Применение непроницаемых барьеров в сочетании с Factor кандидат замачивают шариков для изучения индуктивные сигналы в Chick

Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

Аннотация

Куриного эмбриона обеспечивает превосходную позвоночное модель, которая может быть использована для рассекают вопросы развития прямым способом. Его доступность и надежность после хирургического вмешательства являются ключевыми экспериментальные сильные стороны. Слюды пластины были первые барьеры , используемые для предотвращения куриных конечностей бутон инициацию ^1. Протоколы, которые используют алюминиевую фольгу в качестве непроницаемого барьера для крыла зародыше или индукции нога бутона и или инициации описаны. Мы сочетаем эту технику с размещением шарика сбоку от барьера к экзогенно кандидатов питания эндогенные факторы, которые были блокированы барьером. Результаты анализируют с помощью in - situ гибридизации последующей экспрессии генов. Наше основное внимание уделяется роли сигналов ретиноевой кислоты в индукции и последующего инициирования куриного эмбриона носовой и задней конечности. Мы используем BMS 493 (обратный агонист рецепторов ретиноевой кислоты (RAR)) замачивают бусы, имплантированные в боковой пластинке мезодермы (LPM), чтобы имитировать эффект бараRier помещается между сомитов (источник ретиноевой кислоты (RA)) и LPM, из которого растут почки конечности. Модифицированные версии этих протоколов также могут быть использованы для решения других вопросов о происхождении и сроках индуктивных сигналов. При условии, что область куриного эмбриона доступна на соответствующей стадии развития, барьер может быть помещен между двумя тканями и последующими изменениями в процессе развития изученных. Примеры можно найти в развивающемся головном мозге, расширение оси и в развитии органов, таких как печень или почки индукции.

Введение

Классические эмбриологи традиционно используются физические методы, чтобы допросить механизмы, контролирующие эмбриональное развитие. В 1960-е и 1970-е годы исследователи разработали методы, которые используются непроницаемые барьеры, вставленные между тканями развивающегося эмбриона, чтобы продемонстрировать важность индуктивных сигналов во время эмбриогенеза. Наш интерес в развитии позвоночных конечности и, в частности, какие события предшествуют конечности зачатка. Например, вставка барьера может предотвратить почки конечности отросток из происходящих на одной стороне куриного эмбриона, позволяя ему продолжить нормально на контралатеральной, неоперированных стороне. Материалы, используемые, чтобы сделать эти барьеры разнообразны; например, слюда пластин ¹ и тантал фольга ^2. Эти барьеры эффективно отделяют боковой пластинки мезодермы (LPM), из которого почки конечности формы, из сомитов, сформированная из приосевой мезодермы. Хирургические методы прививки показывают, что тесная связь остроумиеч сомитов имеет важное значение , если инициации зачатка конечности должно произойти в LPM ³ ^4. В 80-х и 90-х годах онтогенетики обнаружили диффундирующего молекулы, которые имеют важное значение для контроля процессов развития сигнализации. Бисер, пропитанные этих сигнальных молекул могут быть имплантированы в конкретных областях эмбриона и произвести изменения в эмбриональном развитии. Например, ретиноевой кислоты (RA) подхвачена обмена шариков ионов высвобождается в течение 24-часового периода при имплантации в куриных эмбрионах и может производить дублирование зеркальное отображение цифр ^5. Гепарин акриловые гранулы , содержащие белок FGF может инициировать конечности зачатка из interlimb LPM ^6.

Совсем недавно мыши и рыбы генетики приняли изучение инициации позвоночное конечности в новую эру (обзор ^7). Существует хорошее доказательство того, что RA присутствует в сомитов до начала зачатка конечности является существенным диффундирующего сигнала требует LPM инициировать почкование конечности. Мы хотели использовать доступность и экспериментальную надежность куриного эмбриона рассекать эффект барьера имплантации на экспрессию генов в LPM вокруг время инициации зачатка конечности. Роман адаптация нашего метода является то, чтобы объединить барьер, который блокирует сигналы от осевых тканей с размещением шарика сбоку от барьера к экзогенно кандидатов питания эндогенных факторов, которые были заблокированы барьером. Следующие протоколы, разработанные, чтобы дразнить из механизмов конечности индукции зачатка и инициации.

Изучение инициации зачатка конечности означает использование ранних эмбрионов стадии. Многие исследователи окно куриных яиц сначала удалением некоторых из альбумина через воздушный мешок с иглой для подкожных инъекций. Эмбрион, который лежит на верхней части желтка, затем лежать ниже в яйце. Это является преимуществом для некоторых способов, таких как электропорация, но может быть недостатком, если хирургического вмешательства эмбриона желательно.Мы находим, имеющие эмбрион как можно ближе к отверстию в яйце, насколько это возможно является преимуществом.

Вопросы остаются относительно сигналов, которые управляют позвоночное конечностей индукции бутон и инициирование и следующие протоколы подходят для их решения. Мы первыми разработали протокол для введения барьеров для предотвращения куриных конечностей зачатка на стадии ранней стадии , чем 12 ^8. Модифицированные версии этих протоколов также могут быть использованы для решения других вопросов о происхождении и сроках индуктивных киев, где доступная индуцирование ткань находится рядом с зачаток наводится. При условии, что область зародыша доступна на соответствующей стадии развития, то барьер может быть помещен между двумя тканями и последующими изменениями в процессе развития изученных. Примеры можно найти в развитии мозга, расширение оси и, возможно, органов развития, таких как печень или почки индукции.

протокол

Следующий протокол использует куриные эмбрионы в менее чем за десять дней инкубации. Все эксперименты проводились в соответствии с Королевского колледжа в Лондоне, Великобритании и руководящих принципов по уходу за животными в Великобритании Home Office.

