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Resumen

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

Resumen

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

Introducción

MS es una enfermedad humana caracterizada por la inflamación crónica y la neurodegeneración del CNS que se piensa para ser accionado por una respuesta autoinmune dirigida hacia la mielina. La pérdida de mielina y axones a través del tiempo como resultado la disminución gradual de la función cognitiva y motora 1. "Encefalomielitis autoinmune experimental" es un término general para los modelos animales de enfermedad autoinmune dirigida hacia la mielina del SNC. Como MS humanos, EAE se caracteriza típicamente por la infiltración de células inmunes del sistema nervioso central y, en algunos casos, la desmielinización 2. Sin embargo, el grado en que cualquier modelo de EAE dado asemeja MS humana, en parte, depende de la especie o cepa utilizada y de la complejidad de la respuesta autoinmune anti-mielina subyacente.

autoinmunidad anti-mielina puede ser inducida experimentalmente en varias formas, pero el método más común usado hoy en día es para inmunizar ratones con un péptido corto de aminoácidos que imitan la CD4 inmunodominante + epítopo de células T de una proteína de la mielina. Esto representa el requisito mínimo de inducir una respuesta patógena. Tal vez el más común de ellos es un péptido de 21 aminoácidos derivado de la glicoproteína de mielina de oligodendrocitos (MOG 35-55), que se utiliza para inducir la EAE en ratones C57BL / 6 3. Sin embargo, para algunos fines experimentales es deseable o incluso necesario para inmunizar con los antígenos proteicos más grandes y de hecho hay varias ventajas a esto más de la inmunización con el péptido corto. En primer lugar, debido a la restricción MHC, los péptidos cortos son por lo general sólo es eficaz en un rango muy limitado de cepas, mientras que los antígenos de proteínas más grandes que representan ya sea toda la proteína o un dominio específico se pueden procesar normalmente para su presentación en múltiples cepas de ratón endogámica o incluso en diferentes especies 4. En segundo lugar, un antígeno de proteína más grande es capaz de inducir una respuesta inmune más compleja la incorporación de más tipos de linfocitos en el reconocimiento de antígenos, en lugar de limiting reconocimiento del antígeno a las células T CD4 +. Por ejemplo, las células B a través de su receptor de células B (BCR) interactúan directamente con todo en lugar de procesado de proteínas. Nosotros y otros han demostrado que las células B activadas por MOG 35-55 inmunización no reconocen la proteína MOG 5. Puesto que las células B se ha demostrado recientemente para jugar un papel patogénico en MS humano 6, los modelos de EAE que incorporan células B en la patología autoinmune son cada vez más importante.

A pesar de las ventajas del uso de antígenos de proteínas de mayor tamaño para inducir EAE, quedan pocas fuentes disponibles en el mercado para tales proteínas. En efecto, mientras que los péptidos cortos como MOG 35-55 pueden sintetizarse muy rápidamente y a un coste relativamente bajo, las opciones comerciales para la proteína MOG es limitado y el coste sustancialmente más para comprar. No obstante, hay varios vectores de expresión disponibles para los grupos de investigación para generar MOG dominio extracelular (MOG 1-125) propios. however, todos los sistemas de expresión que hemos identificado en la literatura se basan en las tecnologías más antiguas que ya han sido reemplazados con sistemas de expresión más eficientes 7. Además, la mayoría se basan en rata o humano MOG 8. Para algunas investigaciones de la autoinmunidad en los ratones, un antígeno basado en el autoantígeno MOG ratón es preferible. Por último, todas las proteínas a base de MOG que hemos identificado, ya sea comercial o como vectores de expresión, son proteínas de fusión que contienen aminoácidos adicionales a la base MOG 1-125. Estos incluyen una etiqueta para la purificación y por lo general otras secuencias, así, muchas de las cuales con una función que no pudimos identificar.

