チックに誘導シグナルを研究するために、候補因子浸しビーズと組み合わせることで不浸透性の障壁の応用

要約

Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

要約

ニワトリ胚は、直接的な方法で発達質問を分析するために使用することができる優れた脊椎動物のモデルを提供します。外科的介入後のアクセシビリティと堅牢性が重要な実験的な強みです。マイカ板は、ニワトリ肢芽開始^1を防止するために使用される最初の障壁でした。翼の芽や脚の芽の誘導およびまたは開始に不透過性障壁としてアルミ箔を使用するプロトコルが記載されています。我々は、バリアによってブロックされた外因的に供給候補内因性因子への障壁にビーズ配置横でこの技術を兼ね備えています。結果は、その後の遺伝子発現のインサイチュハイブリダイゼーションを用いて分析します。私たちの主な焦点は、誘導にレチノイン酸シグナル伝達およびニワトリ胚の前部と後肢の後に開始の役割にあります。私たちは、BMS 493（レチノイン酸受容体（RAR）の逆アゴニスト）は、バーの効果を模倣するために側板中胚葉（LPM）に移植されたビーズを浸し使用しますRIERは体節（レチノイン酸（RA）のソース）と肢芽が成長するからLPMの間に配置されました。これらのプロトコルの修正版は、誘導手がかりの起源とタイミング上の他の質問に対処するために使用することができました。ニワトリ胚の領域は、関連する発達段階でのアクセスが提供される、バリアは2つの組織の間に配置することができ、開発における必然的な変化を研究しました。例としては、肝臓や腎臓の誘導として、脳の発達、軸延長にと臓器の開発に見ることができます。

概要

クラシック胎生学者は伝統的に胚発生を制御するメカニズムを調べるために物理的技術を採用します。 1960年代と1970年代に研究者らは、胚形成の間、誘導信号の重要性を実証するために、発生中の胚の組織の間に挿入された不透過性の障壁を使用する技術を開発しました。私たちの関心は肢芽の伸長の前にどのようなイベント脊椎動物の四肢の開発に、特にあります。例えば、バリアの挿入は、対、無操作側に正常に進行させながら、ニワトリ胚の片側に発生肢芽の成長を防止することができます。これらの障壁が変化するために使用される材料。例えば、マイカ板¹とタンタル箔^2。これらの障壁は、効果的に、近軸中胚葉から形成された体節から、から肢芽の形態、側板中胚葉（LPM）を分離します。外科的移植する技術は、その密接な関係のウィットを実証します肢芽の開始はLPM ^{3 4}で発生することがある場合は時間体節が不可欠です。 80年代と90年代に発達生物学者は、発生過程の制御に不可欠である拡散性シグナル伝達分子を発見しました。これらのシグナル伝達分子に浸したビーズは、胚の特定の領域に移植し、胚発生に変化を生み出すことができます。ニワトリ胚に注入し、数字⁵の鏡像複製を生成することができる場合、例えば、イオン交換ビーズによって取り込まレチノイン酸（RA）は、24時間にわたって放出されます。 FGFタンパク質を含有するヘパリンアクリルビーズは、肢のLPM ⁶から肢芽の伸長を開始することができます。

さらに最近では、マウスや魚の遺伝学は^、（7件）新たな時代に、脊椎動物の四肢開始の研究をとっています。肢芽の開始に先立って体節でRAの存在は、LPによって必要不可欠拡散信号であることを十分な証拠がありますMは、四肢の出芽を開始します。私たちは、肢芽開始の頃LPMにおける遺伝子発現に対する障壁注入の効果を分析するためにニワトリ胚のアクセシビリティと実験的な堅牢性を悪用したかったです。本手法の新規適応はバリアによってブロックされた外因的に供給候補内因性因子に対する障壁にバリアをビーズの配置、横方向と軸方向の組織からの遮断信号を組み合わせることです。次のプロトコルは、肢芽の誘導および開始のメカニズムを引き出すために開発されたものです。

肢芽の開始を研究することは、早期段階の胚を使用することを意味します。最初の皮下注射針で気嚢を通してアルブミンの一部を除去することにより、多くの研究者ウィンドウの鶏の卵。卵黄の上に位置する胚は、その後、卵の下位に位置します。これは、エレクトロポレーションのようないくつかの技術のために有利であるが、胚の外科的処置が所望される場合に不利であることができます。我々は可能な限り卵の開口部に近いが利点であるとして、胚を持つ見つけます。

質問は、脊椎動物の肢芽の誘導と開始を制御する信号についてのままであり、以下のプロトコルは、それらに対処するのに適しています。私たちは、早い段階12 ⁸より段階でニワトリ肢芽の伸長を防止するための障壁を挿入するためのプロトコルを開発する最初のものです。これらのプロトコルの修正版もアクセス可能な誘導組織が誘導されている原基に隣接している誘導性手がかりの起源とタイミング上の他の質問に対処するために使用することができました。胚の領域は、関連する発達段階でのアクセスが設けられて、その後、バリアは2つの組織の間に配置することができ、開発における必然的な変化を研究しました。例としては、脳の発達、軸延長や、肝臓や腎臓の誘導のような可能性の臓器の開発に見ることができます。

プロトコル

以下のプロトコルは、インキュベーションの10日以内でニワトリ胚を使用しています。全ての実験は、キングス・カレッジ・ロンドン、英国、英国内務省動物保護ガイドラインに従って行われました。

