Die Anwendung der undurchlässige Barrieren In Kombination mit Candidate Factor Soaked Beads zu studieren Induktive Signale im Küken

Zusammenfassung

Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

Zusammenfassung

Der Hühnerembryo bietet eine hervorragende wirbelModell, das verwendet werden kann, Entwicklungs-Fragen auf direktem Weg zu sezieren. Die Zugänglichkeit und Robustheit nach einem operativen Eingriff sind wichtige experimentelle Stärken. Mica Platten waren die ersten Barrieren verwendet Küken Gliedmaßenknospe Einleitung ¹ zu verhindern. Protokolle, die Aluminiumfolie als undurchlässige Barriere für Flügel Knospe oder Bein Knospe Induktion und oder Initiierung verwenden beschrieben. Wir kombinieren diese Technik mit Wulst Platzierung seitlich an der Barriere zu Versorgung Kandidaten endogene Faktoren exogen, die durch die Barriere blockiert wurden. Die Ergebnisse werden unter Verwendung von in situ Hybridisierung von nachfolgenden Genexpression analysiert. Unser Schwerpunkt liegt auf der Rolle der Retinsäure-Signalisierung bei der Induktion und später Einleitung des Hühnerembryos nach vorne und hinteren Gliedmaßen. Wir verwenden BMS 493 (ein inverser Agonist von Retinsäure-Rezeptoren (RAR)) getränkten Kügelchen in der Seitenplatte implantiert Mesoderm (LPM) der Wirkung einer Stange zu imitierenRier zwischen den Somiten (Quelle von Retinsäure (RA)) und der LPM platziert, von dem Extremitätenknospen wachsen. Modifizierte Versionen dieser Protokolle könnten auch über den Ursprung und den Zeitpunkt der induktive Signale zu adressieren andere Fragen verwendet werden. Vorausgesetzt, der Bereich des chick embryo ist an dem betreffenden Entwicklungsstadium erreichen könnte eine Barriere zwischen den beiden Geweben und damit Veränderungen in der Entwicklung untersucht platziert werden. Beispiele können in der Entwicklung des Gehirns, Achserweiterung und in der Organentwicklung, wie Leber oder Niere Induktion gefunden werden.

Einleitung

Klassische embryologists traditionell physikalische Verfahren eingesetzt, um die Mechanismen zu steuern Embryonalentwicklung zu befragen. In den 1960er und 1970er Jahren Forscher entwickelten Techniken, die undurchlässige Barrieren zwischen den Geweben des sich entwickelnden Embryo eingeführt verwendet, um die Bedeutung der induktive Signale während der Embryonalentwicklung zu demonstrieren. Unser Interesse ist es in wirbelGliedmaßenEntwicklung und insbesondere, welche Ereignisse Gliedmaßenknospe Auswuchs vorangehen. B. Insertion einer Barriere kann Extremitätenknospe Auswuchs von dem Auftreten auf einer Seite des Hühnerembryos verhindern, während ermöglicht es normalerweise auf der kontralateralen, nicht operierten Seite fortzufahren. Materialien verwendet, um diese Barrieren vielfältig zu machen; beispielsweise Glimmerplatten ¹ und Tantalfolie ^2. Diese Barrieren effektiv trennen die Seitenplatte Mesoderm (LPM), aus dem die Gliedmaßenknospe Formen, von den Somiten vom paraxialen Mesoderms gebildet. Chirurgische Pfropfungstechniken zeigen, dass die enge Verbindung Witzh die Somiten ist wichtig , wenn Gliedmaßenknospe Initiation in der LPM ^{3 4} auftritt. In den 80er und 90er Jahren Entwicklungsbiologen entdeckt diffusionsfähige Signalmoleküle, die bei der Kontrolle der Entwicklungsprozesse wesentlich sind. Perlen getränkt mit dieser Signalmoleküle können in bestimmten Regionen des Embryos implantiert werden und produzieren Veränderungen der embryonalen Entwicklung. Zum Beispiel, aufgenommen Retinsäure (RA) durch Ionenaustauscherkörner wird über einen Zeitraum von 24 Stunden freigesetzt wird, wenn in einem Hühnerembryo implantiert und kann spiegelbildlichen Verdoppelung der Ziffern ⁵ produzieren. Heparin akrylperlen FGF - Protein enthalten , können Gliedmaßenknospe Auswuchs aus dem interlimb LPM ⁶ einzuleiten.

In jüngerer Zeit Maus und Fisch Genetik haben die Untersuchung der wirbel Extremität Einleitung in eine neue Ära ( zusammengefasst in ⁷⁾ entnommen. Es gibt gute Hinweise, dass RA, die in den vorherigen Somiten zu Gliedmaßenknospe Initiation ist das wesentliche diffusionsfähig Signal von der LP erforderlichM Glied Austrieb zu initiieren. Wir wollten die Zugänglichkeit und experimentelle Robustheit des Hühnerembryos zu nutzen, um die Wirkung der Barriere Implantation auf die Genexpression in der LPM um die Zeit der Extremitätenknospe Einleitung zu sezieren. Eine neuartige Anpassung unserer Methode ist, eine Barriere, die Blöcke Signale von axialen Gewebe mit Wulst Platzierung seitlich an der Barriere zu exogen Versorgung Kandidaten endogene Faktoren zu kombinieren, die durch die Barriere blockiert wurden. Die folgenden Protokolle sind diejenigen entwickelt, um die Mechanismen der Extremitätenknospe Induktion und Einleitung herauszukitzeln.

Gliedmaßenknospe Einleitung Studieren bedeutet frühen Stadium Embryonen. Viele Forscher Fenster Hühnereier, indem zuerst mit einer Injektionsnadel etwas von dem Albumin durch den Luftsack zu entfernen. Der Embryo, die auf der Oberseite des Dotters liegt, liegt dann tiefer in das Ei. Dies ist ein Vorteil für einige Techniken, wie Elektroporation, kann jedoch ein Nachteil, wenn chirurgische Manipulation des Embryos sein, erwünscht ist.Wir finden, die den Embryo als nahe der Öffnung in dem Ei wie möglich ein Vorteil ist.

Fragen bleiben die Signale in Bezug auf die wirbelGliedmaßenKnospe Induktion und die Einleitung und die folgenden Protokolle sind geeignet zu steuern, um zu adressieren. Wir sind das erste , ein Protokoll für die Einführung von Barrieren zu entwickeln Küken Gliedmaßenknospe Auswuchs in einem Stadium , früher als Bühne zu verhindern 12 ^8. Modifizierte Versionen dieser Protokolle könnten auch über den Ursprung und den Zeitpunkt der induktive Signale zu adressieren andere Fragen verwendet werden, wo eine leicht zugängliche Induzierung Gewebe liegt angrenzend an das primordium induziert wird. Vorausgesetzt, der Bereich des Embryos in der entsprechenden Entwicklungsstadium zugänglich ist, dann kann eine Barriere zwischen den beiden Geweben und damit Veränderungen in der Entwicklung untersucht platziert werden. Beispiele sind in der Entwicklung des Gehirns, Achserweiterung und möglicherweise Organentwicklung wie Leber oder Niere Induktion gefunden werden.