Para hacer frente a estas limitaciones, hemos generado una nueva proteína de fusión basada en el ratón MOG dominio extracelular fusionado a una etiqueta que contiene tiorredoxina para combatir la insolubilidad de la proteína conocida MOG 5. La secuencia de etiqueta también contiene una secuencia 6xHis para la purificación y un CLE proteasa TEVsitio Avage que permite la eliminación completa de todas las secuencias de etiqueta, si se desea. Este es el único método que somos conscientes de generar pura proteína MOG 1-125. Para facilitar la producción de grandes cantidades de proteína, la secuencia de MOG 1-125 fue optimizado codón para la expresión bacteriana y se insertó la proteína de fusión tag MOG en el sistema de expresión pET-32. A continuación, describimos en detalle el protocolo para producir y purificar la proteína etiqueta de MOG, y MOG 1-125 pura, utilizando equipos no especializados disponibles para la mayoría de los laboratorios de inmunología.

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Protocolo

1. La inducción de proteínas

NOTA: En los pasos siguientes, las bacterias BL21 de Escherichia coli transformadas con un vector pET-32 que contiene la secuencia para la proteína de fusión tag MOG (véase la referencia 5 y la Figura 1) se cultivan a altas densidades y luego se inducen para expresar la proteína tag MOG . Vea la Figura 2 para la línea de tiempo general - en cuenta que los días son puntos de parada aproximados y suplentes se indican en el protocolo. Si a partir de ADN pET-32 MOG etiqueta vector purificado, será necesario transformar químicamente en competente BL21 E. bacterias coli utilizando la selección de ampicilina, como se ha descrito bien 9. La transformación exitosa puede confirmarse mediante la purificación de ADN a partir de bacterias seleccionadas utilizando un kit comercial estándar, seguido por digestión con las enzimas de restricción edad1 y Sac1 para producir una banda de 424 pb en un gel de agarosa 10.

  1. inocular 5 ml de caldo estéril caldo Lisogenia (LB) (0,1 mg / ml de ampicilina) con un BL21-MOG etiqueta de glicerol y se incuba durante la noche a 37 ° C, 200 rpm.
  2. Coloque dos matraces de 1 L Erlenmeyer que contenían 500 ml de caldo LB estéril en un incubador a 37ºC en preparación para el día siguiente.
  3. Añadir 500 l de 100 mg / ml de ampicilina a cada uno de los matraces que contenían 500 ml de LB desde el paso 1.2 (concentración final 0,1 mg / ml de ampicilina). Transferir 1 ml de cultivo de una noche de la etapa 1.1 para cada uno de los dos frascos de caldo LB. Incubar a 37 ° C y 200 rpm durante 5 hr o hasta una densidad óptica de 0,6.
  4. Tomar una alícuota de 1 ml de uno de los frascos y la transfiere en un tubo de centrífuga de 1,5 ml separado. Sedimentar las células a 16.000 xg durante 1 min y separar el sobrenadante. Etiquetar el tubo como T 0 (pre-inducción) y luego poner el sedimento bacteriano en un congelador -20 ° C para el futuro de sodio dodecil electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) análisis (ver sección 8 y Figura 3).
  5. Añadir 0,5 ml de 1 M isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido, isopropil β-D-tiogalactósido (IPTG) a cada frasco de cultivo. Incubar los matraces a 37 ° C, 200 rpm durante 4 horas, después a temperatura ambiente a 75 rpm durante la noche.

Proteína etiqueta 2. La recolección MOG

NOTA: En esta etapa, las bacterias se han producido grandes cantidades de proteína MOG etiqueta. Para cosechar etiqueta MOG, las bacterias se lisaron primero en un tampón Triton X-100, seguido por sonicación. Etiqueta MOG se libera a continuación, a partir de cuerpos de inclusión y desnaturalizado con imidazol y guanidina, resultando en una solución de proteína en bruto que contiene la proteína tag MOG.