1. Подготовка требуется до курином эмбрионе операции

Соберите следующие хирургические инструменты , необходимые для операций, для уборки и для фиксации куриных эмбрионов: Две пары № 5 часовщиков щипцов, одна пара сильных щипцов, например, типа AA, изогнутые ножницы с лезвиями длиной 2,5 см, тупыми изогнутая щипцы с концами примерно длиной 0,5 см, а также две пары № 4 часовщиков щипцов для использования, делая барьеров из фольги (1.6.3).
Сделать микро нож из стального штифта (0,3 мм в диаметре) заточены с использованием масла на точило. Используя бинокулярный микроскоп, заострить кончик пальца к плоской лопасти. Поместите штырь в держателе иглы и защитить его острый конец от постучал и денТед.
Примечание: Обшивка нож с 1000 мкл кончика пипетки является простым вариантом.
Готовят 70% этанола в пластиковой бутылке для стирки. Используйте шприц этого на бумажной салфеткой, чтобы вытереть хирургические инструменты и микро нож до и после использования, чтобы простерилизовать и очистить их.
Купить 5 см в ширину четкую липкую ленту и подходящий дозатор. Найти или изготовить остальное подходящее для хранения куриного яйца твердо стоит на своей стороне.
Сделайте и хранить решения для замачивания бисера.
1. Приготовьте 0,35 мг / мл раствора фактор роста фибробластов 4 (FGF4) белка от 1 мг / мл замороженной разбавлением его водой и хранят при -20 ° C в 30 мкл аликвоты.
2. Готовят растворы (или 0,05, или 0,1 мг / мл) полностью транс-ретиноевой кислоты (RA), разбавленного диметилсульфоксиде (ДМСО) в темных микропробирок от 5 мг / мл маточного а. Хранить запас и 100 мкл аликвоты при -20 ° С.
3. Готовят растворы (2,5 или 5 мг / мл) BMS 493 (обратная AGonist из RARs) разбавляли ДМСО в темноте микропробирок от 10 мг / мл маточного а. Хранить запас и 100 мкл аликвоты при -20 ° С.
Сделайте барьеры из алюминиевой фольги.
Примечание: Пленка используется для изготовления барьеров является стандартным питанием фольги (измеряется микрометром в 0,013 мм толщиной). Любой внутренний алюминиевая фольга, вероятно, будет подходящим.
1. Вырезать 1 см квадратный кусок алюминиевой фольги и стерилизовать его, протерев его 70% -ным этанолом на ткани. Поместите его на 6 см стерильной пластиковой чашке Петри. Отбросить крышку и сделать крышку для блюда из фольги.
  Примечание: Это позволит предотвратить разрезанные барьеры из позже прилипать к пластиковой крышке блюдо из-за статического.
2. Поместите чашку Петри на вершине стадии (1 сетки см длиной разделен на 100 участков) под бинокулярным микроскопом с увеличением, установленным в фактор 1.6. Использование No.15 лезвия небольшой скальпель, нарезать полосками фольги к точной шириной, например, 0,7 мм или 1,3 мм.
3. Отделите фольгуполосы с использованием двух пар № 4 часовщиков щипцов. Затем делают прямоугольный изгиб в центре фольги барьер таким образом, что она напоминает шарнир определенной ширины.
  Примечание: Эта форма барьера берется из ^{9, 10.} Шарнирное барьер остается на месте лучше, чем прямой, плоский барьер. № 4 пинцетом относительно тупыми и используются, потому что они имеют меньше шансов сделать вмятин или порезов барьеров из фольги.
4. Выстроить барьеров в центре чашки Петри с одной плоской против блюдо, а другой направлен вверх из блюда, перемещая оставшуюся режиссерский фольгу к одной стороне. Подготовьте 20 или более барьеров перед операцией дня. Поместите крышку из фольги над блюдом и хранить барьеры в месте, где они не будут беспокоить.
  Примечание: Даже небольшое стук может склонить чашу барьеры более или означают, что они торчат со статическим по бокам тарелки.
Выдержите оплодотворенные куриные яйца на боку на картонных яичных лотков на 38 °С в течение соответствующего периода времени до операционного дня таким образом, что эмбрионы будут находиться на нужной стадии ^8.