前ニワトリ胚の操作に必要な1.準備

1. 収穫のためにとニワトリ胚を固定するため、操作に必要な以下の手術器具を収集：5号時計メーカー2対の鉗子、強力な鉗子の一組、 例えば 、AA型、長さ2.5cmブレードを備えた湾曲はさみ、ブラントは、湾曲終了箔障壁（1.6.3）をしながら、約0.5センチメートル長い端部を有する鉗子、また、第4時計職人の鉗子の2ペアが使用しています。
2. スチールピン（全体の0.3ミリメートル）からマイクロナイフを作る研ぎ石の上に油を使用して先鋭化。双眼顕微鏡を使用して、フラットブレードにピンの先端をシャープに。針ホルダーにピンを配置し、その鋭いノックされるの終わりとdenを守りますテッド。
   注：1,000μlのピペットチップでナイフをシースは、このための簡単なオプションです。
3. プラスチック洗浄瓶に70％エタノールを準備します。殺菌し、それらをきれいにするために使用前と後の手術器具およびマイクロナイフを拭くためにティッシュペーパーでこのの噴出を使用してください。
4. 幅5cm明確な粘着テープおよび適切なディスペンサーを購入します。その側に安定した鶏の卵を保持するのに適した残りの部分を見つけるか、または製造しています。
5. ビーズを浸漬のために作ると店舗ソリューションを提供しています。
   1. 30μlのアリコートで-20℃で水とストアでそれを希釈することによって1mg / mlの凍結ストックからの線維芽細胞増殖因子4（FGF4）タンパク質の0.35 mg / mlで溶液を調製します。
   2. 調製溶液を5mg / mlのストックから暗いマイクロ遠心チューブ内のジメチルスルホキシド（DMSO）で希釈し、全トランスレチノイン酸（RA）の（いずれか0.05または0.1 mg / mlで）。 -20℃でストックし、100μlのアリコートを保管してください。
   3. 準備ソリューションBMS 493の（どちらか2.5または5 mg / mlで）（逆AG10mg / mlストックから暗いマイクロ遠心チューブにDMSOで希釈したRARのonist）。 -20℃でストックし、100μlのアリコートを保管してください。
6. アルミ箔から障壁を作ります。
   注：障壁を作るために使用される箔は（0.013ミリメートルの厚さとしてマイクロメーターで測定して）標準ケータリング箔です。どれでも国内のアルミ箔は、おそらく適切であろう。
   1. アルミ箔1cmの正方形の部分をカットし、組織上の70％エタノールでそれを拭いて、それを殺菌。 6センチメートル滅菌プラスチックペトリ皿の上に置きます。ふたを捨て、箔から皿のために蓋をします。
      注：これは、後に静に皿のプラスチックの蓋に付着カット障壁を防ぐことができます。
   2. 1.6倍に設定倍率の双眼顕微鏡下のステージ目盛り（100セクションに長さ1cmのスプリット）の上にペトリ皿を置きます。 15番ブレード小さなメスを用いて、 例えば 、正確な幅に0.7ミリメートルまたは1.3ミリメートルの箔のストリップをカット。
   3. 箔を分離4番時計職人の鉗子の2ペアを使用してストリップ。そして、それは特定の幅のヒンジに似ているように、箔障壁の中心に直角曲げを行います。
      注：バリアのこの形状は、 ^{図9に示すように、10}から取り出されます。ヒンジ付きの障壁は、ストレート、フラットバリアよりもより良い場所に留まります。第4鉗子は比較的鈍いであり、それらはフォイル障壁にへこみやスコアを作る可能性が低いため、使用されています。
   4. 皿や他の一方の側に残りノーカット箔を移動する、皿の外に上向きに対して平らに片側でペトリ皿の中央に障壁ラインアップ。操作前日20以上の障壁を準備します。皿の上に箔の蓋を置き、彼らが邪魔されない場所での障壁を格納します。
      注：わずかなノックが終わっ障壁を傾けるか、皿の側面に静的に固執することを意味することができます。
7. 38℃で段ボールの卵トレイにその両側に受精鶏卵をインキュベート操作前日適切な時間の長さCは、胚が目的の⁸段階になりますように。