Protokoll

Das folgende Protokoll verwendet Hühnerembryonen in weniger als zehn Tagen Inkubation. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit Kings College London, Großbritannien und den britischen Home Office Tierpflege-Richtlinien durchgeführt.

1. Vorbereitung Erforderliche Vor Embryo Betrieb zu Chick

1. Sammeln Sie die folgenden chirurgischen Instrumenten für die Operationen erforderlich, für die Ernte und zur Fixierung der Hühnerembryonen: Zwei Paare von No. 5 Uhrmachern Zange, ein Paar starke Zange, zB Typ AA, gebogene Scheren mit einer Klingen 2,5 cm lang, mit glatten Enden gebogen mit Enden Zange ca. 0,5 cm lang, und auch zwei Paare von No. 4 Uhrmachern Zange zu verwenden, während Folie Barrieren machen (1.6.3).
2. Machen Sie ein Mikro Messer aus einem Stahlstift (0,3 mm Durchmesser) geschärft auf einem Schleifstein mit Öl. Mit einem Binokular, schärfen die Spitze des Stiftes zu einer flachen Klinge. Legen Sie den Stift in einem Nadelhalter und schützen seine scharfe Ende von geklopft und dented.
   HINWEIS: Die Schalungs das Messer mit einem 1000 ul Pipettenspitze ist eine einfache Möglichkeit dafür.
3. Bereiten Sie 70% Ethanol in einer Plastikwaschflasche. Verwenden Sie einen Spritzer diese auf einem Papiertuch die chirurgischen Instrumente und das Mikro Messer wischen vor und nach dem Gebrauch zu sterilisieren und reinigen.
4. Kaufen 5 cm breit klar Klebeband und einen geeigneten Spender. Finden oder einen Rest geeignet produzieren ein Hühnerei stetig auf seiner Seite zu halten.
5. Machen Sie und speichern Lösungen zum Einweichen Perlen.
   1. Bereiten Sie eine 0,35 mg / ml-Lösung von Fibroblasten-Wachstumsfaktor 4 (FGF4) Protein von 1 mg / ml eingefroren Lager indem sie sie mit Wasser und bei -20 ° C in 30 ul Aliquots verdünnt wird.
   2. Bereiten Sie Lösungen (entweder 0,05 oder 0,1 mg / ml) von all-trans-Retinsäure (RA), verdünnt mit Dimethylsulfoxid (DMSO) in dunklen Mikrozentrifugenröhrchen aus einer 5 mg / ml Lager. Lagern Sie die Lager und 100 ul Aliquots bei -20 ° C.
   3. Werden die Lösungen (entweder 2,5 oder 5 mg / ml) von BMS 493 (ein inverser agonist von RARs) in dunklen Mikrozentrifugenröhrchen mit DMSO verdünnt aus einer 10 mg / ml auf Lager. Lagern Sie die Lager und 100 ul Aliquots bei -20 ° C.
6. Machen Sie Barrieren aus Aluminiumfolie.
   HINWEIS: Die Folie verwendet, um die Barrieren zu machen ist Standard Catering-Folie (gemessen durch Mikrometer als 0,013 mm dick). Jede inländische Aluminiumfolie würde wahrscheinlich geeignet sein.
   1. Schneiden Sie ein 1 cm im Quadrat Stück Aluminiumfolie und zu sterilisieren, indem sie es mit 70% Ethanol auf einem Gewebe abwischen. Legen Sie es auf eine 6 cm sterile Petrischale aus Kunststoff. Entsorgen Sie den Deckel ab und machen einen Deckel für die Schale aus Folie.
      HINWEIS: Dadurch werden die Schnitt Barrieren aus später das Festhalten an dem Kunststoff Deckel der Schale aufgrund statischer verhindern.
   2. Legen Sie die Petrischale auf einer Bühne graticule (1 cm lang aufgeteilt in 100 Abschnitte) unter dem Binokular mit Vergrößerung auf 1,6X. Verwendung einer Klinge No.15 kleinen Skalpell geschnitten Streifen der Folie auf eine exakte Breite, beispielsweise 0,7 mm oder 1,3 mm.
   3. Trennen Sie die FolieStreifen zwei Paar No. 4 Uhrmachern Pinzette. Dann machen Sie ein rechtwinkliges Biegung in der Mitte der Folienbarriere, so dass es ein Scharnier der spezifischen Breite ähnelt.
      HINWEIS: Diese Form der Barriere von ^{9, 10} aufgenommen wird. Eine schwenkbare Sperre bleibt an seinem Platz besser als eine gerade, flache Barriere. No. 4 Zange sind relativ stumpf und verwendet werden, da sie weniger wahrscheinlich Dellen oder Noten in den Folien Barrieren zu machen.
   4. Richten Sie die Barrieren in der Mitte der Petrischale mit einer Seite flach an der Schale und die andere aus der Schale nach oben zeigt, Bewegen der verbleibenden ungeschnittenen Folie auf einer Seite. Es werden 20 oder mehr Barrieren vor der Operation Tag. Legen Sie die Foliendeckel über die Schüssel und speichern Sie die Barrieren in einem Ort, wo sie nicht gestört werden.
      HINWEIS: Auch ein leichter Schlag kann die Barrieren umkippen oder bedeuten, dass sie mit statischen halten Sie sich an den Seiten der Schüssel.
7. Inkubieren befruchtete Hühnereier auf ihren Seiten auf Karton Eierschalen bei 38 °C für die entsprechende Zeitdauer vor dem Betrieb Tag so daß die Embryonen in der gewünschten ⁸ der Bühne.