2. Приготовление куриных эмбрионах и бусами на день операции

'Окно' инкубированы куриные яйца.
Примечание: Следующий метод для открытия яиц был принят на Дениса Summerbell (не опубликовано).
1. С яйцо, лежа на боку, проколоть тупым концом (воздух концевой НКК) яйца типа АА сильные пинцетом, убедившись, что внутренняя оболочка оболочка была нарушена. Для этого нужно понять пинцет прочно скрепленных между собой и использовать управляемое движение проникающий, держа яйцо с свободной рукой.
2. Возьмите яйцо, все еще лежа на боку, в обеих руках (один по обе стороны) повернуть его на 180 ° по горизонтальной оси и заменить ее в лоток яиц таким образом, чтобы сторона, которая была самой верхней теперь рядом с подносом.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Это ослабляет эмбрион из мембран оболочки и будет означать, что эмбрион леSS, вероятно, быть разрезаны, когда оболочка выше эмбриона удаляется.
3. Возьмите кусок ленты ясной приблизительно 5 квадратных см и придерживаться этого близко над самой верхней поверхности яйца, чтобы остановить скорлупу от распада на эмбрион, когда яйцо открывается.
4. Используйте изогнутые ножницы, чтобы аккуратно прорвать оболочку и ее мембран в центре верхней части яйца, сделать очень маленькое отверстие с одним лезвием ножниц, так что воздух может попасть в яйцо над эмбрионом (который лежит прямо под верхняя часть оболочки).
  Примечание: По просто разорвать оболочки мембраны и не нарушая любой из мембран охватывающих эмбрион, воздух, поступающий в яйцо отделит эмбриона из оболочки и эмбрион уткнуться в верхней части желтка около 0,5-1 см от оболочки ,
5. Используйте изогнутые ножницы, чтобы увеличить отверстие в оболочке в круг диаметром примерно 1 см. Удалите часть вырезанной оболочки и закройте отверстие в яйцо скусок прозрачного ленты примерно 5 см кв. Чтобы легко удалить эту ленту, нажмите на ленту, чтобы вставить его только на губе отверстия, оставляя оставшуюся ленту бесплатно. Свободной ленты, то можно понять, чтобы запечатывать яйцо.
эмбрионы Сценическое
1. После инкубации при 38 ° С (см шаг 1.7) и (этап оконной 2.1), использовать бинокулярный микроскоп , чтобы поставить на куриных эмбрионах по ^8. Делайте это как раз перед яйца запечатаны следующие оконного. Написать стадии каждого эмбриона на яичной скорлупы. Возвращение яйца в инкубатор.
  Примечание: Эмбрионы на этапах от 8 до 15 пригодны для барьерных и бортов экспериментов. Эмбрионы, более вероятно, чтобы выжить, если они не были исключены из инкубатора слишком долго до операции.
Замачивания бисер перед началом работы.
1. FGF4
  1. Возьмем число аффинной хроматографии гранул геля (150-300 мкм), которые прилипают к концу 1000 мкл кончика пипетки и былоч их в 1 мл фосфатным буферным раствором (PBS) в микроцентрифужных трубки для удаления азид они хранятся в. Центрифуга в течение 5 секунд, удалите PBS и повторить процесс дважды.
  2. Замачивание гелевые шарики в капле 30 мкл 0,35 мг / мл белка FGF4 на стерильную чашку Петри на льду в течение 30 мин. Pick бусинки примерно 150 мкм в диаметре с N 5 microforceps для вставки в эмбрионе.
    Примечание: Ручка ионными шарики ионообменной смолы, используемые в следующих шагах с № 5 microforceps и сцепление их очень мягко, потому что шарики являются хрупкими и могут разрушаться, если слишком сильно сжал. Это предупреждение относится к 2.3.2-2.3.3 и все операции по смоляной шарик.
2. Р.А.
  1. Размораживание аликвоты 0,05 или 0,1 мг / мл все-транс-RA разбавляют ДМСО и поместить каплю 100 мкл на стерильную чашку Петри (диаметром 9 см), которая ранее была покрыта фольгой для защиты от света RA. Возьмите 10 мкл кончиком пипетки и подобрать какой-либо форме хлорида ионного обменаГранулы смолы на его конце и замочить их в капле РА защищенном от света месте при комнатной температуре в течение 20 мин.
  2. Промыть бусин в трех последовательных капель 100 мкл Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), расположенных на той же чашки Петри, по меньшей мере 1 см друг от друга.
    Примечание: Шарики занимают фенол красный краситель из DMEM. Этот метод основан на ^5.
  3. Pick шарики приблизительно 100 мкм в диаметре (шарики в диапазоне размеров от 75-180 мкм во влажном состоянии) для вставки в эмбрионе, используя столик микроскопа координатной сетки слайд под чашку Петри и No.5 microforceps держать бусинки. Поднимая шарик из капли 100 мкл DMEM, прежде всего шарик вниз на чашку Петри и удалите оставшуюся DMEM из него либо толкая шарик из капли или путем размещения закрытых щипцов рядом с буртиком (капилляр действие рисует жидкость от борта).
3. BMS 493
  1. Что касается RA (2.3.2), замочить ионов СПЕЦAnge гранулы смолы в капле 100 мкл 2,5 или 5,0 мг / мл BMS 493 в ДМСО при комнатной температуре в течение 20 мин, затем прополоскать в 100 мкл капель DMEM. Pick бусинки примерно 100 мкм в диаметре для вставки в эмбрионе.
4. контроль ДМСО
  1. Что касается RA (2.3.2), замачивание ионообменная смола бусин в капле 100 мкл ДМСО при комнатной температуре в течение 20 мин, затем прополоскать в 100 мкл капель DMEM. Pick бусинки примерно 100 мкм в диаметре для вставки в эмбрионе.