  1. Tomar una alícuota de 1 ml de uno de los cultivos de una noche de la etapa 1.5 y la transfiere en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Sedimentar las células a 16.000 xg durante 1 min y separar el sobrenadante. Etiqueta de la bañeraE T O / N (post-inducción) a continuación, poner el sedimento bacteriano en un congelador -20 ° C para el futuro análisis de SDS-PAGE (Figura 3).
  2. Distribuir las culturas de manera uniforme entre los frascos de 250 ml compatibles con centrifugación a alta velocidad y mantener estos en hielo a partir de ahora. Sedimentar las células bacterianas a 22.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
  3. Descartar el sobrenadante. Almacenar los sedimentos bacterianos a -20 ° C o continúe con el paso 2.4.
  4. Preparar tampón de lisis (0,1 mg / ml de lisozima de huevo de gallina, 0,1% de Triton-X (v / v) en solución salina tamponada con fosfato (PBS)) mediante la adición de 60 l de Triton X-100 y 120 l de 50 mg / ml de lisozima de huevo de gallina solución madre a 60 ml de PBS.
  5. Volver a suspender y combinar todos los sedimentos bacterianos desde el paso 2.3 en un total de 30 ml de tampón de lisis. Transferir este volumen a un tubo de fondo redondo de 50 ml capaz de centrifugación a alta velocidad. Coloque este tubo en un baño de agua a 30 ° durante 30 minutos. Durante el tiempo de incubación, agite el tubodos veces para resuspender las células.
  6. Después de la incubación, transferir el tubo en hielo y sonicar la solución a 20 kHz, amplitud 70%, el pulso de 3 segundos, el pulso de 3 segundos, y cinco pulsos por vuelta. Sonicar la solución para el total de seis rondas y permita que la solución se enfríe sobre hielo en-entre las rondas.
  7. Centrifugar la solución a 24.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y repetir los pasos 2.5-2.7 vez. Almacenar el sedimento a -20 ° C o continúe con el paso 2.8.
  8. Preparar tampón A (NaCl 500 mM, 20 mM Tris-HCl, imidazol 5 mM, pH 7,9) mediante la adición de 0,8766 g de NaCl, 0,09456 g de Tris-HCl, y 0,01021 g de imidazol a un vaso de precipitados de 100 ml. Añadir H2O hasta que el volumen alcanza 28 ml y luego ajustar el pH de la solución a 7,9. A continuación, transferir la solución a un cilindro graduado de 100 ml y añadir H2O hasta que el volumen es de 30 ml.
  9. Resuspender el precipitado de la etapa 2.7 en 30 ml de tampón A y se incuba esta solución a 4 ° C durante 3 hr. Durante este tiempoPesar 17,2 g de clorhidrato de guanidina.
  10. Sonicar la solución en hielo usando la misma configuración que en el paso 2.6. A continuación, añadir 17,2 g de guanidina-HCl a la solución. Incubar esta en hielo durante 1 hora para disolver la proteína MOG etiqueta.
  11. Centrifugar la solución a 24.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Recoger el sobrenadante y almacenar el sobrenadante a 4 ° C hasta la purificación de proteínas.

3. La purificación de proteínas

NOTA: En los pasos siguientes se purifica la proteína MOG etiqueta a través de 4 rondas de absorción sobre la resina cargada de níquel (a través de la cola de His) y la elución.