2. Herstellung von Hühnerembryonen und Perlen zum Betrieb Day

1. 'Fenster' bebrüteten Hühnereiern.
   HINWEIS: Die folgende Methode für Eier Eröffnung wurde von Dennis Summer weitergegeben (wird nicht veröffentlicht).
   1. Mit dem Ei auf der Seite liegend, durchdringen das stumpfe Ende (Luftsack Ende) des Ei mit Typ AA starke Zange dafür sorgen, dass die Innenschale Membran gebrochen wurde. Um dies zu tun Griff fest zusammen die Zange und die Verwendung einer gesteuerten Messerstecherei Bewegung während das Ei mit der freien Hand.
   2. Nehmen Sie das Ei, immer noch auf der Seite liegend, in beiden Händen (eine auf jeder Seite) drehen um 180 ° entlang der horizontalen Achse und ersetzen Sie es in der Eierschale, so dass die Seite, die oberste war nun neben dem Fach befindet.
      HINWEIS: Dies ist der Embryo aus den Schalenmembranen lockert und bedeutet, dass der Embryo less wahrscheinlich geschnitten werden, wenn die Schale über dem Embryo entfernt wird.
   3. Nehmen Sie ein Stück durchsichtigem Klebeband ca. 5 cm im Quadrat und halten diese dicht über der obersten Oberfläche des Eies aus der Eischale zu stoppen auf den Embryo bröckelt, wenn das Ei geöffnet wird.
   4. Verwenden Sie die gebogene Schere sanft zu brechen durch die Schale und die Membranen in der Mitte des obersten Teils des Eies, machen ein sehr kleines Loch mit einer Klinge der Schere, so dass Luft in das Ei über den Embryo eingeben (die knapp liegt der oberste Teil der Hülle).
      HINWEIS: nur die Schalenmembranen brechen und keine der Membranen brechen für den Embryo, Luft das Ei eingeben, wird der Embryo aus der Schale zu trennen und der Embryo zur Ruhe auf dem Dotter kommen etwa 0,5-1 cm von der Schale .
   5. Verwenden Sie die gebogenen Schere, um das Loch in der Schale mit einem Durchmesser von etwa 1 cm zu einem Kreis zu vergrößern. Entfernen Sie das Stück ausgeschnittenen Shell und decken Sie das Loch im Ei mit einemStück durchsichtigem Klebeband ca. 5 cm im Quadrat. Um leicht dieses Band zu entfernen, drücken Sie das Band dabei bleiben nur an der Lippe des Lochs, so dass die verbleibenden Bandfrei. Das freie Band kann dann ergriffen werden, um das Ei zu entsiegeln.
2. Bühnen Embryonen
   1. Nach der Inkubation bei 38 ° C (siehe Schritt 1.7) und Windowing (Schritt 2.1), verwenden Sie ein Binokular die Hühnerembryonen nach ⁸ zu inszenieren. Tun Sie dies, kurz bevor die Eier folgenden Windowing versiegelt werden. Schreiben Sie die Stufe von jedem Embryo auf der Eierschale. Bringen Sie die Eier in den Inkubator.
      HINWEIS: Die Embryos in den Stufen zwischen 8 und 15 sind geeignet für Sperr- und bead Experimenten. Embryos sind eher zu überleben, wenn sie nicht zu lange vor dem Betrieb aus dem Inkubator gelassen wurden.
3. Das Einweichen Perlen vor dem Betrieb.
   1. FGF4
      1. Nehmen Sie die Anzahl der Affinitätschromatographie Gelkügelchen (150-300 & mgr; m), die mit dem Ende einer 1000 ul Pipettenspitze halten und warh sie in 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) in einem Mikrozentrifugenröhrchen zu entfernen, das Azid in sie gespeichert sind. Zentrifuge für 5 sec, die PBS verwerfen und das Verfahren zweimal wiederholt.
      2. Einweichen der Gelkügelchen in einem 30 ul Tropfen von 0,35 mg / ml FGF4 Protein auf eine sterile Petrischale auf Eis für 30 min. Pick beads etwa 150 & mgr; m im Durchmesser mit No. 5 microforceps zur Einführung in den Embryo.
         Hinweis: Behandeln Sie Ionenaustauscherharzkügelchen verwendet in den folgenden Schritten mit No. 5 microforceps und greifen sie sehr sanft, da die Perlen sind spröde und zerbrechen kann, wenn zu fest zusammengedrückt. Diese Warnung gilt für 2.3.2-2.3.3 und alle Harzperle Operationen.
   2. RA
      1. Auftauen ein Aliquot von 0,05 oder 0,1 mg / ml all-trans-RA mit DMSO verdünnt und legen eine 100 & mgr; l Tropfen auf eine sterile Petrischale (9 cm Durchmesser), die zuvor in Folie abgedeckt wurde, um die RA vor Licht zu schützen. Nehmen Sie eine 10 ul Pipettenspitze und holen einige Chloridform IonenaustauschHarzkügelchen an ihrem Ende und vor Licht für 20 min bei Raumtemperatur geschützt diese in der RA Tropfen einweichen.
      2. Spülen der Kügelchen in drei aufeinanderfolgenden Tropfen von 100 & mgr; l Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), die auf der gleichen Petrischale mindestens 1 cm auseinander.
         HINWEIS: Die Perlen des Phenol roten Farbstoff aus dem DMEM aufzunehmen. Dieses Verfahren basiert auf ^5.
      3. Pick-Perlen ca. 100 & mgr; m im Durchmesser (Kügelchen liegen in der Größenordnung von 75 bis 180 & mgr; m, wenn sie nass) zum Einsetzen in den Embryo, ein Mikroskoptisch graticule Objektträger unter den Petrischale und No.5 microforceps mit den Perlen zu halten. Bei der Kommissionierung der Wulst aus dem 100 & mgr; l Tropfen DMEM, erster Stelle der Wulst nach unten auf die Petrischale und entfernen sie alle verbleibenden DMEM entweder durch den Wulst aus dem Drop-Schieben oder durch die geschlossene Zange neben dem Wulst (Kapillare platzieren Aktion zieht die Flüssigkeit von der Perle).
   3. BMS 493
      1. Wie für die RA (2.3.2), tränken Ion Exchange-Harzperlen in einem 100 & mgr; l Tropfen von 2,5 oder 5,0 mg / ml BMS 493 in DMSO bei Raumtemperatur für 20 min, dann gründlich in 100 & mgr; l Tropfen DMEM. Pick Perlen ungefähr 100 & mgr; m im Durchmesser für die Einführung in den Embryo.
   4. DMSO-Kontrolle
      1. Wie bei der RA (2.3.2), Ionenaustauschharzperlen in einem 100 & mgr; l Tropfen DMSO bei Raumtemperatur für 20 min, dann gründlich in 100 & mgr; l Tropfen DMEM einweichen. Pick Perlen ungefähr 100 & mgr; m im Durchmesser für die Einführung in den Embryo.

3. Barrier und Bead Operationen

Abbildung 1. Schema von Hühnerembryonen von verschiedenen Stadien zeigt , wo Barrieren und oder Perlen platziert werden soll. (A) Stufe 13 Hühnerembryo schematische Darstellung Sperrposition (grüne Linie) zwischen Somiten und LPM am presumptive Flügel Ebene (Somiten 15-20). (B) Das gleiche Schema wie in (A), die anzeigt , wo RA Wulst (roter Kreis) sollte vor der Barriere Einsetzen angeordnet werden. (C) schematische Darstellung Sperrposition (grüne Linie) an der vermutlichen Bein Ebene (Somiten 26-32) in einer Stufe 15 Embryo. (D) Das gleiche Schema wie in (C), die angibt , wo ein RA Wulst (roter Kreis) platziert werden soll. (E) Schematische anzeigt , wo BMS 493 Perlen (lila Kreise) sollte in der LPM einer Stufe 15 Embryo platziert werden. (F) Schematische Darstellung einer Stufe 9 Hühnerembryo - Anzeigesperrposition (grüne Linie) zwischen präsomitischen Mesoderm und LPM am vermutlichen Flügel Ebene. (G) Schematische Darstellung einer Stufe 9 Embryo zeigt die Positionen einer Barriere (grüne Linie) und RA Wulst (roter Kreis). (H) Schematische Darstellung einer Stufe 10 Hühnerembryo zeigen Barriere Position (grüne Linie) an der vermutlichen Bein Ebene. (I ) Schematische Darstellung zeigt BMS 493 Wulstposition (lila Kreis) in der Stufe 10 Bein Ebene LPM. Diese Zahl wurde von ⁷ modifiziert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