3. Операции Барьерные и бисера

figure-protocol-9757
Рисунок 1. Схематическое куриных эмбрионов различных стадий , показывающие , где барьеры и или бусы должны быть размещены. (A) Уровень 13 куриного эмбриона положение схематически показывает барьер (зеленая линия) между сомитов и LPM на presumpный уровень крыла (сомитов 15-20). (Б) То же, что и в схематической (а), что указывает , где шарик RA (красный круг) должен быть помещен перед введением барьера. (C) положение Схематическое изображение барьера (зеленая линия) на вмененный уровне ног (сомитов 26-32) в стадии 15 эмбриона. (D) , ту же схему, что и в (С), что указывает , где должны быть размещены шарик RA (красный круг). (Е) Схема с указанием , где BMS 493 бусин (фиолетовые кружки) должны быть помещены в LPM этапа 15 эмбрионов. (F) Принципиальная схема куриного эмбриона стадии 9 , указывающей положение барьера (зеленая линия) между пресомитной мезодермы и LPM на вмененный уровне крыла. (G) Принципиальная схема стадии 9 эмбриона , показывая позиции барьера (зеленая линия) и шарик RA (красный круг). (H) Принципиальная схема стадии 10 куриного эмбриона , показывающий положение барьера (зеленая линия) на вмененный уровне ног. (I ) Принципиальная электрическая схема, показывающая BMS 493 позиций шарик (фиолетовый круг) в стадии 10 уровня ноги LPM. Эта цифра была изменена с ^7. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Барьер вставляется на стадии 13, чтобы предотвратить бутон инициацию крыла.
1. Возьмите стадия 13 эмбрионов из инкубатора и поместить яйцо на яйцо остальное под бинокулярным микроскопом, установленным в 3.2x увеличением или выше, если предпочтительнее. Снимите верхний слой прозрачного ленты.
  1. Использование стальной микро нож, сделать разрез через желточной оболочки и боковая пластина мезодермы (LPM) , примыкающей к сомитов 15 до 20 (Фигура 1А) на правой стороне эмбриона (сомитов не все сформированы на данном этапе). Вырезать рядом с последних четырех сомитов, образованных и продолжить вырезать две длины сомитных каудально.
  2. Возьмите барьер (широкий 0.7-1 мм) с 5 microfo No.rceps в конце выступающую из чашки Петри и скрутить руки, чтобы вставить свободный конец барьера в разрез. Образный шарнир барьера лежит плоско на желточной оболочки над LPM с половиной его выступающими вниз через разрез дистально по отношению к сомитов. Как можно скорее запечатать яйцо с лентой и ясном вернуть его в инкубатор.
    Примечание: Микро нож и пинцет становятся липкими при контакте с желточной оболочки. Важно, чтобы начисто вытрите их 70% этанолом перед попыткой последующей операции. Это относится и ко всем последующим описанием работы и шарик имплантаций.
  3. Если шарик должен быть вставлен в сочетании с барьером; во - первых, возьмите шарик в № 5 microforceps и вставить его в вырез поверхности LPM на дистальной стороне разреза , а затем вставьте барьер в разрез проксимальнее борта (рис 1В). Печать яйцо и вернуть его немедленно в инкубатор.
Барьер вставляется на стадии 15, чтобы предотвратить ноги инициации бутонов.
Примечание: Пример результата этой операции на экспрессию Tbox 4 фактора транскрипции (Tbx4) показана на рис 2D и 2Е.
1. Возьмите стадия 15 эмбрионов из инкубатора и поместить яйцо на яйцо остальное под бинокулярным микроскопом, установленным в 3.2x увеличением или выше, если предпочтительнее. Снимите верхний слой прозрачного ленты.
  1. Использование стальной микро нож надрезают через желточной оболочки и LPM , примыкающей к сомитов 26 до 32 (фиг.1С) с правой стороне эмбриона (сомитов не все сформированы на данном этапе). Вырезать рядом с последних двух сомитов, образованных и продолжают длины сомитных вырезать пять каудально.
  2. Возьмите барьер (широкий 1,2-1,3 мм) с № 5 microforceps на одном конце и скрутить барьер, чтобы вставить свободный конец в разрез. Как можно скорее запечатать яйцо с прозрачной лентойй вернуть его в инкубатор.
    Примечание: Петля образный барьер лежит плоско на желточной оболочки над LPM с половины его выступающими вниз через разрез дистально по отношению к сомитов.
  3. Если шарик должен быть вставлен в сочетании с барьером, во-первых, возьмите шарик в № 5 microforceps и вставить его в вырез поверхности LPM на дистальной стороне разреза, а затем вставьте барьер в разрез проксимальнее шарик (рис 1D). Печать яйцо и вернуть его немедленно в инкубатор.
  4. Если шарик или шарики должны быть вставлены без барьера, например, BMS 493 бусин к ноге области на этапе 15, не делают длинный разрез (3.2.2.1). Сделайте небольшой надрез через желточной оболочки и в LPM в положении шарик должен быть помещен. Возьмите шарик в № 5 microforceps и вставить его в отверстие в LPM. Нажмите ее немного дальше с закрытыми концами пинцета (рис 1E).
Барьер вставляется на стадии 9, чтобы предотвратить крыла индукции бутон и инициации.
1. Возьмем этап 8 или 9 эмбриона из инкубатора и поместить яйцо на яйцо остальное под бинокулярным микроскопом, установленным в 3.2x увеличением или выше, если предпочтительнее.
  1. Используя стальной нож микро надрезают через желточной оболочки и LPM боковой и ростральной к первичной полоски, на каудальном конце эмбриона в соответствии с сомитов (рис 1F) около 5 сомитов длины долго.
  2. Возьмите барьер (широкий 0,7-1 мм) с № 5 microforceps в конце выступающую из чашки Петри и скрутить руки, чтобы вставить свободный конец барьера в разрез. Как можно скорее запечатать яйцо с лентой и ясном вернуть его в инкубатор.
    Примечание: Петля образный барьер лежит плоско на желточной оболочки над LPM с половины его выступающими вниз через разрез.
  3. Если шарик должен быть inserted в сочетании с барьером; во - первых, возьмите шарик в № 5 microforceps и вставить его в вырез поверхности LPM на дистальной стороне разреза , а затем вставьте барьер в разрез проксимальнее борта (рис 1G). Печать яйцо и вернуть его немедленно в инкубатор.
Барьер вставляется на стадии 10, чтобы предотвратить ногу индукцию бутон и инициацию.
Примечание: Пример результата этой операции на экспрессию Tbx4 показана на рисунке 2G.
1. Возьмите стадия 10 эмбрионов из инкубатора и поместить яйцо на яйцо остальное под бинокулярным микроскопом, установленным в 3.2x увеличением или выше, если предпочтительнее.
  1. Используя стальной микро нож сделать надрез через желточной оболочки и LPM сбоку от первичной полоски, на каудальном конце эмбриона в соответствии с сомитов (рис 1H) приблизительно 6 сомитов большой длины.
  2. Возьмите барьер (1.2мм шириной) с N 5 microforceps в конце выступающую из чашки Петри и скрутить руки, чтобы вставить свободный конец барьера в разрез. Как можно скорее запечатать яйцо с лентой и ясном вернуть его в инкубатор.
    Примечание: Петля образный барьер лежит плоско на желточной оболочки над LPM с половины его выступающими вниз через разрез.
  3. Если шарик должен быть вставлен без барьера, например, BMS 493 шарик в области ног на этапе 10, делают небольшой надрез через желточной оболочки и в LPM в положении шарик должен быть помещен. Возьмите шарик в № 5 microforceps и вставить его в отверстие в LPM. Нажмите ее немного дальше с закрытыми концами пинцета (рис 1и).
24 ч или более после работы проверьте положение барьера по сравнению с формирующейся контралатеральной почки конечности. Откажитесь от любых эмбрионов, в которых барьер явно не opposIte левой почки конечности. В этом случае барьер был ошибочно установлен.