  1. Hacer los buffers Siguiendo:
    1. Preparar tampón B (NaCl 500 mM, 20 mM Tris-HCl, imidazol 5 mM, 6 M de guanidina-HCl, pH 7,9). Añadir 5,844 g de NaCl, 0,6304 g de Tris-HCl, 0,0681 g de imidazol, y 114,64 g de guanidina-HCl a un vaso de precipitados de 500 ml. A continuación, añadir H 2 O hasta que llega a 190 ml y ajustar el pH a 7,9. Transferir el sollución a una probeta graduada de 250 ml y añadir H2O hasta que el volumen es de 200 ml.
    2. Preparar tampón de elución (NaCl 500 mM, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M imidazol, 6 M de guanidina-HCl, pH 7,9). Añadir 5,844 g de NaCl, 0,6304 g de Tris-HCl, 6,808 g de imidazol, y 114,64 g de guanidina-HCl a un vaso de precipitados de 500 ml. Añadir H 2 O hasta que llega a 190 ml y ajustar el pH a 7,9. Transferir la solución a 250 ml cilindro graduado y añadir H2O hasta que el volumen es de 200 ml.
    3. Preparar tampón Strip (NaCl 500 mM, 20 mM Tris-HCl, EDTA 100 mM, pH 7,9). Añadir 5,844 g de NaCl, 0,6304 g de Tris-HCl, 40 mM EDTA ml 500 ml a un vaso de precipitados de 500. Añadir H 2 O hasta que llega a 190 ml y ajustar el pH a 7,9. Transferir la solución a 250 ml cilindro graduado y añadir H2O hasta que el volumen es de 200 ml.
    4. Preparar Charge tampón (sulfato de 0,1 M de níquel). Añadir 5,257 g de sulfato de níquel a un vaso de 500 ml y añadir H2O hasta que llega a 190 ml (PRECAUCIÓN, no se ocupan de níquelsulfato de fuera de una campana de extracción hasta que el sulfato de níquel se ha disuelto en H 2 O). Una vez que el sulfato de níquel se ha disuelto, transferir la solución a un cilindro graduado de 250 ml y añadir H2O hasta que el volumen alcanza los 200 ml.
  2. Dividir 10 ml de resina de níquel entre dos tubos de centrífuga de 50 ml cónicos capaces de soportar fuerzas centrífugas más de 4.500 xg (5 ml en cada tubo).
  3. Cargar y equilibrar la resina de níquel:
    1. Lavar la resina mediante la adición de 40 ml H 2 O a cada tubo que contiene la resina. Colocar los tubos en posición horizontal sobre una mecedora y dejar que ellos se agitan durante 5 min a 4 ° C. Una vez terminado, los tubos de centrifugación a 4.500 xg durante 8 minutos a 4 ° C.
    2. Descartar el sobrenadante con la pipeta para evitar perturbar el sedimento. Añadir 40 ml de tampón de carga a cada tubo. La transferencia de los tubos en una mecedora y dejar que ellos se agitan durante 15 minutos a 4 ° C. Una vez terminado, los tubos de centrifugación a 4.500 xg durante 8 minutos a 4 ° C.
    3. Descartar el sobrenadante a continuación, añadir 40 ml de tampón B a los tubos. La transferencia de los tubos en una mecedora y dejar que ellos se agitan durante 5 min a 4 ° C. Una vez terminado, centrifugar los tubos a 4.500 xg durante 8 minutos a 4 ° C y luego desechar los sobrenadantes.
  4. Opcional: Tomar 150 l de la proteína solubilizada recogido en el paso 2.11 y transferirlo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Etiquetar el tubo como pre-incubación y congelar esta a -20 ° C para el futuro análisis de SDS-PAGE (Figura 3, crudo MOG etiqueta).
  5. Purificar la proteína MOG etiqueta:
    1. Transferir todo el volumen de proteína solubilizada de la etapa 2.11 (~ 40 ml, menos la pequeña muestra extraída en el paso 3.4) para el primer tubo (Figura 2, el tubo 1) que contiene resina de níquel de la etapa 3.3, mezclar y colocar en posición horizontal sobre un eje de balancín a 4 ° C durante 1 hr.
    2. Se centrifuga el tubo a 4.500 xg durante 8 minutos a 4 ° C. Una vez terminado, transferir el sobrenadante a la segundatubo (Figura 2, el tubo 2) de resina de níquel y se incuba como se describe en el paso anterior. Mientras tanto, continúe con los pasos 3 a 6 a continuación con tubo 1.
    3. Resuspender la resina de níquel en el tubo 1 en 40 ml de tampón de elución y se coloca el tubo en posición horizontal sobre un eje de balancín a 4 ° C durante 5 min. A continuación, se centrifuga el tubo a 4500 xg durante 8 minutos a 4 ° C.
    4. Transferir el sobrenadante que contiene la proteína eluida etiqueta de MOG en una botella de 250 ml etiquetados 'purificado de proteína MOG etiqueta' y mantener esta botella a 4 ° C. Con cada etapa de elución, en común el sobrenadante resultante en esta botella.
    5. Añadir 40 ml de tampón de tira a la resina de níquel y colocar en posición horizontal sobre un eje de balancín durante 5 min a 4 ° C.
    6. Se centrifuga el tubo a 4.500 xg durante 8 minutos a 4 ° C. Descartar el sobrenadante, y luego recargar la resina de níquel como se indica en el paso 3.3.
    7. Una vez terminado, avanzar con el segundo tubo como se indica en el paso 3.5. Un total de 4 rondas de la absorción de la proteína solubilizada de la etapa 2.11 en la resina de níquel cargado y la elución se recuperará la mayor parte de la proteína, aunque, si se desea, la proteína adicional se pudo recuperar en rondas adicionales de absorción y elución.
  6. Una vez que cuatro (o más) rondas de absorción y elución son completos, almacenar la proteína purificada agrupado a 4 ° C durante la noche. resina de níquel se puede almacenar en 40 ml de una solución de etanol al 20% a 4 ° C hasta que se necesite de nuevo.

