentido caudal.
      2. Recoge la barrera (1,2-1,3 mm de ancho) con el número 5 microforceps en un extremo y torcer la barrera para insertar el extremo libre en la incisión. Tan pronto como sea posible sellar la clara de huevo con cinta de unand devolverlo a la incubadora.
         NOTA: La bisagra en forma de barrera se encuentra plana sobre la membrana vitelina por encima de la LPM con medio de ella que sobresale hacia abajo a través de la incisión distal a los somitas.
      3. Si una gota se va a insertar en conjunción con una barrera, en primer lugar, tomar el grano en el número 5 microforceps y la inserta en la cara de corte de la LPM en la parte distal de la incisión y luego insertar la barrera en la parte proximal de la incisión el talón (Figura 1D). Sellar el huevo y devuelvan lo antes posible a la incubadora.
      4. Si una perla o perlas se van a insertar sin una barrera, por ejemplo, BMS 493 cuentas a la región de la pierna en la etapa 15, no hacen la larga incisión (3.2.2.1). Hacer una pequeña incisión a través de la membrana vitelina y en el LPM en la posición de la perla se va a colocar. Tome el cordón en el número 5 microforceps y la inserta en el agujero de la LPM. Empujarlo en un poco más con los extremos cerrados de las pinzas (Figura 1E).
3. Barrera inserta en la etapa 9 para evitar la inducción del brote del ala y la iniciación.
   1. Tome una etapa 8 o 9 embrión de la incubadora y colocar el huevo en un resto de huevo con un microscopio binocular se establece en 3,2X aumentos o más si se prefiere.
      1. Usando un cuchillo de acero micro hacer una incisión a través de la membrana vitelina y LPM lateral y rostral a la línea primitiva, en el extremo caudal del embrión en línea con las somitas (Figura 1F) sobre 5 somite grandes longitudes.
      2. Recoger la barrera (0.7-1 mm de ancho) con el número 5 microforceps en el extremo que sobresale de la placa de Petri y torcer la mano para insertar el extremo libre de la barrera en la incisión. Tan pronto como sea posible sellar el huevo con cinta adhesiva transparente y devolverlo a la incubadora.
         NOTA: La bisagra en forma de barrera se encuentra plana sobre la membrana vitelina por encima de la LPM con medio de ella que sobresale hacia abajo a través de la incisión.
      3. Si un grano es ser INSERTEd en combinación con una barrera; En primer lugar, tomar el grano en el número 5 microforceps y la inserta en la cara de corte de la LPM en la parte distal de la incisión y luego insertar la barrera en la parte proximal de la incisión a la perla (Figura 1G). Sellar el huevo y devuelvan lo antes posible a la incubadora.
4. Barrera inserta en la etapa 10 para evitar la inducción del brote de la pierna y la iniciación.
   NOTA: Un ejemplo del resultado de esta operación en la expresión Tbx4 se muestra en la figura 2G.
   1. Tomar un embrión de etapa 10 de la incubadora y colocar el huevo en un resto de huevo con un microscopio binocular se establece en 3,2X aumentos o más si se prefiere.
      1. Usando un cuchillo de acero micro hacer una incisión a través de la membrana vitelina y LPM lateral a la línea primitiva, en el extremo caudal del embrión en línea con las somitas (Figura 1H) aproximadamente 6 somite grandes longitudes.
      2. Recoge la barrera (1.2mm de ancho) con el número 5 microforceps en el extremo que sobresale de la placa de Petri y torcer la mano para insertar el extremo libre de la barrera en la incisión. Tan pronto como sea posible sellar el huevo con cinta adhesiva transparente y devolverlo a la incubadora.
         NOTA: La bisagra en forma de barrera se encuentra plana sobre la membrana vitelina por encima de la LPM con medio de ella que sobresale hacia abajo a través de la incisión.
      3. Si un cordón se va a insertar sin una barrera, por ejemplo, BMS 493 cordón a la región de la pierna en la etapa 10, hacer una pequeña incisión a través de la membrana vitelina y en el LPM en la posición de la perla se va a colocar. Tome el cordón en el número 5 microforceps y la inserta en el agujero de la LPM. Empujarlo en un poco más con los extremos cerrados de las pinzas (Figura 1I).
5. 24 horas o más después de operar a comprobar la posición de la barrera en comparación con la yema de la extremidad contralateral emergente. Descarte cualquier embriones en el que la barrera no es claramente Oposite la yema de la extremidad izquierda. En este caso, la barrera ha sido colocado erróneamente.