ニワトリ胚および運用日にビーズの作製

1. 「ウィンドウ」は鶏の卵をインキュベートしました。
   注：卵を開くための次のメソッドは、デニスSummerbellによって渡された（公開されません）。
   1. 卵がその側に横たわっていると、AA型の強力な鉗子は、内卵殻膜が破壊されていることを確認することで卵の鈍端（気嚢の端を）突き刺します。これを行うためには、しっかりと一緒に鉗子を把握し、フリーハンドで卵を保持したまま制御刺すような動きを使用しています。
   2. まだ水平軸に沿って180°を通してそれをオンにし、最上た側は次のトレイに今あるような卵トレイにそれを置き換える（1どちらかの側）の両方の手で、その側に横たわって、卵を取ります。
      注：これは、シェル膜から胚を緩めると胚がルであることを意味します胚上記シェルが除去されたときに切断される可能性が高いSS。
   3. 約5cmの正方形明確なテープ片を取り、卵が開かれたときに、胚に崩壊しつつあるから卵殻を停止するには、卵の最表面に密接にこれを貼り付けます。
   4. すぐ下に位置している空気が胚の上に卵を入力できるように優しくシェルと卵の最上部の中央にその膜を打破するために湾曲したハサミを使用して、（はさみの一つのブレードと非常に小さな穴を作りますシェルの最上部）。
      注：ちょうど胚をカバーする膜のいずれかを壊すシェル膜を破壊しないことで、卵に入る空気は、シェルから胚を分離し、胚が約0.5〜1センチメートルシェルから卵黄の上に残りの部分に来ます。
   5. 約直径1cmの円形に殻に穴を拡大するために湾曲したハサミを使用してください。と卵に穴を切除したシェルの一部を削除し、カバー明確なテープ片約5cmの正方形。簡単にこのテープを削除するには、無料の残りのテープを残し、唯一の穴の唇でそれを固執するテープを押してください。空きテープは、その後、卵を開封するために把握することができます。
2. ステージの胚
   1. 38°Cとウィンドウ（ステップ2.1）（ステップ1.7を参照）でのインキュベーションに続いて^、8に従ってニワトリ胚をステージングする双眼顕微鏡を使用しています。卵は、ウィンドウ以下の密封されている直前にこれを行います。卵殻上の各胚のステージを書きます。インキュベーターに卵を返します。
      注：8と15の間の段階で胚が障壁とビーズの実験に適しています。彼らはあまりにも長い間、動作前にインキュベーターから除外されていない場合は胚が生き残る可能性が高くなります。
3. 操作前にビーズを浸します。
   1. FGF4
      1. 千μlのピペットチップの先端に固執アフィニティークロマトグラフィーゲルビーズの数（150-300μm）を取るとしましたマイクロ遠心チューブ内の1mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中のHそれらは、それらが5秒間。遠心分離に格納されているアジドを除去し、PBSを廃棄し、二度の処理を繰り返します。
      2. 氷上で30分間滅菌したシャーレ上で0.35 mg / mlでFGF4タンパク質の30μlのドロップにゲルビーズを浸します。胚に挿入するための第5マイクロピンセットでビーズを約150μmの直径を選択してください。
         注：ビーズは脆く、きつく絞った場合に粉々にすることができるので、第5マイクロピンセットと非常に軽く握り、それらを用いて、以下の手順で使用されるイオン交換樹脂ビーズを処理します。この警告は、2.3.2-2.3.3、すべての樹脂ビーズの操作に適用されます。
   2. RA
      1. 0.05または0.1 mgの一定分量を解凍/オールトランスRAは、DMSOで希釈し、以前に光からRAを保護するためにホイルでカバーされた滅菌ペトリ皿（直径9cm）、に100μlのドロップを置きmLです。 10μlのピペットチップを取り、いくつかの塩化物型のイオン交換を拾いますその端部に樹脂ビーズと20分間室温で光から保護RAドロップこれらを浸します。
      2. 1cm以上離れた同じシャーレ上に配置された100μlのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の連続する3つの滴中でビーズを洗浄します。
         注：ビーズはDMEMからフェノールレッド色素を取ります。この方法は^、5に基づいています。
      3. ビーズを保持するためにペトリ皿と5番マイクロピンセットの下顕微鏡ステージの目盛りのスライドを使用して胚に挿入するため、約100μmの直径（湿潤時ビーズは75から180ミクロンのサイズの範囲）のビーズを選んでください。ペトリ皿の上に100μlのDMEMのドロップ、ビーズダウン最初の場所からのビーズをピックアップし、ドロップのうち、ビーズを押すことによって、またはキャピラリー（次のビーズに、閉じた鉗子を置くことによって、どちらかそれから残りのDMEMを削除する場合アクションは）ビーズから離れた液体を描画します。
   3. BMS 493
      1. RA（2.3.2）に関しては、イオンEXCHを浸します20分間、室温で2.5または5.0 mgを100μlの滴/ mlのDMSO中BMS 493でアンジュ樹脂ビーズは、その後、DMEM100μlの滴ですすぎます。胚に挿入するためのビーズ約100μmの直径を選択してください。
   4. DMSOコントロール
      1. RA（2.3.2）については、DMEM100μlの滴ですすぎ、次いで20分間室温で、DMSOの100μl滴中のイオン交換樹脂ビーズを浸します。胚に挿入するためのビーズ約100μmの直径を選択してください。

3.バリアとビーズの操作

図障壁およびまたはビーズが置かれるべき場所を示す様々な段階のニワトリ胚の1回路図。 presumpで体節とLPMの間（A）ステージ13ニワトリ胚を示す概略図バリア位置（グリーンライン）的なウイングレベル（体節15-20）。 RAビーズ（赤い円）は、バリア挿入の前に置かれるべき場所を示す（B）（A）と同じ概略図。 （C）ステージ15胚における推定脚レベル（体節26-32）で示す概略図バリア位置（緑の線）。 （D）（C）の場合と同様の模式、RAビーズ（赤い円）が置かれるべき場所を示します。 （E）の回路図BMS 493ビーズ（紫円）はステージ15胚のLPMに置かれるべき場所を示します。 （F）推定ウイングレベルで前体節中胚葉とLPMの間の障壁の位置（緑色の線）を示すステージ9ニワトリ胚の模式図。 （G）バリア（緑線）とRAビーズ（赤い円）の位置を示すステージ9の胚の模式図。 （H）推定脚レベルでバリア位置（緑の線）を示すステージ10ニワトリ胚の模式図。 （I ）ステージ10脚レベルLPMにBMS 493ビーズの位置（紫円）を示す模式図。この図⁷から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