4. La medición de la concentración de proteínas

NOTA: Antes de continuar, es necesario cuantificar la cantidad de proteína purificada etiqueta MOG generado en la sección 3. Este valor se utiliza para determinar el volumen final a concentrar la proteína a al final del protocolo. Se describe un ensayo de Bradford estándar de aquí. La concentración de proteína tag MOG purificada se determina comparando la absorbancia espectral de serie dilutproteína tag ed MOG con una curva estándar de albúmina de suero bovino (BSA) a una concentración conocida.

  1. Hacer 10x tampón de acetato mediante la adición de 23 ml de ácido acético glacial a 8,2 g de acetato de sodio en un vaso de precipitados de 3 L y luego agregar 1.9 L de H 2 O para disolver el acetato de sodio. Transferir dicha solución a una probeta graduada de 2 L y añadir H2O hasta que el volumen alcanza 2 L. A continuación, guárdelo en una botella de 2 litros a temperatura ambiente. Hacer 1 ml de tampón de acetato de 1x mediante la adición de 100 l de 10x tampón de acetato a 900 l de H 2 O.
  2. Configurar una placa de 96 pocillos para diluciones mediante la adición de 30 l de tampón de acetato de 1x a pozos G2-8 y 60 l a G9. Añadir 48 l de tampón de acetato de 1x a H2 y H3.
  3. Configurar la serie de dilución inicial del patrón de BSA en la fila G de la siguiente manera: Añadir 216 l de tampón de acetato de 1x y 54 l de 2 mg disponible comercialmente estándar / ml de BSA en G1 bien y mezclar bien. Añadir 210 l de G1 y G2 así, mezclar bien,y luego añadir 180 l de G2 y G3 también. Añadir 150 l de G3 a G4 así también, mezclar bien, y continuar esta tendencia de la adición de 30 l menos a cada pocillo subsiguiente hasta G8 también. (Véase la Tabla 1 para las listas de factores de dilución equivalentes).
  4. Configurar las muestras por triplicado de cada dilución de la transferencia de 10 l de G1 bien a los pocillos A1, B1 y C1, y 10 l de G2 pocillo en los pocillos A2, B2, C2 y, y así sucesivamente. Utilizar una pipeta multicanal.
  5. Para configurar las diluciones de la etiqueta MOG, añadir 60 l de proteína MOG etiqueta purificada de la etapa 3.6 a H1 también. Añadir 12 l de H1 H2 bien a bien, mezclar bien y añadir 12 l de H2 H3 un pozo a otro, mezclar bien (esto produce una disolución 1x en H1, H2 1/5 de dilución en, y la dilución 1/25 en H3) .
  6. Configurar muestras por triplicado para las diluciones de etiquetas MOG la transferencia de 10 l de pozos H1-H3 a filas D, E y F, como se describe en el paso 4.4.
  7. Mezclar 2 ml de colorante de ensayo de proteínasconcentrado de reactivo con 8 ml de H 2 O. Añadir 200 l de esta mezcla a todos los pocillos precargados en las filas A, B, C, D, E, y F, usando una pipeta multicanal, si está disponible. Reviente las burbujas en los pozos utilizando una aguja antes de leer la concentración de proteína.
  8. Dentro de 10 min de la adición del reactivo colorante, medir la absorbancia 595 nm de todos los pocillos de las filas A, B, C, D, E, y F.
  9. Use líneas A, B, y C para establecer una curva estándar en el que las posiciones 1-9 corresponden a 0,4, 0,35, 0,3, 0,25, 0,2, 0,15, 0,1, 0,05, y con 0 mg / ml de BSA. Sobre la base de esta curva, se calcula la concentración de proteína tag MOG usando la dilución de etiqueta MOG que mejor se ajusta a la curva estándar. Por lo general, habrá 200 a 250 mg de proteína tag MOG de 1 L de cultivo bacteriano usando el protocolo descrito aquí.
    NOTA: Para hacer MOG 1-125 proceder desde aquí a la sección opcional 7 que aparece al final del protocolo. De lo contrario, continúe con la sección 5.