4. La recolección de embriones, Fijación y preparación para Wholemount de hibridación in situ (deseo)

1. embriones post cosecha operación.
   1. embriones de la cosecha en la etapa 19 a 23 de tal manera que la morfología de yema del miembro es claramente visible tanto en los lados de control operados y contralateral.
      1. Con unas tijeras curvas cortan un agujero más grande en la cáscara del huevo. Corte alrededor del embrión mientras sostiene el vaso sanguíneo grande a la izquierda del embrión con microforceps. Use este agarre del recipiente para eliminar el embrión y colocarlo en una placa de Petri de tampón fosfato salino (PBS) pH 7,3.
      2. Bajo un microscopio binocular, diseccionar vasos embrionarios adicionales y las membranas utilizando una combinación de tijeras curvas y no. 5 microforceps. Retire el cabezal con las tijeras.
2. La fijación de los embriones post-cosecha.
   1. Usando Blun curvadat fórceps, levantar el embrión y lo colocan en 5 ml de paraformaldehído al 4% (PFA) en PBS a temperatura ambiente durante dos horas y luego mecedora a 4 ° C durante la noche en una botella de vidrio de 20 ml con tapón de rosca.
      Precaución: PFA es un peligro grave para la salud. Es un irritante nocivo, corrosivo y el polvo se debe evitar que entren en contacto con la piel, los ojos y los pulmones. Usar ropa de protección personal y una campana de humos mientras se prepara la solución. Una vez que se trata de una solución al 4%, guantes, gafas protectoras y una bata de laboratorio deben ser puestas.
      NOTA: Es importante obtener los embriones en solución rápidamente para mejor preservar la integridad del ARNm.
3. La eliminación de las barreras antes de wholemount hibridación in situ.
   NOTA: Se eliminan las barreras, ya que son afilados y pueden dañar embriones a medida que avanzan a través del protocolo de hibridación in situ, especialmente si varios embriones se tiñeron a la vez.
   1. Después de la fijación, colocar el embrión en un plato de PBS con arreglo a mi binocularcroscope.
   2. El uso de dos pares de No. 5 microforceps, colocar el par izquierdo de cerca cada lado de la barrera en el lado operado del embrión. Agarre la barrera con el par y tirar suavemente de la barrera del embrión usando el par de la izquierda para mantener el embrión hacia abajo y para evitar cualquier tejido se adhiera a la barrera, ya que se elimina.
4. Llevar a cabo DESEO esencialmente como se describe en el ^11.

Resultados

El protocolo detallado anteriormente se describen los métodos empleados en Nishimoto y col. , 2015. El documento estudia la inducción esbozo del miembro y la iniciación tanto en la proa y las extremidades posteriores del embrión de pollo. Resultados después de la inserción de barreras impermeables para evitar la proliferación de la yema de la extremidad anterior han sido publicados anteriormente ^{1, 2, 9} pero no ha habido únicas barreras que impiden que describen un estudio de la pierna iniciación del capullo ^1. Los datos de los miembros posteriores de Nishimoto y col. De 2015 se presentan aquí como representante resultados del estudio de la expresión de ARNm después de la inserción de barrera.

Expresión Tbx4 en el LPM no es suficiente para iniciar miembro posterior Consecuencia:
Las Figuras 2B y C (Tabla 2) muestran que la inserción de barrera en la etapa 15 (Figura 2 A) (véase el protocolo 3.2) conduce a los dos Fgf10y la expresión Fgf8 estar ausente en la región de brote de la pierna (denotado por soporte) en el lado derecho operado. Comparar con el lado no operado izquierda. Sin embargo, la expresión Tbx4 se observa tanto en la etapa 19 y la etapa 23 en el lado operado (Figura 2D y E). Llegamos a la conclusión de que la expresión Tbx4 sí sola no es suficiente para iniciar la extensión de las extremidades posteriores de la LPM. Otros estudios en el pollo han sugerido que la expresión de genes Tbx es suficiente para iniciar la formación de brotes extremidad anterior ^{12, 13.}

Figura 2C 'se incluye para ilustrar cómo una barrera parece que va incrustada en la región de la pierna del puesto de embriones fijación. En la mayoría de los casos, las barreras se eliminaron antes de la hibridación in situ (protocolo 4.3).