4. Заготовка Эмбрионы, Фиксирование и подготовка к Wholemount В гибридизация (WISH)

Сбор эмбрионов послеоперационный.
1. Урожай эмбрионов на стадии 19-23 таким образом, что зачатка конечности морфология отчетливо видна в обоих оперированных и контралатеральной стороны управления.
  1. Используя изогнутые ножницы вырезать большое отверстие в скорлупе. Сокращение вокруг зародыша, держа большой кровеносный сосуд слева от зародыша с microforceps. Используйте этот захват судна, чтобы удалить эмбрион и поместить его в чашку Петри фосфатно-солевого буфера (PBS), рН 7,3.
  2. Под бинокулярным микроскопом, отсечь лишние эмбриональных сосудов и мембран с использованием комбинации изогнутыми ножницами и нет. 5 microforceps. Снимите головку с помощью ножниц.
Фиксирование эмбрионов отправлять заготовки.
1. Используя изогнутый blunт щипцов, поднимите эмбрион и поместить его в 5 мл 4% параформальдегида (PFA) в PBS при комнатной температуре в течение двух ч качалки, а затем при температуре 4 ° С в течение ночи в стеклянной бутылке 20 мл с завинчивающейся крышкой.
  Внимание: PFA представляет собой серьезную опасность для здоровья. Это вредно, коррозионные раздражителем и порошок должен быть предотвращен в контакт с кожей, глазами и легкие. Использовать индивидуальную защитную одежду и вытяжку во время приготовления раствора. После того, как это 4% раствор, перчатки, защитные очки и пальто лаборатории должны носить.
  Примечание: Важно, чтобы получить эмбрионы в быстро исправить, чтобы наилучшим образом сохранить целостность мРНК.
Устранение барьеров предшествующих Wholemount in - situ гибридизации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Барьеры удалены , поскольку они очень острые и могут повредить эмбрионов , как они идут через протокол гибридизация, особенно если несколько эмбрионов окрашивают сразу.
1. После фиксации, поместить эмбрион в чашке ФБР под бинокулярным миcroscope.
2. Используя две пары № 5 microforceps, поместите левую пару близко обе стороны барьера в прооперированной стороне эмбриона. Возьмитесь барьер с правой парой и осторожно потяните барьер из эмбриона, используя левую пару, чтобы сохранить эмбрион вниз и предотвратить любую ткань от присоединения к барьеру, как он удаляется.
Проводят WISH по существу , как описано в ^11.

Результаты

Протокол подробно описано выше описаны методы , используемые в Нишимото и др. , 2015. В статье рассматриваются конечности индукцию бутон и инициацию в обоих передних и задних конечностей куриного эмбриона. Результаты следующие вставки непроницаемых барьеров для предотвращения вырост передних конечностей зародыше были опубликованы ранее ^{1, 2, 9} , но там было только одно исследование , описывающие барьеры , мешающие ноги бутон инициацию ^1. Задней конечности данные Нишимото и соавт. , 2015 представлены здесь в качестве репрезентативных результатов исследования экспрессии мРНК после введения барьера.

Tbx4 Выражение в LPM не достаточно, чтобы инициировать задних конечностей вырост:
Фигуры 2В и С (таблица 2) показывают , что введение барьера на этапе 15 (фиг.2А) (см протокол 3.2) приводит как Fgf10и выражение Fgf8 отсутствуя в области ног бутона (обозначенном скобкой) на прооперированной правой стороне. Сравните с неоперированных левой стороны. Однако экспрессия Tbx4 наблюдается на обоих стадии 19 и стадии 23 на оперированной стороне (рис 2D и E). Мы пришли к выводу , что Tbx4 выражение само по себе не достаточно , чтобы инициировать разрастание задних конечностей от LPM. Другие исследования , проведенные в куриных предположили , что экспрессия гена TBX достаточно , чтобы инициировать образование передних конечностей почки ^{12, 13.}

Рисунок 2С 'включен для иллюстрации того, как барьер выглядит вложена в ногу области эмбриона пост фиксации. В большинстве случаев барьеров были удалены перед гибридизация (протокол 4.3).

RA из сомитов Essential в LPM до Fgf10 Индуцирует Limb Bud Outgrowth:
На фиг.3А схематически представляющая добавление смазанной РА бисерной дистальнее барьер , вставленной на стадии 15 (протокол 3.2.1.3). После этой операции конечности зачатка (обозначается звездочкой) наблюдается на оперируемой справа и Tbx4, Fgf10 и Fgf8 выражаются в зародыше , поскольку они находятся в контрольной левой стороне (рис 3B, C и D, таблица 2) , Таким образом, добавление RA к LPM преодолевает эффект барьера и конечностей инициации бутон продолжается. Мы пришли к выводу, что при нормальном развитии РА из сомитов имеет важное значение в LPM, прежде чем конечности зачатка может быть начато. Полученные в результате почки задних конечностей, как правило, меньше, чем на контрольной стороне. Это может быть связано с дозой РА в ЛПМ быть не эквивалентен типу ситуации дикого. Если доза RA слишком высока апикальной Эктодермальная хребет (AER) может быть сокращен и меньшие почки приведет^{14, 15.}

Для того, чтобы подтвердить, что RA (от сомитов) в LPM необходим для нормальной почки конечности инициации обратного агониста RAR, BMS 493, был использован. Бусины имплантируют в ногу область LPM на этапе 15 (см протокол 3.2.1.4) (Рисунок 3E). Выражение Fgf10 подавляется следующее применение BMS 493 бусин в LPM, что приводит к более мелких задних конечностей почек по сравнению с контрольной стороной (рис 3F; Таблица 3). Контроль ДМСО шарики не вызывают эти дефекты (фигуры 3G и 3H; таблица 3). Дефекты наблюдались следующие BMS 493 приложения мягче, чем те, индуцированное операцией барьера; т.е. Fgf10 по - прежнему выражается и образуются зачатки конечностей. Это, вероятно, будет, потому что эффекты BMS 493 ограничены локально вокруг бортов и не может быть в состоянии противодействовать все RA произведенный AxiAl тканей.