1. バリアは、翼の芽の開始を防止するために、ステージ13に挿入します。
   1. インキュベーターからステージ13胚を取り、3.2倍の倍率又は好ましい場合以上に設定双眼顕微鏡下で卵の残りの部分に卵を置きます。明確なテープの上層を削除します。
      1. （体節がすべてのこの段階で形成されていない）スチールマイクロナイフを使用して、胚の右側の卵黄膜と体節に隣接する側板中胚葉（LPM）15〜20（ 図1A）を介して切開を行います。形成された最後の4つの体節に隣接してカットし、尾側にカット2体節長を続けています。
      2. 第5 microfoで（0.7〜1ミリメートル幅）障壁をピックアップペトリ皿から突出端にrcepsと切開部に障壁の自由端部を挿入するために手をねじります。ヒンジ状のバリアはそれの半分は体節の遠位に切開部を通して下方に突出してLPM上記の卵黄膜上に平らに。できるだけ早く明確なテープで卵を密封し、インキュベーターに戻します。
         注：マイクロナイフとピンセットは、卵黄膜と接触すると粘着性になります。その後の操作を試みる前に、70％エタノールできれいに拭いてくださいすることが重要です。これは、後続のすべての操作の説明をし、ビーズ注入に適用されます。
      3. ビーズは、バリアと一緒に挿入される場合、まず、第5マイクロピンセットでビーズを取り、切開部の先端側にLPMの切断面に挿入した後、ビーズ（ 図1B）に切開近位にバリアを挿入します。卵を密封し、インキュベーターに速やかにそれを返します。
2. バリアは、脚の芽の開始を防止するために、ステージ15に挿入します。
   注：TBOX 4転写因子 （Tbx4）発現に対するこの操作の結果の例を図2Dおよび2Eに示されています。
   1. インキュベーターからステージ15の胚を取り、3.2倍の倍率又は好ましい場合以上に設定双眼顕微鏡下で卵の残りの部分に卵を置きます。明確なテープの上層を削除します。
      1. 鋼マイクロナイフを使用すると、胚の右側に体節26から32（ 図1C）に隣接した卵黄膜とLPMを通して切開を作る（体節は、この段階で形成されていないすべてを持っています）。形成された最後の2体節に隣接してカットし、尾側にカット5体節長を続けています。
      2. 一方の端部に第5マイクロピンセットで（1.2〜1.3ミリメートル幅）障壁をピックアップし、切開部に自由端を挿入するバリアをねじります。できるだけ早く明確なテープAと卵を封印NDインキュベーターに戻します。
         注：ヒンジ状のバリアはそれの半分は体節の遠位に切開部を通して下方に突出してLPM上記の卵黄膜上に平らに。
      3. ビーズは、バリアと一緒に挿入される場合、まず、第5マイクロピンセットでビーズを取り出し、切開部の先端側にLPMの切断面に挿入し、その後に切開近位側にバリアを挿入しますビーズ（ 図1D）。卵を密封し、インキュベーターに速やかにそれを返します。
      4. ビーズやビーズはバリアなしで挿入される場合は、脚の領域に、例えば 、BMS 493ビーズステージ15で、長い切開（3.2.2.1）をしないでください。卵黄膜を通って、ビーズが配置される位置でのLPMに小さな切開を行います。第5マイクロピンセットでビーズを取り、LPMの穴に挿入します。鉗子（ 図1E）の閉鎖端部ともう少しでそれを押してください。
3. バリアは、翼の芽の誘導と開始を防止するためにステージ9に挿入します。
   1. ステージ8やインキュベーターから9胚を取り出し、好適な場合には3.2倍の倍率以上に設定双眼顕微鏡下で卵の残りの部分に卵を置きます。
      1. 鋼マイクロナイフを使用すると、約5体節の長さの長い体節（ 図1F）に沿った胚の尾終わりに、原始線条に横方向と吻側卵黄膜とLPMを通して切開を作ります。
      2. ペトリ皿から突出端に第5マイクロピンセットで（0.7〜1ミリメートル幅）障壁をピックアップし、切開部に障壁の自由端部を挿入するために手をねじります。できるだけ早く明確なテープで卵を密封し、インキュベーターに戻します。
         注：ヒンジ状のバリアはそれの半分は切開部を通して下方に突出してLPM上記の卵黄膜上に平らに。
      3. ビーズはinserteにする場合バリアと一緒にD;まず、第5マイクロピンセットでビーズを取り、切開部の先端側にLPMの切断面に挿入した後、ビーズ（ 図1G）に切開近位にバリアを挿入します。卵を密封し、インキュベーターに速やかにそれを返します。
4. バリアは、脚の芽の誘導と開始を防止するために、ステージ10に挿入します。
   注：Tbx4発現に対するこの演算の結果の一例を、 図2Gに示されています。
   1. インキュベーターからステージ10胚を取り、3.2倍の倍率又は好ましい場合以上に設定双眼顕微鏡下で卵の残りの部分に卵を置きます。
      1. 鋼マイクロナイフを使用すると、約6体節の長さの長い体節（ 図1H）に沿った胚の尾終わりに、原始線条に横卵黄膜とLPMを通して切開を作ります。
      2. バリアピックアップ（1.2ペトリ皿から突出末端で第5マイクロピンセットで広いミリメートル）と切開部に障壁の自由端部を挿入するために手をねじります。できるだけ早く明確なテープで卵を密封し、インキュベーターに戻します。
         注：ヒンジ状のバリアはそれの半分は切開部を通して下方に突出してLPM上記の卵黄膜上に平らに。
      3. ビーズは、ステージ10における脚部の領域に、例えば、BMS 493ビーズ、バリアなしで挿入される場合には、卵黄膜を介して小切開を行い、ビーズが配置される位置でのLPMに。第5マイクロピンセットでビーズを取り、LPMの穴に挿入します。鉗子（ 図1I）の閉鎖端部ともう少しでそれを押してください。
5. 新興対側肢芽と比べてバリアの位置を確認して操作した後24時間以上。障壁が明らかにopposではない任意の胚を破棄左肢芽をITE。この場合、障壁は、誤って配置されています。