RA de los somitas es esencial en la LPM antes Fgf10 induce la extremidad del brote Outgrowth:
La Figura 3A es un esquema que representa la adición de un distal del grano RA empapada a una barrera insertado en la etapa 15 (protocolo 3.2.1.3). Después de esta operación de extensión yema del miembro (indicada por un asterisco) se observa en el lado derecho operado y Tbx4, Fgf10 y Fgf8 se expresan en el brote como en el lado izquierdo de control (Figura 3B, C y D, Tabla 2) . Por lo tanto la adición de RA a la LPM supera el efecto de la barrera y de las extremidades iniciación del capullo producto. Se concluye que en la AR desarrollo normal de los somitas es esencial en la LPM antes de excrecencia de yema de la extremidad puede ser iniciado. Las yemas de las extremidades posteriores resultantes son generalmente más pequeños que los del lado de control. Esto puede ser debido a la dosis de RA en el LPM ser no es equivalente a la situación de tipo salvaje. Si la dosis es demasiado alta RA apical ectodérmica la cresta (AER) se puede acortar y brotes pequeños resultaría^{14, 15.}

Para confirmar que RA (de los somitas) en el LPM es necesaria para la iniciación del capullo extremidad normal un agonista inverso de RAR, BMS 493, se utilizó. Beads se implantan en la región de la pierna LPM en la etapa 15 (véase el protocolo 3.2.1.4) (Figura 3E). Expresión Fgf10 es downregulated después de la aplicación de BMS 493 perlas en el LPM, resultando en brotes miembros posteriores más pequeños en comparación con el lado de control (Figura 3F; Tabla 3). Perlas de control de DMSO no causan estos defectos (Figuras 3G y 3H, Tabla 3). Los defectos observados después de la aplicación BMS 493 son más leves que los inducidos por una operación de barrera; es decir, Fgf10 todavía se expresó y se forman yemas de las extremidades. Esto es probable que sea debido a que los efectos de BMS 493 están restringidos a nivel local alrededor de los granos y pueden no ser capaces de antagonizar toda la RA producido por axiAL tejidos.

Las señales principios axiales Especificar las células LPM que expresaría más tarde Tbx4:
Hemos probado cuando el LPM adquiere su capacidad de expresar Tbx4 en la región que forma prospectiva la pierna. La etapa temprana en la cual una barrera que se puede insertar posteriormente bloquear la pierna brote consecuencia, es la etapa 10. Somos los primeros en desarrollar un protocolo para insertar barreras en las etapas anteriores a la etapa 12. Barreras insertados entre el mesodermo paraxial y la pierna presuntiva LPM en la etapa 10 (ver protocolo 3.4) la formación de yemas bloque de la pierna y la expresión de Tbx4 en el LPM formando pierna-(Figuras 2F y 2G, la Tabla 2), lo que sugiere que se requiere una señal a partir de tejidos axiales en la etapa 10 para la expresión posterior de Tbx4 en LPM miembro posterior. Comparar este resultado con las figuras 2D y E, donde inserción posterior barrera permite la expresión Tbx4que se establezcan. Por otra parte, hemos probado si esta señal podría ser axial AR observando si el agonista inverso de RAR reduce la expresión Tbx4. Un BMS 493 cordón colocado en la extremidad posterior LPM en la etapa 10 (véase el protocolo 3.4.1.3) disminuir la expresión de Tbx4 (Figuras 2H y 2I), mientras que los granos de control empapados en DMSO no afectan a la expresión Tbx4 (figuras 2J y 2K). En conjunto, estos resultados apoyan un modelo que una señal de RA a partir de tejidos axiales regula la inducción de la extremidad mediante la regulación positiva Tbx4 en el LPM miembro posterior ^7.