Раннее Осевые сигналы Укажите LPM клетки , которые позже Ускоренная Tbx4:
Мы проверили , когда LPM приобретает способность выражать Tbx4 в ноге формирования региона перспективной. Самая ранняя стадия, на которой барьер может быть вставлен, который будет впоследствии блокировать ноги зачатка, является стадия 10. Мы первыми разработали протокол для вставки барьеров на этапах раньше стадии 12. Барьеры, вставленные между приосевой мезодермы и презумптивной ногу LPM на этапе 10 (см протокол 3.4) формирование блока ноги бутон и экспрессию Tbx4 в ноге формирования LPM (фигуры 2F и 2G, таблица 2), предполагая , что сигнал от осевых тканей на стадии 10 требуется для последующего выражения Tbx4 в LPM задних конечностей. Сравните этот результат с цифрами 2D и E , где вставка позже барьер обеспечивает экспрессию Tbx4который будет создан. Кроме того, мы проверили , может ли это быть осевым сигнал RA, наблюдая , уменьшает ли обратный агонист RAR выражение Tbx4. BMS 493 шарик помещается в задней конечности LPM на этапе 10 (см протокол 3.4.1.3) выражение Tbx4 подавляет (цифры 2H и 2i), тогда как контрольные шарики , смоченные в ДМСО не влияют на экспрессию Tbx4 (Рисунки 2J и 2К). Вместе эти результаты подтверждают модель , что сигнал RA от осевых тканей регулирует индукцию конечностей за счет положительного регулирования Tbx4 в задней конечности LPM ^7.

Послеоперационный смерти:
В таблицах 1, 2 и 3 дают подробности экспериментальных результатов , включая число куриных эмбрионов , которые умерли пост операции и до уборки урожая. Некоторые случаи смерти следует ожидать после микрохирургии этой природы. Числа умирающих могут быть сохранены до минимума, убедившись, что инструменты чистые, отверстие в яйце является минимальный размер, необходимый, что эмбрионы остались без защиты липкого уплотнения ленты в течение минимального времени и, в сочетании с этой последней точки, что операция осуществляется как можно быстрее. Ни одна из этих операций не очень много времени, но операции с участием бусин и барьеров занять немного больше времени. Несмотря на эти меры, операции, осуществляемые на самых ранних стадиях и в этом регионе крыла, скорее всего, приведет к смерти. Есть крупные кровеносные сосуды вокруг конечности формирования областей и случайного разрыва этих сосудов может привести к смерти из-за потери крови. Мы находим, что яйца открыли на стадии 8 или 9, чьи эмбрионы не оперировал, часто умирают на следующий день. Таким образом, единственным решением этих проблем провести большое количество экспериментов.

d / 54618 / 54618fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Маркер экспрессии генов Изменения следующие Барьер или гранула Вставка на Фиксированный уровень ног. (A) положение Схематическое изображение барьера (зеленая линия) на пробное уровне ноги (сомитов 26-32) в стадии 15 эмбриона. (B - E и G) анализ WISH на эксплуатируемых эмбрионов. Нога область указано (скобки). Выражение Fgf10 (В) отсутствует в оперируемой LPM, но надёжная выражение обнаруживается в левой почкой. Выражение Fgf8 (C) отсутствует в оперированной стороне, предполагая , что нет AER. (С ') То же эмбрион до барьера был удален. (D) Tbx4 выражается в LPM в то же ростро-каудальном уровне управления зародыше. Выражение Tbx4 (E) сохраняется в правой ноге области , несмотря на отсутствие роста конечностей. (F) Принципиальная схема стадии 10 куриного эмбриона, показывающий положение барьера (зеленая линия) на вмененный уровне ног. (G) выражение Tbx4 отсутствует в оперируемой правой LPM (кронштейн). (H) Принципиальная схема стадии 10 куриного эмбриона , показывая BMS 493 шарик позиции (фиолетовый круг) на вмененный уровне ног. Выражение Tbx4 (I) подавляется на оперируемой правой стороне после обработки BMS 493. (J) схема стадии 10 куриного эмбриона , показывая контроль положения ДМСО шарик (серый круг). (К) Tbx4 экспрессируется на оперированной правой стороне на том же уровне, что в контрольной левой стороне после обработки только ДМСО. Эта цифра была изменена с ^7. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

d / 54618 / 54618fig3.jpg "/>
Отсутствие Рисунок 3. Спасает RA лимба Бада Вызванный Барьерный вставки и имеет важное значение в LPM До начала Leg зачатка. (A) Принципиальная схема , обозначающая положение барьера (зеленая линия) на вмененный уровне ног (сомитов 26-32) и RA-пропитанной шарик (красный круг). (B - D) RA выручает нога зачатка (показано звездочкой). (B) выражение Tbx4 присутствует в спасенной зародыше ноги аналогично неоперированного стороне. (C) Fgf10 выражается в спасенной ноге Бутон похож на неоперированного стороне. (D) Fgf8 выражается в AER из спасенных правой почкой ноги. (Е) Схема с указанием , где BMS 493 бусин (фиолетовые кружки) были помещены в презумптивной LPM ноги сценических 15 эмбрионов. Выражение Fgf10 (Р) подавляются на оперируемой правой стороне и почка нога мала следующая BMS 493 лечение. Шарики звездочкой. (G) Аналогичные схемы в (Е), указывающей положение контрольных ДМСО бусин (серые кружки). (H) ДМСО бисер (показаны звездочками) не влияет на экспрессию Fgf10 или размер ноги бутон. Эта цифра была изменена с ^7. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Этап барьер , помещаемых (+ шарик) *	Номер работает	Крыло отсутствует **	Крыло присутствует **	Количество умерших
Стадия 12-14	40	24	1	15
Стадия 8/9	65	23	0	42
Стадия 12-13 (FGF4 шарик)	41	7 (шарик отсутствует)	17	17
Стадия 12-13 (шарик RA)	75	9 (шарик отсутствует)	32	34
Этап 13 (контрольный шарик)	5	3	0	2
* 0,7-1 мм барьеры фольги, помещенные между сомитов 15-20 и латеральной пластинке мезодермы. 0,35 мг / мл FGF4 шарик. 0,05-0,1 мг / мл RA шарик.
ДМСО контроль шарик.
** куриных эмбрионов фиксированные этапы 21-23

Таблица 1. Уровень крыла Барьер и бисера Эксперимент Результаты.