4.収穫胚、in situハイブリダイゼーションホールマウント用の固定と準備（WISH）

1. 収穫の胚操作を投稿してください。
   1. ステージ19-23で収穫胚肢芽の形態が明確に両方の操作と反対側のコントロール側に表示されるようになっています。
      1. 湾曲したハサミを使用すると、卵殻に、より大きな穴をカット。マイクロピンセットを持つ胚の左側に大血管を保持しながら、胚の周りにカットします。胚を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）pHが7.3のペトリ皿に配置するために血管のこのグリップを使用します。
      2. 双眼顕微鏡下では、湾曲したハサミなしの組み合わせを用いて、胚体外血管および膜を離れて解剖。 5マイクロピンセット。はさみを使ってヘッドを取り外します。
2. 胚の固定は、収穫を投稿してください。
   1. 湾曲したblunを使用しましたトンの鉗子は、胚を持ち上げ、スクリューキャップで20ミリリットルのガラス瓶に揺動した後、4℃で一晩2時間室温でPBSで5ミリリットルの4％パラホルムアルデヒド（PFA）に配置します。
      注意：PFAは、健康に深刻な危険です。それは有害な、腐食性刺激性であり、粉末は眼や皮膚、肺に接触することを防止しなければなりません。溶液を調製しながら、個人的な保護服とヒュームフードを使用してください。それは4％水溶液、手袋、目の保護と白衣を着用する必要がありたら。
      注：これは最高のmRNAの完全性を維持するために迅速に修正に胚を取得することが重要です。
3. in situハイブリダイゼーションホールマウントする前に障壁を除去します。
   注：彼らはシャープであり、それらはin situハイブリダイゼーションプロトコルを介して行くように胚を損傷することがありますので、障壁は、いくつかの胚を一度に染色されている場合は特に、削除されます。
   1. 固定後、両眼マイルの下でPBSの皿に胚を置きますcroscope。
   2. 第5マイクロピンセットの2ペアを使用して、胚の操作側に密接バリアのいずれかの側を左のペアを配置します。左右一対でバリアをつかみ、静かに胚を抑えるために、それが除去されるように、バリアに付着する任意の組織を防止するために、左のペアを使用して、胚からバリアを引き出します。
4. ¹¹で説明したように、本質的WISHを行います。

結果

上記の詳細なプロトコールは、西本らに用いられる方法を説明します。 、2015年論文は、ニワトリ胚の前部と後肢の両方で肢芽の誘導と開始を研究しています。前肢芽の伸長を防ぐために、不浸透性の障壁を挿入し、次の結果は、以前に^1、2、9しかし脚芽開始^1を防ぐ障壁を記述する唯一の研究がなされている公開されています。西本らから後肢のデータ。 2015年は、バリア挿入、次のmRNA発現の研究​​の代表的な結果として、ここで提示されています。

LPMでTbx4の発現は、後肢伸長を開始するのに十分なされていません。
図2BおよびC（ 表2）は、ステージ15（ 図2A）でそのバリア挿入が（プロトコル3.2を参照）の両方FGF10につながる表示しますそして、FGF8の発現が運営右側に（括弧で表記）脚芽領域に不在です。無操作左側と比較してください。しかし、Tbx4発現が操作側（ 図2DおよびE）にステージ19とステージ23の双方で観測されます。我々は、単独でTbx4発現がLPMから後肢伸長を開始するのに十分ではないと結論付けます。ニワトリにおける他の研究は、TBX遺伝子発現が前肢芽形成^12,13を開始する^のに十分であることを示唆しています。

図2Cは、「バリアが胚ポスト固定の脚部の領域に埋め込まれたどのように見えるかを説明するために含まれています。例障壁の大部分では前in situハイブリダイゼーション（プロトコル4.3） 中に除去しました。

体節からRAはFGF10誘導肢芽O前にLPMに不可欠ですutgrowth：
図3Aは、ステージ15（プロトコル3.2.1.3）に挿入障壁にRA浸漬ビーズ遠位の添加を示す概略図です。 （アスタリスクで示される）この操作肢芽の伸長、彼らがコントロール左側にあるように芽で表現されている操作右側とTbx4、FGF10とFGF8上で観察されるに続いて（ 図3B、CおよびD、 表2） 。したがって、LPMにRAの添加は障壁と肢芽開始進行の影響を克服します。私たちは、肢芽の伸長を開始する前に、体節からの正常な発達のRAにLPMに不可欠であると結論付けています。その結果後肢芽は、制御側のものよりも一般的に小さくなっています。これは、野生型の状況と同等でないというLPMにRAの用量に起因する可能性があります。 RAの用量が高すぎるとアピカル外胚葉リッジ（AER）を短縮することができ、小さな芽を生じます^14、15。