Muerte post-operatorio:
Las tablas 1, 2 y 3 se dan detalles de los resultados experimentales, incluyendo el número de embriones de pollo que murió posterior operación y antes de la cosecha. Algunas de las muertes son de esperar después de la microcirugía de esta naturaleza. El número moribundos se puede mantener a un mínimo, asegurándose de que los instrumentos están limpias, el agujero en el huevo es el tamaño mínimo necesario, que los embriones se dejan sin la protección de la junta de cinta adhesiva durante un tiempo mínimo y, en relación con este último punto que la operación se lleva a cabo lo más rápidamente posible. Ninguna de estas operaciones son mucho tiempo, pero las operaciones en los granos y las barreras tomar un poco más de tiempo. A pesar de estas medidas, las operaciones realizadas en las primeras etapas y los de la región del ala son más propensos a causar la muerte. Hay grandes vasos sanguíneos alrededor de las regiones de formación de las extremidades y la rotura accidental de estos vasos pueden conducir a la muerte debido a la pérdida de sangre. Nos encontramos con que los huevos se abrieron en la etapa 8 o 9, cuyos embriones no han sido operados, a menudo mueren por el día siguiente. Por lo tanto, la única solución a estos problemas es llevar a cabo un gran número de experimentos.

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Figura 2. Marcador cambios de expresión génica siguientes Barrera o perla de inserción al presunto nivel de las patas. (A) Posición esquema que muestra barrera (línea verde) a nivel de la pierna presuntiva (somitas 26-32) en un embrión en la etapa 15. (B - E y G) Análisis deseo en embriones operados. La región de la pierna se describe (entre paréntesis). (B) la expresión Fgf10 está ausente en el LPM operado, pero la expresión robusta se detecta en el brote izquierda. (C) la expresión Fgf8 está ausente en el lado operado, lo que sugiere que no hay AER. (C ') del mismo embrión antes de eliminar la barrera. (D) Tbx4 se expresa en la LPM en el mismo nivel rostro-caudal como la clavija de control. (E) la expresión Tbx4 se mantiene en la región de la pierna derecha pesar de la ausencia de crecimiento de la extremidad. (F) Diagrama esquemático de una etapa 10 de embrión de pollo que muestra la posición de barrera (línea verde) a nivel de la pierna presuntiva. (G) la expresión Tbx4 está ausente en el derecho operado LPM (soporte). (H) Esquema de un embrión de pollo etapa 10, que muestra la posición 493 BMS talón (círculo de color púrpura) a nivel de la pierna presuntiva. (I) expresión Tbx4 es downregulated en el lado derecho operado después del tratamiento con BMS 493. (J) Diagrama esquemático de un embrión de pollo etapa 10 que muestra el control de posición DMSO talón (círculo gris). (K) Tbx4 se expresa en el lado derecho operado en un nivel similar a la de la parte izquierda de control después del tratamiento con DMSO solo. Esta cifra ha sido modificado a partir de ^7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3. Ausencia RA rescates extremidades del brote causado por Barrera de inserción y es esencial en el LPM Antes de la pierna Bud excrecencia. (A) Diagrama esquemático que indica la posición de barrera (línea verde) a nivel de la pierna presuntiva (somitas 26-32) y un cordón empapado-RA (círculo rojo). (B - D) RA rescates consecuencia del brote de la pierna (que se muestra con un asterisco). (B) la expresión Tbx4 está presente en la yema pierna rescatado similar al lado no operado. (C) Fgf10 se expresa en la pierna rescatado yema similar al lado no operado. (D) Fgf8 se expresa en la AER de la yema pierna derecha rescatado. (E) Esquema que indica donde se colocaron BMS 493 granos (círculos púrpuras) en el LPM pierna presuntivo de la etapa 15 embriones. (F) Expresión Fgf10 es downregulated en el lado derecho operado y el brote de la pierna es pequeño BMS 49 siguiente3 tratamiento. Perlas están marcados con asterisco. (G) esquemática similar a (E), que indica la posición de control de perlas de DMSO (círculos grises). (H) perlas de DMSO (marcadas con asteriscos) no afectaron la expresión Fgf10 o tamaño de la cabeza de la pierna. Esta cifra ha sido modificado a partir de ^7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Etapa barrera colocada (+ perla) *	número operado	Ala falta **	Ala presentes **	número muertos
etapa 12-14	40	24	1	15
etapa 8/9	sesenta y cinco	23	0	42
Etapa 12-13 (FGF4 perla)	41	7 (falta de talón)	17	17
Etapa 12-13 (RA perla)	75	9 (que falta perla)	32	34
Etapa 13 (bola de control)	5	3	0	2
* Barreras de lámina 0,7-1 mm colocados entre 15-20 somitas y el mesodermo de la placa lateral. 0,35 mg / ml de perlas FGF4. 0,05 a 0,1 mg / ml de perlas RA.
microesfera de control DMSO.
** Los embriones de pollo etapas fijas 21-23