1. Barrier bei Stufe 13 eingeführt Flügel Knospe Einleitung zu verhindern.
   1. Nehmen Sie eine Stufe 13 Embryo aus dem Inkubator und legen Sie das Ei auf einem Ei Rest unter dem Binokular auf 3,2x Vergrößerung und höher, wenn bevorzugt. Entfernen Sie die obere Schicht aus durchsichtigem Klebeband.
      1. Verwendung eines Stahlmikromesser, bilden einen Einschnitt durch die Dotterhaut und lateralen Mesoderm (LPM) benachbart Somiten 15 bis 20 (1A) auf der rechten Seite des Embryos (Somiten nicht alle in dieser Phase gebildet wird ). Schneiden Sie neben den letzten vier gebildeten Somiten und weiterhin die Schnitt zwei somite Längen kaudal.
      2. Pick-up die Barriere (0,7-1 mm breit) mit No. 5 microforceps am Ende aus der Petrischale vorsteht und die Hand verdrehen, das freie Ende der Barriere in den Einschnitt einzufügen. Das Scharnier förmige Barriere liegt flach auf der Vitellinmembran über dem LPM mit der Hälfte nach unten durch den Einschnitt distal zu den Somiten vorsteht. So bald wie möglich abzudichten das Ei mit durchsichtigem Klebeband und es in den Inkubator zurück.
         HINWEIS: Die Mikro Messer und Pinzetten werden klebrig bei Berührung mit der Dottermembran. Es ist wichtig, dass sie sauber und mit 70% Ethanol zu wischen, bevor eine nachfolgende Operation versucht. Dies gilt für alle nachfolgenden Betrieb Beschreibungen und Implantationen zu Wulst.
      3. Wenn ein Wulst mit einer Barriere in Verbindung eingefügt zu werden; die Sicke in No. 5 microforceps nehmen zum einen und in die Schnittfläche des LPM auf der distalen Seite des Einschnitts einzufügen und dann die Barriere in den Einschnitt proximal zu dem Wulst (1B) ein. Dichten Sie das Ei und senden Sie es sofort in den Inkubator.
2. Barrier bei Stufe 15 eingeführt Bein Knospe Einleitung zu verhindern.
   HINWEIS: Ein Beispiel für das Ergebnis dieser Operation auf Tbox 4 - Transkriptionsfaktor (TBX4) Expression in 2D und 2E gezeigt.
   1. Nehmen Sie eine Stufe 15 Embryo aus dem Inkubator und legen Sie das Ei auf einem Ei Rest unter dem Binokular auf 3,2x Vergrößerung und höher, wenn bevorzugt. Entfernen Sie die obere Schicht aus durchsichtigem Klebeband.
      1. Eine Stahlmikro Messer einen Schnitt durch die Dotterhaut und LPM benachbart Somiten 26 bis 32 (1C) auf der rechten Seite des Embryos unter Verwendung machen (Somiten nicht alle in dieser Phase gebildet wird ). Schneiden angrenzend an den letzten beiden gebildeten Somiten und weiterhin die geschnittenen fünf Somiten Längen kaudal.
      2. Pick-up die Barriere (1,2-1,3 mm breit) mit No. 5 microforceps an einem Ende und drehen Sie die Barriere, die das freie Ende in den Einschnitt einzufügen. So bald wie möglich abzudichten das Ei mit durchsichtigem Klebeband ein bisnd Rückkehr es in den Inkubator.
         HINWEIS: Das Scharnier förmige Barriere liegt flach auf der Vitellinmembran über dem LPM mit der Hälfte davon abstehenden nach unten durch den Einschnitt distal zu den Somiten.
      3. Wenn eine Sicke in Verbindung mit einer Barriere eingesetzt werden soll, zum einen, um die Wulst in No. 5 microforceps und in die Schnittfläche des LPM auf der distalen Seite des Einschnitts einzufügen und dann die Barriere in den Einschnitt proximal zu stecken der Wulst (Figur 1D). Dichten Sie das Ei und senden Sie es sofort in den Inkubator.
      4. Wenn eine Perle oder Perlen ohne Barriere eingesetzt werden sollen, zB BMS 493 Perlen Beinbereich in der Stufe 15 nicht den langen Schnitt machen (3.2.2.1). Machen Sie einen kleinen Schnitt durch die Dotterhaut und in die LPM an der Position der Wulst angeordnet werden soll. Nehmen Sie die Perle in No. 5 microforceps und es in das Loch in der LPM einfügen. Schieben es in einem etwas weiter mit den geschlossenen Enden der Zange (Figur 1E).
3. Barrier in der Stufe 9 eingeführt, um Flügel Knospe Induktion und Initiierung verhindern.
   1. Nehmen Sie eine Stufe 8 oder 9 Embryo aus dem Inkubator und legen Sie das Ei auf einem Ei Rest unter dem Binokular auf 3,2x Vergrößerung und höher, wenn bevorzugt.
      1. Mit Hilfe eines Stahlmikro Messer einen Schnitt durch die Vitellinmembran und LPM laterale und rostral des Primitivstreifens, am kaudalen Ende des Embryos im Einklang mit den Somiten (1F) etwa 5 somite Längen lang.
      2. Pick-up die Barriere (0,7-1 mm breit) mit No. 5 microforceps am Ende aus der Petrischale vorsteht und drehen Sie die Hand zu führen Sie das freie Ende der Barriere in den Einschnitt. So bald wie möglich abzudichten das Ei mit durchsichtigem Klebeband und es in den Inkubator zurück.
         HINWEIS: Das Scharnier förmige Barriere liegt flach auf der Vitellinmembran über dem LPM mit der Hälfte nach unten durch den Einschnitt vorsteht.
      3. Wenn eine Perle ist inserte seind in Verbindung mit einer Sperre; die Sicke in No. 5 microforceps nehmen zum einen und in die Schnittfläche des LPM auf der distalen Seite des Einschnitts einzufügen und dann die Barriere in den Einschnitt proximal zu dem Wulst (Figur 1G) einzufügen. Dichten Sie das Ei und senden Sie es sofort in den Inkubator.
4. Barrier bei Stufe 10 eingeführt Bein Knospe Induktion und Initiierung zu verhindern.
   HINWEIS: Ein Beispiel für das Ergebnis dieser Operation auf TBX4 Expression in 2G gezeigt ist .
   1. Nehmen Sie eine Stufe 10 Embryo aus dem Inkubator und legen Sie das Ei auf einem Ei Rest unter dem Binokular auf 3,2x Vergrößerung und höher, wenn bevorzugt.
      1. Mit einem Stahlmikro Messer einen Schnitt durch die Vitellinmembran machen und LPM lateral des Primitivstreifens, am kaudalen Ende des Embryos im Einklang mit den Somiten (Abbildung 1 H) ca. 6 somite Längen lang.
      2. Pick-up die Barriere (1.2mm breit) mit No. 5 microforceps am Ende aus der Petrischale vorsteht und die Hand verdrehen, das freie Ende der Barriere in den Einschnitt einzufügen. So bald wie möglich abzudichten das Ei mit durchsichtigem Klebeband und es in den Inkubator zurück.
         HINWEIS: Das Scharnier förmige Barriere liegt flach auf der Vitellinmembran über dem LPM mit der Hälfte nach unten durch den Einschnitt vorsteht.
      3. Wenn ein Wulst ohne Barriere eingesetzt werden soll, beispielsweise BMS 493 Wulst zum Schenkelbereich an der Stufe 10, stellen einen kleinen Einschnitt durch die Dotterhaut und in die LPM an der Position platziert werden der Wulst ist. Nehmen Sie die Perle in No. 5 microforceps und es in das Loch in der LPM einfügen. Schieben Sie es in ein wenig weiter mit den geschlossenen Enden der Zange (1I).
5. 24 Stunden oder mehr nach dem Vergleich mit dem aufstrebenden kontralateralen Extremitätenknospe überprüfen Sie die Position der Barriere arbeitet. Entsorgen Sie alle Embryonen, bei denen die Barriere deutlich ist nicht opposite der linken Extremitätenknospe. In diesem Fall wurde die Barriere falsch positioniert.