LPMでのRA（体節から）は、通常の肢芽の開始のためにRAR、BMS 493の逆アゴニストを必要としていることを確認するために、使用されました。ビーズは、ステージ15で脚領域LPM（プロトコル3.2.1.4を参照）（ 図3E）に注入されます。 FGF10の発現が制御側（; 表3、 図3F）に比べて小さい後肢芽で、その結果、LPMでBMS 493ビーズの次のアプリケーションをダウンレギュレートされます。制御DMSOビーズは、これらの欠陥（; 表3、 図3Gおよび3H）を引き起こしません。 BMS 493適用後に観察された欠陥はバリア操作によって誘導されるものよりも穏やかです。 すなわち、FGF10 は依然として発現され、肢芽が形成されています。 BMS 493の効果は、ビーズの周りに局所的に制限され、AXIによって生成された全てのRAをアンタゴナイズすることができないかもしれないので、これは可能性がありますアル組織。

初期の軸方向の信号は後でTbx4エクスプレス LPMセルを指定します 。
LPMは将来の脚形成領域にTbx4を表現する能力を取得したとき私たちは、テストしました。バリアがその後脚芽の伸長を阻止することを挿入することができる最も早い段階では、我々はステージよりも前の段階で近軸中胚葉と推定される脚部との間に挿入12.障壁を障壁を挿入するためのプロトコルを開発する最初のものであるステージ10でありますステージ10でのLPMステージ10における軸方向の組織からの信号は以降の発現に必要であることを示唆し、脚形成LPM（ 図2F及び2G、 表2）のブロック脚芽形成とTbx4の発現（プロトコル3.4を参照してください）後肢LPMでTbx4。後でバリア挿入がTbx4の発現を可能にする図2DおよびEでこの結果を比較確立されます。さらに、我々は、この軸方向の信号はRARの逆アゴニストはTbx4の発現を減少させるかどうかを観察することによってRAかもしれないかどうかを試験しました。ステージ10（プロトコル3.4.1.3を参照）で後肢LPMに配置されたBMS 493ビーズをDMSOに浸したコントロールビーズがTbx4式（ 図2Jおよび2K）には影響しません一方、Tbx4式 （ 図2Hおよび2I）をダウンレギュレートします。一緒に、これらの結果は、軸組織からのRA信号を積極後肢LPM ⁷にTbx4を調節することにより、四肢誘導を調節するモデルをサポートしています。

術後死：
表1、表2、表 3は、術後、収穫前に死亡したニワトリ胚の数を含む実験結果の詳細を与えます。一部の死亡は、この種のマイクロサージェリーの後に予想されます。瀕死の数字は保つことができます楽器が汚れていないことを確認することによって最小限に、卵の穴は、胚は、この最後の点の操作に連動して、最小限の時間のための粘着テープシールの保護なし左とされていることを、最小サイズ必要です可能な限り迅速に行われます。これらの操作はいずれも、非常に時間がかかりませんが、ビーズや障壁に関係する操作は、もう少し時間がかかります。これらの措置にもかかわらず、操作は最も初期の段階で行われ、翼の地域のものは死をもたらす可能性が高いです。死による失血につながる可能性四肢形成領域及びこれらの血管の偶発的な破裂の周りに大きな血管があります。我々卵がステージ8または9で開かれたことがわかり、その胚に操作されていない、多くの場合、翌日までに死んでしまいます。したがって、これらの問題に対する唯一の解決策は、実験の多数を行うことです。

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推定的レッグレベルでのバリアまたはビーズの挿入を次の 図2. マーカー遺伝子発現の変化。 （A）ステージ15胚における推定脚レベル（体節26-32）で示す概略図バリア位置（緑の線）。 （B - EおよびG）操作胚上WISH分析。脚部領域は（カッコ）に概説されています。 （B）FGF10発現を操作LPMには存在しないが、強い発現が左側芽において検出されます。 （C）FGF8発現にはAERがありません示唆し、運営側には存在しません。 （C '）の障壁が取り除かれた前に、同じ胚。 （D）Tbx4は、制御芽と同じ吻側-尾側レベルでLPMで表現されています。 （E）Tbx4発現は肢の成長の欠如にもかかわらず、右脚領域に維持されます。 （F）段階の模式図推定脚レベルでのバリア位置（緑の線）を示す10ニワトリ胚。 （G）Tbx4式が運営右LPM（ブラケット）には存在しません。 （H）推定脚レベルでBMS 493ビーズの位置（紫円）を示すステージ10ニワトリ胚の模式図。 （I）Tbx4式は、BMS 493（J）コントロールDMSOビーズ位置（灰色の円）を示すステージ10ニワトリ胚の模式図で処理した後の操作右側にダウンレギュレートされます。 （K）Tbx4はDMSOのみで処理した後の制御左側のと同様のレベルで操作右側に表現されています。この図⁷から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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図3. RA救助肢芽の不在は、バリア挿入によるレッグバド伸長する前にLPMに必須です。 （A）推定脚レベル（体節26-32）とRA-浸したビーズ（赤い円）でバリア位置（緑の線）を示す概略図。 （B - D）（アスタリスクで示す）RA救出脚芽伸長。 （B）Tbx4式は、非手術側に類似救出脚芽に存在しています。 （C）FGF10を救出戦で発現している非手術側に似て出芽します。 （D）FGF8は救出右脚芽のAERで表現されています。 BMS 493ビーズ（紫円）はステージ15の胚の推定脚LPMに入れたところ（E）の回路図を示します。 （F）FGF10の発現が運営右側にダウンレギュレートし、足の芽は、BMS 49以下の小さいです3治療。ビーズは、アスタリスクを付しています。 （E）から（G）同様の概略図、制御DMSOビーズ（灰色の円）の位置を示します。 （アスタリスクで示す）（H）DMSOビーズは、FGF10の発現や脚の芽の大きさに影響を与えませんでした。この図⁷から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ステージバリア置か（+ビーズ）*	番号操作	行方不明ウィング**	現在ウィング**	数の死者
ステージ12-14	40	24	1	15
ステージ8/9	65	23	0	42
ステージ12-13（FGF4ビーズ）	41	7（ビーズ不足しています）	17	17
ステージ12-13（RAビーズ）	75	9（ビーズ不足しています）	32	34
ステージ13（コントロールビーズ）	5	3	0	2
体節15-20と側板中胚葉との間に配置された* 0.7〜1ミリメートル箔障壁。 0.35 mg / mlでFGF4ビーズ。 0.05〜0.1 mg / mlでのRAビーズ。
DMSOコントロールビーズ。
**ニワトリ胚の固定台21-23