Этап барьер , помещаемых (+ шарик) *	Номер работает	Ножка отсутствует **	Нога присутствует **	Количество умерших
Стадия 12-15	43	39	0	4
Стадия 10/11	23	16	0	7
Этап 15 (FGF4 шарик)	8	0	5	3
Этап 15 (RA шарик)	18	0	18	0
* 0,7-1,3 мм барьеры фольги, помещенные между сомитов 26-32 и латеральной пластинке мезодермы. 0,35 мг / мл FGF4 шарик. 0,05-0,1 мг / мл RA шарик.
** куриных эмбрионов фиксированные этапы 18-24

Таблица 2. Нога Уровень Барьер и бисера Эксперимент Результаты.

Номер работает	Нога бутон маленький	Нога бутон немного мал	Нога бутон нормальный размер	Количество умерших
BMS 493 бусин *
15	12	3	0	0
ДМСО бисер **
12	0	3	9	0
* 2-3 шарики, смоченные в дозе 5 мг / мл BMS 493 помещается в правой стадии 14-15 LPM на уровне ног.
** 2-3 шарики, смоченные в ДМСО одиночку помещали в правой стадии 15 LPM на уровне ног.
Куриных эмбрионов фиксируется на стадии 17-19.

Таблица 3. Нога Уровень BMS 493 из бисера Эксперимент Результаты.

Обсуждение

Описано применение непроницаемых барьеров для предотвращения образования бутонов конечности у куриного эмбриона. Этот метод имеет ряд важных шагов. После предварительных экспериментов, мы обнаружили , что в форме шарнирных барьеры , используемые в ^{9, 10} остаются на месте в эмбрионе гораздо лучше , чем прямых барьеров. Дистальный плоская сторона барьера прилипает к желточной оболочки и удерживает барьер на месте (рис 2с '). Тщательное приготовление шарнирных образных барьеров из алюминиевой фольги, как описано в стадии протокола 1.6 имеет важное значение для успеха операции. Второй важный шаг для того, чтобы яйца не осталось из инкубатора слишком долго следующие постановки и оконной до начала работы на эмбрион. По нашему опыту, эмбрионы выживают операции лучше, если они находятся на или вблизи температуры инкубации, когда операция выполняется. Поэтому операции следует проводить как можно быстрее и яйца закупорить запросLY обеспечить хорошие показатели выживаемости. Многие исследователи добавляют каплю антибиотиков к эмбриону следующие микрохирургии перед возвратом яйца в инкубатор. Наличие жидкости предотвращается барьеры от прилипания хорошо в заданном положении. Добавление антибиотика может также сместить шарики после размещения. Поэтому не используя антибиотики, быстрые операции и хорошую чистоту с инструментами рекомендуется, чтобы избежать инфекции. Вытирая инструменты с 70% этанола после каждой стадии операции имеет важное значение для предотвращения инструментов стать липкими от контакта с желточной оболочки, которые могут вызвать оба барьера или шарики придерживаться щипцов (см шаг протокола 3.1.2.2). Обе разновидности бисера, используемых может выпасть из места после операции. Когда положение барьера проверялся на следующий день не было возможности видеть через барьер, чтобы выяснить, остались ли шарик на месте или нет. В тех случаях, когда поссорился бортовое крыло зачатка не был спасен ( Таблица 1). Во избежание перемещения жидкости с буртиком при их имплантации означает, что шарики придерживаться более легко с разрезанной поверхности LPM (см протокол 2.3.2.3). Наконец гарантируя, что эмбрионы фиксируются сразу после сбора урожая имеет решающее значение для хорошего последующего анализа экспрессии генов (см шаг протокола 4.2).

Этот протокол изменяет ранее опубликованных экспериментов, которые использовались барьеры для предотвращения бутон инициации конечности, определяет конкретные оптимальные ширины для барьеров и вводит сочетающую барьер и размещение шарика с последующим анализом экспрессии генов. Мы обнаружили, используя обычную алюминиевую фольгу, которая является дешевым и легко доступны во всех лабораториях, дает результаты, аналогичные тем, которые ранее использовали титановую фольгу. Фольга может быть оставлена в эмбрионе при проведении гибридизация (рис 2с ') в , но мы обычно удалить его , если более чем один зародыш обрабатывается , чтобы предотвратить острые края фольги повреждающего эмбрионов. пIlot исследования показали, что ширина области ног барьеров является особенно важным. Первоначально барьеры опробована были слишком коротки и нога зачатка не была предотвращена. 1,2-1,3 мм оптимальная ширина для барьера, чтобы полностью блокировать ноги зачатка. Самые узкие барьеры крыла, которые можно разместить точно, чтобы предотвратить зачатка дают лучшие показатели выживаемости. Это может быть столь же узкие, как 0,5-0,7 мм. Тем не менее, барьеры, которые немного шире, скорее всего, приведет к полному блокированию зачатка крыла, потому что они позволяют немного неточностью размещения (мы использовали 0,7-1 мм). Избежание кровеносных сосудов, делая надрез имеет решающее значение для барьеров на уровне крыла бутон. Полупроницаемых перегородок использовались ранее для рассекают почку куриных конечностей. МакКейб и Паркер, 1976 и Summerbell, 1979 оба использовали фильтры 0,45 мкм и размером пор 0,8 мкм, соответственно ^{16, 17.} Они сообщили , что диффундирующие сигналы могут проходить через поры в фильтрах и чторезультаты, полученные с использованием полупроницаемых барьеров были на полпути между зачатка конечности, без барьера настоящего и один с непроницаемым барьером танталовой фольги. Этот протокол может быть адаптирован для использования полупроницаемых барьеров различного размера пор дифференцировать сигналы-кандидатов на основе размера или изменить динамику диффузии сигнала.