4. Ernten Embryonen, Fixierung und Vorbereitung für Wholemount In - situ - Hybridisierung (WISH)

1. Ernte Embryonen nach der Operation.
   1. Ernte Embryonen im Stadium 19-23, so dass Gliedmaßenknospe Morphologie ist deutlich sichtbar in beiden betrieben und Gegensteuer Seiten.
      1. Mit einer gebogenen Schere geschnitten, um ein größeres Loch in der Eierschale. Cut um den Embryo während die große Blutgefäß, das mit microforceps des Embryos nach links zu halten. Verwenden Sie diesen Griff des Schiffes, den Embryo zu entfernen und legen Sie sie in einer Petrischale von phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,3.
      2. Unter dem Binokular, sezieren entfernt zusätzliche embryonale Gefäße und Membranen, die eine Kombination aus gebogenen Schere und nein. 5 microforceps. Entfernen Sie den Kopf mit der Schere.
2. Die Fixierung von Embryonen Post Ernte.
   1. Mit gekrümmten blunt Zange, heben Sie den Embryo und legen Sie es in 5 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS bei Raumtemperatur für zwei Stunden rocken und dann bei 4 ° C über Nacht in einem 20 ml-Glasflasche mit Schraubverschluss.
      Achtung: PFA ist eine ernste Gefahr für die Gesundheit. Es ist ein gesundheitsschädlich, ätzend reizend und das Pulver muss in Berührung kommen mit der Haut, Augen und Lungen verhindert werden. Persönliche Schutzkleidung verwenden und eine Abzugshaube während der Herstellung der Lösung. Sobald es eine 4% ige Lösung, Handschuhe ist, eine Schutzbrille und einen Laborkittel zu tragen.
      HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Embryonen in Verlegenheit schnell zu bekommen, um beste mRNA Integrität bewahren.
3. Zur Beseitigung von Hindernissen vor In - situ - Hybridisierung an Wholemount.
   HINWEIS: Barrieren entfernt werden , weil sie scharf sind und Embryonen schädigen , wenn sie durch die gehen in - situ - Hybridisierung Protokoll, vor allem , wenn mehrere Embryonen auf einmal gefärbt sind.
   1. Nach der Fixierung, stellen Sie den Embryo in eine Schüssel mit PBS unter einem Binokular mikop.
   2. Die Verwendung von zwei Paaren von No. 5 microforceps, legen Sie das linke Paar eng auf beiden Seiten der Barriere in der operierten Seite des Embryos. Fassen Sie die Sperre mit dem rechten Paar und sanft die Barriere aus dem Embryo ziehen Sie das linke Paar mit dem Embryo zu halten und jedes Gewebe zu verhindern, dass die Barriere von anhaftenden, wie es entfernt wird.
4. Führen wollen im Wesentlichen wie in ¹¹ beschrieben.

Ergebnisse

Das Protokoll detailliert beschreibt über die in Nishimoto et al angewandten Methoden. 2015. Das Papier untersucht Gliedmaßenknospe Induktion und Initiierung sowohl in der vorderen und hinteren Gliedmaßen des Hühnerembryos. Folgende Ergebnisse der Einführung von undurchlässige Barrieren das Auswachsen der forelimb Knospe zu verhindern , wurden bisher ^{1, 2,} veröffentlicht ⁹ , aber es hat nur eine Studie beschreibt Barrieren verhindern Bein Knospe Einleitung ¹ gewesen. Hindlimb Daten von Nishimoto et al. Werden 2015 hier als repräsentative Ergebnisse der Studie von mRNA-Expression nach Schranke Insertion.

TBX4 Expression in der LPM ist nicht ausreichend hindlimb Auswuchs zu initiieren:
Die 2B und C (Tabelle 2) zeigen , dass die Barriere Einfügung in der Stufe 15 (2A) (siehe Protokoll 3.2) führt sowohl zu FGF10und Fgf8 Expression , während es in der Beinknospe Region fehlt (bezeichnet mit Halterung) auf der operierten rechten Seite. Vergleichen Sie mit dem nicht operierten linken Seite. Jedoch ist TBX4 Ausdruck sowohl auf Stufe 19 und Stufe 23 auf der operierten Seite (2D und E) beobachtet. Wir schließen , dass TBX4 Expression allein nicht ausreicht, hindlimb Auswuchs aus dem LPM einzuleiten. Andere Studien im Küken haben vorgeschlagen , dass Tbx Genexpression ausreichend ist forelimb Knospenbildung ^{12, 13} zu initiieren.

2C 'ist eingeschlossen , um darzustellen , wie eine Barriere im Beinbereich des Embryos Post Fixierung eingebettet sieht. In der Mehrzahl der Fälle Barrieren wurden vor der in situ - Hybridisierung (Protokoll 4.3) entfernt werden .

RA aus den Somiten Is Essential in der LPM vor FGF10 induziert Gliedmaßenknospe Outgrowth:
3A ist eine schematische Darstellung der Zugabe eines RA getränkte bead distal Barriere bei Stufe 15 eingeführt (protocol 3.2.1.3). Im Anschluss an diesen Vorgang Extremitätenknospe Auswuchs (mit einem Stern bezeichnet) auf der operierten rechten Seite beobachtet wird und TBX4, FGF10 und Fgf8 im Keim ausgedrückt werden , wie sie in der Kontrolle der linken Seite (3B, C und D, Tabelle 2) sind . So Zugabe von RA zu dem LPM überwindet die Wirkung der Barriere und Gliedmaßenknospe Einleitung voranschreitet. Wir schließen daraus, dass in der normalen Entwicklung RA von der Somiten im LPM wesentlich ist vor Auswuchs Gliedmaßenknospe eingeleitet werden kann. Die resultierenden hindlimb Knospen sind im Allgemeinen kleiner als die auf der Steuerseite. Dies kann in der LPM ist nicht auf die Wildtyp-Situation entspricht der RA Dosis fällig. Wenn die RA-Dosis zu hoch ist, kann die Apikale Ectodermal Ridge (VRE) verkürzt werden und kleinere Knospen würde^{14, 15.}

Um diese RA bestätigen (aus den Somiten) in der LPM ist für den normalen Gliedmaßenknospe Initiierung erforderlich ein inverser Agonist von RAR, BMS 493, verwendet wurde. Perlen sind in den Beinbereich LPM im Stadium implantiert 15 (siehe Protokoll 3.2.1.4) (Abbildung 3E). FGF10 - Expression wird nach Anwendung von BMS 493 Kügelchen in der LPM, was zu kleineren hindlimb Knospen Vergleich zu der Kontrollseite (; Tabelle 3 3F) herunterreguliert. Kontrolle DMSO Perlen verursachen nicht diese Mängel (Figuren 3G und 3H; Tabelle 3). Die Defekte folgende BMS 493 Anwendung beobachtet wurden, sind milder als die durch eine Barriere Betrieb induziert wird; dh, FGF10 noch ausgedrückt und Extremitätenknospen gebildet werden. Dies ist wahrscheinlich, weil die Auswirkungen von BMS 493 um die Wülste lokal begrenzt sind und nicht in der Lage sein, all die RA von axi hergestellt antagonisierenal Geweben.