Tabla 1. Ala Nivel de Barrera y del grano Experimento resultados.

Etapa barrera colocada (+ perla) *	número operado	Pata faltante **	Pierna presente **	número muertos
etapa 12-15	43	39	0	4
etapa 10/11	23	dieciséis	0	7
Etapa 15 (perla FGF4)	8	0	5	3
Etapa 15 (perla RA)	18	0	18	0
* Barreras de lámina 0,7-1,3 mm colocados entre 26-32 somitas y el mesodermo de la placa lateral. 0,35 mg / ml de perlas FGF4. 0,05 a 0,1 mg / ml de perlas RA.
** Los embriones de pollo etapas fijas 18-24

Tabla 2. Nivel de Barrera de la pierna y el talón Experimento resultados.

número operado	Pierna brote pequeña	Pierna brote un poco pequeña	Pierna tamaño normal del brote	número muertos
BMS 493 perlas *
15	12	3	0	0
perlas de DMSO **
12	0	3	9	0
* 2-3 empapó las bolas en 5 mg / ml BMS 493 colocados en la derecha del escenario 14-15 LPM a nivel de la pierna.
** 2-3 perlas empapadas en DMSO solo colocan en el derecho de la etapa 15 LPM a nivel de la pierna.
Los embriones de pollo fijados en las etapas 17-19.

Tabla 3. Nivel de la pierna BMS 493 del grano Experimento resultados.

Discusión

Se describe el uso de barreras impermeables para evitar la formación del brote en el embrión de pollo. Esta técnica tiene una serie de pasos críticos. Después de los experimentos preliminares, se encontró que las barreras en forma de bisagra utilizados en ^{9, 10} permanecen en su lugar en el embrión mucho mejor que las barreras rectas. El lado plano distal de la barrera se pega a la membrana vitelina y mantiene la barrera en su lugar (Figura 2C '). La preparación cuidadosa de las barreras en forma de bisagra de hoja de aluminio como se describe en el paso de protocolo 1.6 es esencial para el éxito de la operación. Un segundo paso importante es asegurarse de que los huevos no se queden fuera de la incubadora durante demasiado tiempo después de ventanas y puesta en escena antes de operar sobre el embrión. En nuestra experiencia, los embriones sobreviven una operación mejor si están en o cerca de la temperatura de incubación, cuando la operación se lleva a cabo. Por lo tanto, las operaciones deben llevarse a cabo lo más rápidamente posible y volver a sellar los huevos prontaLy para asegurar una buena supervivencia. Muchos investigadores añaden una gota de antibióticos para el embrión después de la microcirugía antes de devolver los huevos a la incubadora. La presencia del líquido impidió que las barreras se peguen bien en posición. La adición de antibióticos también podría desalojar los granos después de la colocación. Se recomienda, por tanto, no usar antibióticos, operaciones rápidas y buena limpieza con instrumentos para evitar la infección. Limpiando los instrumentos con etanol al 70% después de cada etapa de una operación es esencial para evitar que los instrumentos se vuelvan pegajosas del contacto con la membrana vitelina que puede causar tanto las barreras o perlas se adhieran a una pinza (véase la etapa de protocolo 3.1.2.2). Ambas variedades de granos utilizados podrían caer fuera de lugar después de la operación. Cuando la posición de la barrera se comprobó el día siguiente que no era posible ver a través de la barrera para determinar si el cordón se mantuvo en su lugar o no. En los casos en que el cordón se había caído excrecencia de la yema del ala no fue rescatado ( Tabla 1). Evitar la transferencia de líquido con el cordón cuando la implantación de los mismos significa que los granos se adhieren más fácilmente a la cara de corte de la LPM (ver protocolo 2.3.2.3). Finalmente asegurar que los embriones se reparan inmediatamente después de la cosecha es fundamental para un buen análisis de la expresión génica posterior (véase la etapa de protocolo 4.2).