表1.ウィングレベルのバリアとビーズ実験の成果。

ステージバリア置か（+ビーズ）*	番号操作	行方不明の脚**	脚存在**	数の死者
ステージ12-15	43	39	0	4
ステージ10月11日	23	16	0	7
ステージ15（FGF4ビーズ）	8	0	5	3
ステージ15（RAビーズ）	18	0	18	0
体節26-32と側板中胚葉との間に配置された* 0.7〜1.3ミリメートル箔障壁。 0.35 mg / mlでFGF4ビーズ。 0.05〜0.1 mg / mlでのRAビーズ。
**ニワトリ胚の固定台18-24

表2脚レベル障壁とビーズ実験の成果。

番号操作	脚は小さな芽	脚は少し小さな芽	脚芽通常のサイズ	数の死者
BMS 493ビーズ*
15	12	3	0	0
DMSOビーズ**
12	0	3	9	0
* 2-3ビーズを5mgに浸し/ミリリットルBMS 493は、脚のレベルで右のステージ14-15 LPMに入れました。
DMSOに浸し** 2-3ビーズだけでは足のレベルで右ステージ15 LPMに入れました。
ニワトリ胚は段階で固定17-19。

表3脚レベルBMS 493ビーズ実験の成果。

ディスカッション

We describe the use of impermeable barriers to prevent limb bud formation in the chick embryo. This technique has a number of critical steps. Following preliminary experiments, we found that the hinge shaped barriers used in ^{9, 10} remain in place in the embryo far better than straight barriers. The distal flat side of the barrier sticks to the vitelline membrane and keeps the barrier in place (Figure 2C'). Careful preparation of hinge shaped barriers from aluminum foil as described in protocol step 1.6 is essential to the success of the operation. A second important step is to ensure that eggs are not left out of the incubator for too long following windowing and staging prior to operating on the embryo. In our experience, embryos survive an operation better if they are at or near incubation temperature when the operation is carried out. Operations should therefore be carried out as quickly as possible and the eggs resealed promptly to ensure good survival rates. Many researchers add a drop of antibiotics to the embryo following microsurgery before returning the eggs to the incubator. The presence of the liquid prevented the barriers from sticking well in position. Addition of antibiotic could also dislodge beads after placement. Therefore not using antibiotics, swift operations and good cleanliness with instruments is recommended to avoid infection. Wiping instruments with 70% ethanol following every stage of an operation is essential to prevent instruments from becoming sticky from contact with the vitelline membrane which can cause both barriers or beads to adhere to forceps (see protocol step 3.1.2.2). Both varieties of beads used could fall out of place following the operation. When the barrier position was checked the next day it was not possible to see through the barrier to ascertain whether the bead remained in place or not. In cases where the bead had fallen out wing bud outgrowth was not rescued (Table 1). Avoiding transferring liquid with the bead when implanting them means that beads stick more easily to the cut face of the LPM (see protocol 2.3.2.3). Finally ensuring that embryos are fixed immediately after harvesting is critical to good subsequent gene expression analysis (see protocol step 4.2).

This protocol modifies previously published experiments that used barriers to prevent limb bud initiation, defines specific optimum widths for barriers and introduces combining barrier and bead placement followed by gene expression analysis. We found using conventional aluminum foil, which is cheap and readily available in all labs, produces outcomes equal to those that previously used tantalum foil. The foil can be left in the embryo when carrying out in situ hybridization (Figure 2C') but we usually remove it if more than one embryo is being processed to prevent the sharp edges of the foil damaging embryos. Pilot studies demonstrated that the width of leg region barriers is particularly important. Initially the barriers trialed were too short and leg bud outgrowth was not prevented. 1.2-1.3 mm is the optimum width for a barrier to block leg bud outgrowth completely. The narrowest wing barriers that one can place accurately to prevent bud outgrowth give the best survival rates. This can be as narrow as 0.5-0.7 mm. However, barriers that are a little wider are more likely to result in complete blocking of wing bud outgrowth because they allow for a little inaccuracy of placement (we used 0.7-1 mm). Avoidance of blood vessels when making the incision is critical for wing bud level barriers. Semi-permeable barriers have previously been used to bisect the chick limb bud. MacCabe and Parker, 1976 and Summerbell, 1979 both used filters 0.45 µm and 0.8 µm pore size, respectively ^{16, 17.} They reported that diffusible signals could pass through the pores in the filters and that results gained using semi-permeable barriers were midway between a limb bud with no barrier present and one with an impermeable tantalum foil barrier. This protocol could be adapted to use semi-permeable barriers of varying pore size to differentiate candidate signals based on size or to modify the dynamics of signal diffusion.