Этот протокол имеет различные ограничения, в основном связанные с самой моделью организма. Такие методы могут быть использованы для исследования дополнительные вопросы в развитии конечностей, а также другие вопросы позвоночного эмбриогенеза. Оговориться, что орган / область в вопросе должна развиваться, когда куриного эмбриона доступна для вмешательства. Наличие крупных кровеносных сосудов в районе, где барьер должен быть помещен делает размещение барьера позднее стадии 13 или 14 технически сложной. Если крупные кровеносные сосуды вырезают во время размещения барьера это может привести к эмбриональной смертности. Наше исследование , когда факторы транскрипции TBX5 и Tbx4 сначала наведенный в LPM была ограничена самой ранней стадии , на которой мы могли бы поставить барьер , который позже в конечном итоге либо напротив крыла или ноги бутон соответственно. Это может быть поучительно пытаться блокировать индукцию генов TBX на более ранних стадиях, ближе к гаструляции. Самый ранний барьер может быть помещен в презумптивной области крыла успешно был этап 8 и в области ног этапе 10. Этот протокол, вероятно, не подходит для изучения экспрессии генов вне стадии почки конечности, так как последующий быстрый рост будет вытеснять барьер и результаты будет относиться только к исходному положению барьера.

Отнеся ограничения куриного эмбриона в этом контексте, его преимущества по сравнению с другими позвоночными модельных организмов много. Куриного эмбриона является очень подходящая животная модель для этого типа физического вмешательства у позвоночного животного эмбриона. Эмбрионы являются относительно большими и легко доступны throuGh яичной скорлупы. Можно вернуться к зародышу для дальнейших экспериментов (например, удаление шарика ¹⁸ или даже барьер) или для проверки прогресса путем простого удаления окна ленты. Существует возможный масштаб для включения живых изображений или изображений промежутка времени. Описан метод оконного куриных яиц, что особенно подходит для эксплуатации на ранних эмбрионов стадии. В случае исследований конечностей, очень важно и полезно, что существует контралатеральной контроль конечности для каждого эксперимента, который служит идеальным внутреннего контроля для каждой биологической повторности.

Сочетание использования непроницаемых барьеров для предотвращения разрастание конечностей и шарики, смоченную в сигнальных молекул не сообщалось ранее. Наш анализ экспрессии мРНК следующих таких вмешательств также роман. Эти методы позволили нам вскрыть сложную проблему , когда конечности специфические факторы транскрипции Tbx5 и Tbx4 наводятся в LPM , а такжечтобы показать , что позже, до почки конечности инициацию, присутствие этих генов TBX в LPM не является достаточным для активации транскрипции Fgf10 и началом конечности зачатка. Рисунки 2G, 2D и 2E иллюстрируют эти выводы хорошо. Отсутствие экспрессии Tbx4 после введения барьера на этапе 10 на рисунке 2G находится в резком контрасте с его присутствием в 2D и 2Е следующей вставки барьера на этапе 15, после индукции Tbx4. Имплантация пропитанных РА шариков способствовало спасению бутон инициации конечности следующей вставки барьера и так указывает на RA из сомитов имеет существенное значение в LPM, прежде чем конечности зачатка может начаться. Такие методы могут быть использованы для решения дальнейших вопросов в развитии конечностей, но и другие вопросы позвоночного эмбриогенеза. Области мозга, глаз и туловища, вероятно, будут пригодны.

Раскрытие информации

The authors declare they have no competing financial interests.

Благодарности

This work was funded by MRC grant MC.PC_13052.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont No. 5 watchmakers forceps, x2	Fine Science Tools www.finescience.de	11251-20
Dumont No. 4 watchmakers forceps, x2	Fine Science Tools www.finescience.de	11241-30
Dumont strong forceps, type AA	Fine Science Tools www.finescience.de	11210-10
Curved scissors with blades 2.5 cm long	Fine Science Tools www.finescience.de	14061-11
Blunt ended curved forceps, ends approx 0.5 cm long	Fine Science Tools www.finescience.de	11065-07
Steel pin, 0.2 mm wide	Fine Science Tools www.finescience.de	26002-20
Sharpening stone, square	Fine Science Tools www.finescience.de	29008-01
Mineral oil
Needle holder	Fine Science Tools www.finescience.de	26016-12
Clear tape, 50 mm x 66 m	www.5staroffice.com	295985
FGF4 protein			A gift from Cliff Tabin.
all-trans-retinoic acid	Sigma www.sigmaaldrich.com	R2625-50MG	Remember to protect from light.
BMS 493	Sigma www.sigmaaldrich.com	B6688-5MG
Scalpel blade No. 15	www.swann-morton.com	cat no. 0105
Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel	Bio-Rad www.bio-rad.com	153-7301	Beads for delivering protein.
AG1-X2 Ion exchange resin	Bio-Rad www.bio-rad.com	140-1251	Beads for delivering RA or BMS 493.
Incubator for eggs	Memmert www.hce-uk.com	LAB128
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma www.sigmaaldrich.com	P6148-1KG	Harmful, irritant, corrosive. Handle powder in fumehood with full protective clothing.
Ethanol	Sigma www.sigmaaldrich.com	32221-2.5L
DMEM, high glucose	Gibco www.thermofisher.com	41965-039	500 ml
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific webshop.fishersci.com	D/4121/PB08	500 ml
Binocular Microscope	Leica www.leica-microsystems.com	MZ6	Replaced by M60
Chicken eggs	Henry Stewart & Co Ltd sales@medeggs.com		Brown Eggs