Este protocolo modifica experimentos publicados anteriormente que utilizan barreras para evitar la iniciación esbozo de la extremidad, define anchos óptimos específicos para las barreras e introduce la combinación de barrera y la colocación del grano seguido por análisis de la expresión génica. Encontramos el uso de papel de aluminio convencional, que es barato y fácilmente disponible en todos los laboratorios, produce resultados iguales a los que anteriormente se utilizan lámina de tantalio. La lámina se puede dejar en el embrión cuando se lleva a cabo la hibridación in situ (Figura 2C ') pero por lo general eliminar si más de un embrión se está procesando para evitar que los bordes afilados de la lámina dañar embriones. PAGestudios Ilot demostraron que el ancho de las barreras región de la pierna es particularmente importante. Inicialmente las barreras de Code eran demasiado cortos y el crecimiento del brote de la pierna no se impidió. 1,2-1,3 mm es el ancho óptimo para una barrera para bloquear consecuencia del brote de la pierna por completo. Las barreras de las alas más estrechas que se puede colocar con precisión para evitar la extensión del brote dan las mejores tasas de supervivencia. Esto puede ser tan estrecha como 0,5-0,7 mm. Sin embargo, las barreras que son un poco más amplio son más propensos a resultar en un bloqueo completo del ala consecuencia brote debido a que permiten un poco de inexactitud de colocación (utilizamos 0,7-1 mm). La evitación de los vasos sanguíneos al hacer la incisión es crítico para las barreras a nivel de la yema del ala. barreras semipermeables previamente se han utilizado para dividir en dos la yema polluelo extremidad. Maccabe y Parker, 1976 y Summerbell de 1979 tanto filtros utilizados 0,45 micras y 0,8 micras de tamaño de poro, respectivamente, ^{16, 17.} Se informó de que las señales difusibles podrían pasar a través de los poros de los filtros y que laslos resultados obtenidos, utilizando barreras semipermeables estaban a medio camino entre un esbozo de la extremidad con ninguna barrera presente y uno con una barrera de lámina impermeable tantalio. Este protocolo podría ser adaptado para utilizar barreras semipermeables de diferente tamaño de poro para diferenciar señales candidatas basadas en el tamaño o para modificar la dinámica de la difusión de la señal.

Este protocolo tiene varias limitaciones asociadas principalmente con el modelo mismo organismo. Tales técnicas podrían utilizarse para sondar más preguntas en desarrollo de las extremidades y también otras preguntas de la embriogénesis de vertebrados. Una condición es que el órgano / área en cuestión debe estar desarrollando cuando el embrión de pollo se puede acceder a la intervención. La presencia de grandes vasos sanguíneos en el área donde una barrera tiene que ser colocado hace que la colocación de barrera más tarde de la etapa 13 o 14 de un desafío técnico. Si se cortan los vasos sanguíneos grandes durante la colocación de barrera que esto puede causar la mortalidad embrionaria. Nuestra investigación de cuando los factores de transcripción TBX5 y Tbx4 son inducidas por primera vez en la LPM estaba limitado por la etapa más temprana a la que podríamos colocar una barrera que más tarde terminan opuesta, ya sea el ala o un bastoncillo de la pierna, respectivamente. Podría ser esclarecedor para intentar bloquear Tbx inducción de genes en las primeras etapas, más cerca de la gastrulación. La primera barrera se podría colocar en la región de ala presunto fue con éxito la etapa 8 y en la etapa región de la pierna 10. Este protocolo no es probablemente adecuada para el estudio de la expresión génica más allá de las etapas yema de la extremidad debido a un rápido crecimiento posterior desplazaría la barrera y resultados se referirá exclusivamente a la posición inicial de la barrera.