5. Diálisis

NOTA: La diálisis se realiza para eliminar gradualmente guanidina de la solución que contiene, etiqueta MOG desnaturalizada purificada para permitir que la proteína se repliegue. Se debe tener cuidado durante este paso como la propia MOG es muy insoluble, y si bien esto se mejora por la presencia de la etiqueta de tiorredoxina, todavía es propensa a salir de la solución. Por lo tanto, el replegamiento debe realizarse gradualmente y a una concentración relativamente baja etiqueta MOG.

  1. Antes de comenzar la diálisis, se diluye la proteína tag MOG purificado con tampón B (tampón B se pueden hacer como se indica en el paso 3.1) hasta que la concentración es de 0,5 mg / ml o menos, basado en la cantidad de etiqueta MOG calculado en la sección 4.
  2. Cortar aproximadamente 30 cm de tubo de diálisis de piel de serpiente y asegurar un extremo con una pinza hemostática de bloqueo doblando el extremo de la piel de serpiente durante tres veces y sujetar el extremo plegado con la pinza hemostática. Llene la piel de serpiente con diluidoMOG proteína tag (entre 60 a 90 ml de proteína MOG etiqueta por tubo) y luego eliminar las burbujas de aire de la piel de serpiente, obligándoles a cabo del extremo abierto. Finalmente, sellar el otro extremo del tubo utilizando un segundo hemostato de bloqueo.
  3. Repita el paso 5.2 para llenar las secciones adicionales de tubo de diálisis hasta que toda la proteína MOG etiqueta ha sido transferido a un tubo de diálisis de piel de serpiente. Asegúrese de que no haya fugas.
  4. Hacer acetato 1x con 4 M de guanidina pesando 382,12 g de guanidina-HCl y añadiendo 100 ml de 10x tampón de acetato realizados en el paso 4.1 a un 2 L vaso de precipitados. Añadir 0,5 L de H 2 O al vaso de precipitados y permitir que la guanidina-HCl para disolver. Una vez disuelto, trasvasar la solución a una probeta graduada de 1 litro y añadir H2O hasta que el volumen alcanza 1 L. Repetir esta receta por cada 2 pieles de serpiente que se requieren.
  5. Realizar la diálisis de la siguiente manera: llenar un balde grande (mínimo 10 L) con 1 L de tampón de acetato de 1x con 4 M de guanidina de la etapa 5.4. Colocar hasta to 2 secciones de tubo de diálisis que contiene la etiqueta MOG en el cubo, dejando espacio para una barra de agitación magnética a girar sin obstáculos en la parte inferior. Poner el cubo en una habitación de 4 ° C sobre una placa de agitación magnética y encenderlo a una velocidad de rotación lenta (es decir, no es alta, lo suficiente para mover el fluido):
    NOTA: Realice los siguientes pasos para reducir gradualmente la cantidad de guanidina en la memoria intermedia. veces Stir se dan como mínimos, pero se pueden dejar durante la noche. La diálisis se llevará un mínimo de 3 días, pero esto puede ser extendida si se desea. Compruebe regularmente para asegurarse de que el tubo está intacto y que los extremos están cerrados de forma segura.
    1. Deje que el cubo se sienta y se agita durante 4-5 horas.
    2. Añadir 1 L de tampón de acetato de 1x (tampón de acetato 100 ml de 10x y 900 ml de H 2 O) a cada cubo.
    3. Repita los pasos 5.5.1 y 5.5.2 un total de 3 veces para un total de 4 l de tampón en el cubo.
    4. Desechar medio de la memoria intermedia en el cubo y volver a llenar con 1 L de tampón de acetato de 1x (100 ml de 10x tampón de acetato y 900 ml de H2O, sin guanidina) y configurar la barra de tubo y remover.
    5. Repita los pasos 5.5.1 y 5.5.2 una vez (es decir, hasta que hay un total de 4 l de tampón en el cubo).
    6. Por último, sustituir la totalidad del volumen 4 L en el cubo con 4 l de tampón de acetato 1x fresco y se dejó en agitación durante 4-5 horas. Para obtener los mejores resultados, realice este paso en el día de la concentración de proteínas.
    7. Retirar con cuidado el tubo de diálisis con la etiqueta MOG replegada y desechar tampón cubo.