Frühe Axial Signale der LPM Zellen an , die später TBX4 Express:
Wir testeten , wenn der LPM seine Fähigkeit erwirbt TBX4 in der prospektiven Bein Bildungsregion zum Ausdruck bringen. Die früheste Stadium, in dem eine Barriere eingesetzt werden kann, die anschließend Bein Knospe Auswuchs blockieren, ist Stufe 10. Wir sind das erste ein Protokoll einfügen Barrieren in den Stadien früher als Stufe 12 Barrieren zwischen dem paraxialen Mesoderm und dem vermutlichen Bein eingefügt zu entwickeln LPM bei Stufe 10 (siehe Protokoll 3.4) block Beinknospenbildung und die Expression von TBX4 im Bein bildenden LPM (Figuren 2F und 2G, Tabelle 2), was darauf hindeutet , dass ein Signal von der axialen Gewebe in der Stufe 10 für die spätere Expression erforderlich ist , TBX4 in hindlimb LPM. Vergleichen Sie dieses Ergebnis mit den Figuren 2D und E , wo später Barriere Einfügen TBX4 Ausdruck erlaubtsich etablieren. Darüber hinaus haben wir getestet , ob diese axiale Signal RA könnte durch Beobachten , ob der inversen Agonisten von RAR TBX4 Ausdruck reduziert. Ein BMS 493 Perle in der hinteren Gliedmaßen LPM in der Stufe 10 angeordnet (siehe Protokoll 3.4.1.3) downregulates TBX4 Ausdruck (Figuren 2H und 2I), während die Kontrollkügelchen in DMSO getränkt haben keinen Einfluss auf TBX4 Ausdruck (Figuren 2J und 2K). Gemeinsam unterstützen diese Ergebnisse ein Modell , das ein RA - Signal von der axialen Gewebe durch positiv regulieren TBX4 in der hinteren Gliedmaßen LPM ⁷ Glied Induktion reguliert.

Post-operative Tod:
Die Tabellen 1, 2 und 3 geben Details der experimentellen Ergebnisse , einschließlich der Anzahl von Hühnerembryonen , die nach der Operation starb und vor der Ernte. Einige Todesfälle sind zu erwarten, nachdem die Mikro dieser Art. Die Zahlen Sterben kann gehalten werden auf ein Minimum, indem sichergestellt wird, dass die Instrumente sauber sind, ist das Loch im Ei die Mindestgröße erforderlich, dass die Embryonen ohne den Schutz des Klebebands Dichtung für ein Minimum an Zeit und in Verbindung mit diesem letzten Punkt gelassen werden, dass der Betrieb wird so schnell wie möglich durchgeführt. Keiner dieser Vorgänge sind sehr zeitaufwendig, sondern Operationen Perlen und Barrieren nehmen Sie ein wenig mehr Zeit, beteiligt sind. Trotz dieser Maßnahmen sind Interventionen in den frühesten Stadien und die im Flügelbereich sind eher in den Tod zur Folge haben. Es gibt große Blutgefäße rund um die Schenkel bildenden Bereiche und der zufälligen Bruch dieser Schiffe zu Tod durch Blutverlust führen kann. Wir finden, dass Eier in der Stufe 8 oder 9 geöffnet, deren Embryonen wurden am nächsten Tag nicht operiert, wird oft sterben. Daher ist die einzige Lösung für diese Probleme eine hohe Anzahl an Experimenten durchzuführen.

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Änderungen Abbildung 2. Marker Genexpression nach Barrier oder Wulsteindrücken bei Präsumptive Leg Ebene. (A) schematische Darstellung Sperrposition (grüne Linie) an den vermutlichen Bein Ebene (Somiten 26-32) in einer Stufe 15 Embryo. (B - E und G) WISH Analyse operierten Embryonen. Der Schenkelbereich skizziert (Klammern). (B) FGF10 - Expression ist in der betätigten LPM abwesend, aber robust Ausdruck wird in der linken bud detektiert. (C) Fgf8 Ausdruck ist in der operierten Seite nicht vorhanden, was darauf hindeutet , gibt es keine AER. (C ') Das gleiche Embryo vor der Barriere entfernt wurde. (D) TBX4 in der LPM in der gleichen rostro-Schwanz- Ebene als Steuer Knospe ausgedrückt. (E) TBX4 Ausdruck wird in der rechten Beinbereich trotz Abwesenheit Extremität Wachstum aufrechterhalten. (F) Schematische Darstellung einer Stufe 10 Hühnerembryo zeigen Barriere Position (grüne Linie) an der vermutlichen Bein Ebene. (G) TBX4 Ausdruck ist in der operierten rechten LPM (Halterung) fehlen. (H) Schematische Darstellung einer Stufe 10 Hühnerembryo zeigt BMS 493 Wulstposition (lila Kreis) an der vermutlichen Bein Ebene. (I) TBX4 Ausdruck wird auf der operierten rechten Seite nach der Behandlung downregulated mit BMS 493. (J) Schematische Darstellung einer Stufe 10 Hühnerembryo zeigt Kontrolle DMSO Wulstposition (grauer Kreis). (K) TBX4 wird auf einem ähnlichen Niveau auf der operierten rechten Seite zum Ausdruck gebracht , die der Kontrolle der linken Seite nach der Behandlung mit allein DMSO. Diese Zahl wurde von ⁷ modifiziert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 3. RA Rettungen Gliedmaßenknospe Abwesenheit verursacht durch Barrier Insertion und ist wesentlich im LPM Vor Leg Bud Auswuchs. (A) Schematische Darstellung zeigt Sperrposition (grüne Linie) an der vermutlichen Bein Ebene (Somiten 26-32) und einer RA-getränkten Wulst (roter Kreis). (B - D) RA Rettungen Bein Knospe Auswuchs (durch ein Sternchen dargestellt). (B) TBX4 Ausdruck ist in der geretteten Bein Knospe ähnlich der un-operierten Seite. (C) FGF10 ist in der geretteten Bein ausgedrückt Knospe ähnlich der un-operierten Seite. (D) Fgf8 ist in der AER des geretteten rechten Bein Knospe zum Ausdruck gebracht. (E) Schematische anzeigt , wo BMS 493 Perlen (lila Kreise) in der vermutlichen Bein LPM von 15 Embryonen Bühne platziert wurden. (F) FGF10 Ausdruck wird auf der operierten rechten Seite nach unten reguliert und die Beinknospe ist klein folgende BMS 493 Behandlung. Perlen sind mit Sternchen gekennzeichneten. (G) Ähnliche Schaltplan (E), die die Position Kontrolle DMSO - Perlen (graue Kreise). (H) DMSO - Kügelchen (durch Sternchen dargestellt) hatte keinen Einfluss auf FGF10 Ausdruck oder Bein Knospe Größe. Diese Zahl wurde von ⁷ modifiziert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Bühnen Barriere platziert (+ Perle) *	Anzahl betrieben	Flügel fehlt **	Flügel vorhanden **	Anzahl tot
Stufe 12-14	40	24	1	15
Stufe 8/9	65	23	0	42
Stufe 12-13 (FGF4 Wulst)	41	7 (Perle fehlt)	17	17
Stufe 12-13 (RA Wulst)	75	9 (Perle fehlt)	32	34
Stufe 13 (Kontrollbead)	5	3	0	2
* 0,7-1 mm Folie Barrieren, die zwischen Somiten 15-20 und der seitlichen Mesoderm. 0,35 mg / ml FGF4 bead. 0,05-0,1 mg / ml RA bead.
DMSO Kontrollbead.
** Hühnerembryonen Feststufen 21-23