Habiendo relacionadas las limitaciones del embrión de pollo en este contexto, sus ventajas sobre otros organismos modelo de vertebrados son muchas. El embrión de pollo es un modelo animal muy adecuado para este tipo de intervención física en un embrión de vertebrados. Los embriones son relativamente grandes y son fácilmente accesibles through la cáscara del huevo. Uno puede regresar al embrión para la experimentación adicional (por ejemplo, la eliminación de un cordón ¹⁸ o incluso una barrera) o para comprobar el progreso por la simple eliminación de la ventana de la cinta. No es posible alcance para incluir imágenes en vivo o imágenes de lapso de tiempo. Se describe un método de huevos de gallina de ventanas que es especialmente adecuado para operar con embriones en fase inicial. En el caso de los estudios de las extremidades es muy importante y útil que hay una extremidad contralateral control para cada experimento que sirve como un control interno ideal para cada réplica biológica.

La combinación del uso de barreras impermeables para prevenir desarrollo de la extremidad y los granos empapado en moléculas de señalización no ha sido reportado antes. Nuestro análisis de la expresión de ARNm después de tales intervenciones es también novedosa. Estas técnicas nos han permitido diseccionar el difícil problema de cuando el miembro de transcripción específico factores Tbx5 y Tbx4 se inducen en la LPM y tambiénpara demostrar que más tarde, antes de la iniciación del capullo de las extremidades, la presencia de estos genes TBX en la LPM no es suficiente para la activación de la transcripción Fgf10 y el inicio del crecimiento de yema de la extremidad. Figuras 2G, 2D y 2E ilustran bien estos hallazgos. La ausencia de expresión Tbx4 después de la inserción de una barrera en la etapa 10 en la figura 2G está en marcado contraste con su presencia en 2D y 2E después de la inserción de barrera en la etapa 15, después de la inducción de Tbx4. La implantación de las perlas de la AR empapados facilitó el rescate de iniciación esbozo de la extremidad después de la inserción de barrera y por lo que apunta a la AR de los somitas siendo esencial en la LPM antes consecuencia esbozo del miembro puede comenzar. Tales técnicas podrían usarse para resolver más preguntas en desarrollo de las extremidades, sino también a otras preguntas de la embriogénesis de vertebrados. Las áreas del cerebro, los ojos y el tronco es probable que sean adecuados.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont No. 5 watchmakers forceps, x2	Fine Science Tools  www.finescience.de	11251-20
Dumont No. 4 watchmakers forceps, x2	Fine Science Tools  www.finescience.de	11241-30
Dumont strong forceps, type AA	Fine Science Tools  www.finescience.de	11210-10
Curved scissors with blades 2.5 cm long	Fine Science Tools  www.finescience.de	14061-11
Blunt ended curved forceps, ends approx 0.5 cm long	Fine Science Tools www.finescience.de	11065-07
Steel pin, 0.2 mm wide	Fine Science Tools  www.finescience.de	26002-20
Sharpening stone, square	Fine Science Tools  www.finescience.de	29008-01
Mineral oil
Needle holder	Fine Science Tools  www.finescience.de	26016-12
Clear tape, 50 mm x 66 m	www.5staroffice.com	295985
FGF4 protein			A gift from Cliff Tabin.
all-trans-retinoic acid	Sigma www.sigmaaldrich.com	R2625-50MG	Remember to protect from light.
BMS 493	Sigma www.sigmaaldrich.com	B6688-5MG
Scalpel blade No. 15	www.swann-morton.com	cat no. 0105
Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel	Bio-Rad www.bio-rad.com	153-7301	Beads for delivering protein.
AG1-X2 Ion exchange resin	Bio-Rad www.bio-rad.com	140-1251	Beads for delivering RA or BMS 493.
Incubator for eggs	Memmert www.hce-uk.com	LAB128
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma www.sigmaaldrich.com	P6148-1KG	Harmful, irritant, corrosive.  Handle powder in fumehood with full protective clothing.
Ethanol	Sigma www.sigmaaldrich.com	32221-2.5L
DMEM, high glucose	Gibco www.thermofisher.com	41965-039	500 ml
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific webshop.fishersci.com	D/4121/PB08	500 ml
Binocular Microscope	Leica www.leica-microsystems.com	MZ6	Replaced by M60
Chicken eggs	Henry Stewart & Co Ltd sales@medeggs.com		Brown Eggs