This protocol has various limitations mainly associated with the model organism itself. Such techniques could be used to probe further questions in limb development and also other questions of vertebrate embryogenesis. A proviso is that the organ/area in question should be developing when the chick embryo is accessible to intervention. The presence of large blood vessels in the area where a barrier needs to be placed makes barrier placement later than stage 13 or 14 technically challenging. If large blood vessels are cut during barrier placement this can cause embryo mortality. Our investigation of when the transcription factors Tbx5 and Tbx4 are first induced in the LPM was limited by the earliest stage at which we could place a barrier that would later end up opposite either the wing or leg bud respectively. It could be illuminating to attempt to block Tbx gene induction at earlier stages, closer to gastrulation. The earliest a barrier could be placed in the presumptive wing region successfully was stage 8 and in the leg region stage 10. This protocol is probably not suitable for the study of gene expression beyond limb bud stages because subsequent rapid growth would displace the barrier and results would relate only to the initial position of the barrier.

Having related the limitations of the chick embryo in this context, its advantages over other vertebrate model organisms are many. The chick embryo is a very suitable animal model for this type of physical intervention in a vertebrate embryo. The embryos are relatively large and are easily accessible through the eggshell. One can return to the embryo for further experimentation (e.g., the removal of a bead ¹⁸ or even a barrier) or to check on progress by simply removing the tape window. There is possible scope to include live imaging or time lapse imaging. We describe a method of windowing chicken eggs that is particularly suited to operating on early stage embryos. In the case of limb studies it is very important and helpful that there is a contralateral control limb for every experiment that serves as an ideal internal control for each biological replicate.

The combination of using impermeable barriers to prevent limb outgrowth and beads soaked in signaling molecules has not been reported before. Our analysis of mRNA expression following such interventions is also novel. These techniques enabled us to dissect the difficult problem of when limb specific transcription factors Tbx5 and Tbx4 are induced in the LPM and also to show that later, prior to limb bud initiation, the presence of these Tbx genes in the LPM is not sufficient for the activation of Fgf10 transcription and the start of limb bud outgrowth. Figures 2G, 2D and 2E illustrate these findings well. The absence of Tbx4 expression following the insertion of a barrier at stage 10 in Figure 2G is in stark contrast to its presence in 2D and 2E following barrier insertion at stage 15, after the induction of Tbx4. The implantation of RA soaked beads facilitated the rescue of limb bud initiation following barrier insertion and so points to RA from the somites being essential in the LPM before limb bud outgrowth can begin. Such techniques could be used to solve further questions in limb development but also other questions of vertebrate embryogenesis. Areas of the brain, eye and trunk are likely to be suitable.

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont No. 5 watchmakers forceps, x2	Fine Science Tools  www.finescience.de	11251-20
Dumont No. 4 watchmakers forceps, x2	Fine Science Tools  www.finescience.de	11241-30
Dumont strong forceps, type AA	Fine Science Tools  www.finescience.de	11210-10
Curved scissors with blades 2.5 cm long	Fine Science Tools  www.finescience.de	14061-11
Blunt ended curved forceps, ends approx 0.5 cm long	Fine Science Tools www.finescience.de	11065-07
Steel pin, 0.2 mm wide	Fine Science Tools  www.finescience.de	26002-20
Sharpening stone, square	Fine Science Tools  www.finescience.de	29008-01
Mineral oil
Needle holder	Fine Science Tools  www.finescience.de	26016-12
Clear tape, 50 mm x 66 m	www.5staroffice.com	295985
FGF4 protein			A gift from Cliff Tabin.
all-trans-retinoic acid	Sigma www.sigmaaldrich.com	R2625-50MG	Remember to protect from light.
BMS 493	Sigma www.sigmaaldrich.com	B6688-5MG
Scalpel blade No. 15	www.swann-morton.com	cat no. 0105
Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel	Bio-Rad www.bio-rad.com	153-7301	Beads for delivering protein.
AG1-X2 Ion exchange resin	Bio-Rad www.bio-rad.com	140-1251	Beads for delivering RA or BMS 493.
Incubator for eggs	Memmert www.hce-uk.com	LAB128
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma www.sigmaaldrich.com	P6148-1KG	Harmful, irritant, corrosive.  Handle powder in fumehood with full protective clothing.
Ethanol	Sigma www.sigmaaldrich.com	32221-2.5L
DMEM, high glucose	Gibco www.thermofisher.com	41965-039	500 ml
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific webshop.fishersci.com	D/4121/PB08	500 ml
Binocular Microscope	Leica www.leica-microsystems.com	MZ6	Replaced by M60
Chicken eggs	Henry Stewart & Co Ltd sales@medeggs.com		Brown Eggs