Tabelle 1. Flügellevel Barriere und Korn Experiment Ergebnisse.

Bühnen Barriere platziert (+ Perle) *	Anzahl betrieben	Leg fehlt **	Leg vorhanden **	Anzahl tot
Stufe 12-15	43	39	0	4
Stufe 10/11	23	16	0	7
Stufe 15 (FGF4 Wulst)	8	0	5	3
Stufe 15 (RA Wulst)	18	0	18	0
* 0,7-1,3 mm Folie Barrieren, die zwischen Somiten 26-32 und der seitlichen Mesoderm. 0,35 mg / ml FGF4 bead. 0,05-0,1 mg / ml RA bead.
** Hühnerembryonen Feststufen 18-24

Tabelle 2. Leg Level Barriere und Bead Experiment Ergebnisse.

Anzahl betrieben	Leg Knospe klein	Leg Knospe etwas klein	Leg Knospe normale Größe	Anzahl tot
BMS 493 Perlen *
15	12	3	0	0
DMSO Perlen **
12	0	3	9	0
* 2-3 in 5 mg getränkten Kügelchen / ml BMS 493 in der richtigen Stufe 14-15 LPM in Beinhöhe platziert.
** 2-3 Perlen in DMSO getränkt allein in der richtigen Stufe 15 LPM in Beinhöhe platziert.
Hühnerembryos in den Stadien 1 fixiert19.07.

Tabelle 3. Leg Stufe BMS 493 Bead Experiment Ergebnisse.

Diskussion

Wir beschreiben die Verwendung von undurchlässigen Barrieren Extremitätenknospe Bildung im Hühnerembryo zu verhindern. Diese Technik hat eine Anzahl von kritischen Schritte. Nach Vorversuchen haben wir festgestellt , dass die Scharnierförmigen verwendet Barrieren in ^{9, 10} bleiben an Ort und Stelle im Embryo weit besser als gerade Barrieren. Das distale flache Seite der Barriere hält sich an die Dotterhaut und hält die Barriere in Platz (2C '). Eine sorgfältige Vorbereitung des Scharniers förmigen Barrieren aus Aluminiumfolie als 1,6 in Protokollschritt beschrieben ist für den Erfolg der Operation von wesentlicher Bedeutung. Ein zweiter wichtiger Schritt ist, um sicherzustellen, dass Eier nicht zu aus dem Inkubator gelassen lange Fensterung folgenden und auf den Embryo vor dem Betrieb Staging. Nach unserer Erfahrung überleben Embryonen eine Operation besser, wenn sie bei oder nahe Inkubationstemperatur sind, wenn die Operation durchgeführt wird. Operationen sollte daher so schnell wie möglich durchgeführt werden, und die Eier wieder verschlossen promptly gute Überlebensraten zu gewährleisten. Viele Forscher einen Tropfen von Antibiotika auf den Embryo Mikrochirurgie folgende bevor die Eier in den Inkubator zurück. Das Vorhandensein der Flüssigkeit verhindert die Barrieren Ankleben gut in Position. Die Zugabe von Antibiotika könnte auch Perlen nach der Platzierung entfernen. Daher keine Antibiotika, schnelle Operationen und gute Sauberkeit mit Instrumenten wird empfohlen, um Infektionen zu vermeiden. nach jeder Stufe einer Operation Instrumente mit 70% Ethanol Abwischen ist ein wesentliches Instrument, um zu verhindern klebrig vom Kontakt mit der Dottermembran, die beide Barrieren oder Kügelchen dazu führen können, Zange zu halten (Protokoll Schritt 3.1.2.2 sehen). Beide Sorten von Perlen verwendet werden könnten, nach der Operation fehl am Platz fallen. Wenn die Barriere Position am nächsten Tag geprüft wurde, war es nicht möglich, durch die Barriere, um zu sehen, um festzustellen, ob die Perle an Ort und Stelle oder nicht geblieben. In Fällen, in denen der Wulst hatte Flügel Knospe Auswuchs überworfen wurde nicht gerettet ( Tabelle 1). Vermeiden mit dem Wulst übertragen Flüssigkeit, wenn sie das Implantieren bedeutet, dass Perlen leichter auf die Schnittfläche des LPM-Stick (siehe Protokoll 2.3.2.3). Schließlich gewährleistet, dass Embryonen sofort behoben werden nach der Ernte gut nachfolgende Genexpressionsanalyse kritisch ist (Protokoll Schritt 4.2).

Dieses Protokoll ändert veröffentlichte Experimente zuvor die Barrieren verwendet Extremitätenknospe Einleitung definiert für Barrieren spezifische optimale Breite und stellt Barriere und Perlen Platzierung durch Genexpressionsanalyse gefolgt Kombination zu verhindern. Wir fanden herkömmliche Aluminiumfolie, die billig ist und ohne weiteres in allen Labors verfügbar, produziert Ergebnisse gleich denen, die vorher Tantalfolie verwendet. Die Folie kann im Embryo gelassen werden , wenn in situ - Hybridisierung (2C ') Ausführung aber wir es in der Regel entfernt werden, wenn mehr als ein Embryo verarbeitet wird, um die scharfen Kanten der Folie zu verhindern Embryonen zu beschädigen. Pilot Studien zeigten, dass die Breite der Beinbereich Barrieren besonders wichtig ist. Zunächst trialed die Barrieren waren zu kurz und Beinknospe Auswuchs wurde nicht verhindert. 1,2-1,3 mm ist die optimale Breite für eine Barriere vollständig Bein Knospe Auswuchs zu blockieren. Die engste Flügel Barrieren, die eine genau platzieren können Knospe Auswuchs geben die besten Überlebensraten zu verhindern. Dies kann so schmal wie 0,5-0,7 mm betragen. Allerdings Barrieren, die ein wenig breiter sind eher in vollständige Blockierung der Flügel Knospe Auswuchs zu führen, weil sie für eine kleine Ungenauigkeit der Platzierung ermöglichen (wir 0,7-1 mm) verwendet. Vermeidung von Blutgefäßen bei der Einschnitt ist für Flügel Knospe Ebene Barrieren kritisch. Semipermeable Barrieren wurden zuvor verwendet worden, um die Küken Gliedmaßenknospe zu halbieren. MacCabe und Parker, 1976 Summerbell 1979 beide verwendeten Filter von 0,45 um und 0,8 um Porengrße, jeweils ^{16, 17.} Sie berichteten , dass diffundierbare Signale durch die Poren in den Filtern passieren kann und dassGegenwart und einer mit einer undurchlässigen Tantalfolie Barriere gewonnenen Ergebnisse mit semipermeable Barrieren ohne Barriere zwischen einer Gliedmaßenknospe auf halbem Weg waren. Dieses Protokoll könnte semipermeable Barrieren unterschiedlicher Porengröße Kandidatensignale zu unterscheiden auf Umfang zu nutzen angepasst werden, oder die Dynamik der Signal Diffusion zu modifizieren.

Dieses Protokoll hat verschiedene Einschränkungen vor allem mit dem Modellorganismus selbst verbunden sind. Solche Techniken könnten weitere Fragen in der Extremitätenentwicklung und auch andere Fragen der wirbel Embryonalentwicklung zu sondieren verwendet werden. Eine Bedingung ist, dass das Organ / fragliche Gebiet entwickeln sollte, wenn der Hühnerembryo zugänglich Intervention ist. Das Vorhandensein von großen Blutgefäße in dem Bereich, wo eine Barriere platziert werden muss, macht Barriere Platzierung später als Stufe 13 oder 14 technisch anspruchsvoll. Wenn große Blutgefäße während der Barrieren Platzierung geschnitten werden kann dieser Embryo Sterblichkeit verursachen. Unsere Untersuchung , wenn die Transkriptionsfaktoren TBX5 und TBX4 werden zuerst in der LPM induziert wurde von der frühesten Phase begrenzt , mit der wir eine Schranke setzen könnten , die später gegenüber jeweils entweder den Flügel oder Schenkel Knospe enden würde. Es könnte erhellend sein , um zu versuchen Tbx Genaktivierung in früheren Stadien, näher an der Gastrulation zu blockieren. Die früheste eine Barriere erfolgreich in der vermutlichen Flügelbereich platziert werden konnte, war die Stufe 8 und im Beinbereich Stufe 10. Dieses Protokoll ist wahrscheinlich für die Untersuchung von Genexpression über Extremitätenknospe Stufen nicht geeignet, da anschließende schnelle Wachstum der Barriere und die Ergebnisse verdrängen würde würde nur in die Ausgangsstellung der Barriere beziehen.

Nachdem die Grenzen des Hühnerembryos in diesem Zusammenhang seine Vorteile gegenüber anderen Wirbelmodellorganismen Zusammenhang sind viele. Hühnerembryo ist ein sehr geeignetes Tiermodell für diese Art der physischen Eingriff in einem Vertebraten embryo. Die Embryos sind relativ groß und sind leicht zugänglich through die Eischale. Man kann sich für weitere Experimente für den Embryo zurückkehren (zB die Entnahme einer Wulst ¹⁸ oder sogar eine Barriere) oder über die Fortschritte zu überprüfen , indem einfach das Band Fenster zu entfernen. Es ist möglich, Umfang Live-Bildgebung oder Zeitraffer-Bildgebung aufzunehmen. Wir beschreiben eine Methode von Hühnereiern Windowing, die besonders zum Betrieb auf Embryonen im Frühstadium geeignet ist. Im Fall der Extremität Studien ist es sehr wichtig und hilfreich, dass es eine kontralaterale Extremität Steuer für jedes Experiment, das für jede biologische Replikation als ideale interne Kontrolle dient.

Die Kombination undurchlässige Barrieren der Verwendung von Extremitätenwachstum und Perlen in Signalmoleküle durchtränkt zu verhindern ist bisher nicht berichtet worden. Unsere Analyse der mRNA-Expression solcher Interventionen finden Sie ebenfalls neu. Diese Techniken konnten wir das schwierige Problem der zu sezieren , wenn Gliedmaßen spezifische Transkriptionsfaktoren Tbx5 und TBX4 sind in der LPM induziert und auchnicht ausreichend für die Aktivierung der Transkription FGF10 und dem Beginn der Extremitätenknospe Auswuchs zu zeigen , dass später vor bud Initiation Extremität, ist die Anwesenheit dieser Gene in Tbx der LPM. Figuren 2G, 2D und 2E diese Ergebnisse gut illustrieren. Das Fehlen von TBX4 Ausdruck nach dem Einsetzen einer Barriere in der Stufe 10 in Figur 2G ist im krassen Gegensatz zu ihrer Präsenz in 2D und 2E folgenden Barriere Einsetzen in Stufe 15, nach der Induktion von TBX4. Die Implantation von RA getränkten Kügelchen erleichtert die Rettung von Extremitätenknospe Einleitung folgende Barriere Einsetzen und so Punkte zu RA aus den Somiten wesentlich in der LPM ist vor Extremitätenknospe Auswuchs beginnen kann. Solche Techniken könnten weitere Fragen in der Extremitätenentwicklung, sondern auch andere Fragen der wirbel Embryonalentwicklung zu lösen verwendet werden. Bereiche des Gehirns, der Augen und des Rumpfes sind wahrscheinlich geeignet sein.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont No. 5 watchmakers forceps, x2	Fine Science Tools  www.finescience.de	11251-20
Dumont No. 4 watchmakers forceps, x2	Fine Science Tools  www.finescience.de	11241-30
Dumont strong forceps, type AA	Fine Science Tools  www.finescience.de	11210-10
Curved scissors with blades 2.5 cm long	Fine Science Tools  www.finescience.de	14061-11
Blunt ended curved forceps, ends approx 0.5 cm long	Fine Science Tools www.finescience.de	11065-07
Steel pin, 0.2 mm wide	Fine Science Tools  www.finescience.de	26002-20
Sharpening stone, square	Fine Science Tools  www.finescience.de	29008-01
Mineral oil
Needle holder	Fine Science Tools  www.finescience.de	26016-12
Clear tape, 50 mm x 66 m	www.5staroffice.com	295985
FGF4 protein			A gift from Cliff Tabin.
all-trans-retinoic acid	Sigma www.sigmaaldrich.com	R2625-50MG	Remember to protect from light.
BMS 493	Sigma www.sigmaaldrich.com	B6688-5MG
Scalpel blade No. 15	www.swann-morton.com	cat no. 0105
Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel	Bio-Rad www.bio-rad.com	153-7301	Beads for delivering protein.
AG1-X2 Ion exchange resin	Bio-Rad www.bio-rad.com	140-1251	Beads for delivering RA or BMS 493.
Incubator for eggs	Memmert www.hce-uk.com	LAB128
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma www.sigmaaldrich.com	P6148-1KG	Harmful, irritant, corrosive.  Handle powder in fumehood with full protective clothing.
Ethanol	Sigma www.sigmaaldrich.com	32221-2.5L
DMEM, high glucose	Gibco www.thermofisher.com	41965-039	500 ml
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific webshop.fishersci.com	D/4121/PB08	500 ml
Binocular Microscope	Leica www.leica-microsystems.com	MZ6	Replaced by M60
Chicken eggs	Henry Stewart & Co Ltd sales@medeggs.com		Brown Eggs