6. concentración de la proteína etiqueta MOG

NOTA: En el paso final, replegado de proteínas etiqueta MOG se concentra a la dilución de trabajo para el almacenamiento. Como etiqueta de MOG es muy insoluble, que no debe exceder de 5 mg / ml. Esta concentración es aproximadamente equimolar con 0,4 mg / ml MOG 35-55 péptido, que se utiliza comúnmente para inducir la EAE en ratones (mezclados 1: 1 con total adjuv de Freundhormiga (CFA)). Durante el proceso de concentración no es raro para una pequeña cantidad de proteína a salga de la solución en forma de precipitado blanco. precipitación excesiva es un problema, sin embargo.

  1. Calcular el volumen final deseado para alcanzar una concentración de marcas de MOG de 5 mg / ml, en base al valor calculado en el punto 4.
  2. Línea de una sartén con papel de aluminio y cubre la lámina de aluminio con polietilenglicol (PEG) 3350 y PEG 8000 en una relación 1: 1. El PEG 3350 se incorpora a esta mezcla, ya que puede ayudar a prevenir la agregación de proteínas durante la concentración y es un eficaz cyropreservative 11.
  3. Ponga el tubo de piel de serpiente (con la proteína de la etiqueta en el interior MOG) en la parte superior de la hoja de aluminio y cubrir con PEG 8000. Que este reposar a temperatura ambiente y comprobar periódicamente el volumen hasta que el volumen es igual o menor que el volumen final estimado (calculado en el paso 6.1), se medirá el volumen real en el siguiente paso. Si el recipiente se hacesobresaturado de agua durante el proceso de concentración, configure una bandeja con papel de aluminio fresca y PEG 3350 y PEG 8000.
  4. Lavar el exterior de las pieles de serpiente con H 2 O y transferir la proteína tag MOG a una botella de vidrio separada usando una pipeta serológica. Mantenga un registro del volumen que la proteína se transfirió a garantizar el volumen es correcta.
    1. Si el volumen se ha reducido por debajo del volumen final estimado, añadir tampón de acetato 1x hasta que se alcanza el volumen deseado. Si el volumen está por encima del volumen final estimado, la transferencia de la proteína MOG etiqueta de nuevo en el tubo de diálisis y continuar la concentración (pasos 6.2 a 6.3).
    2. Distribuir la proteína MOG etiqueta entre los tubos de 1,5 ml (0,5 ml por tubo), almacenar los tubos a -80 ° C hasta que se necesite. Para inducir la EAE, mezclar este volumen 1: 1 con CFA.
  5. Correr un gel de SDS-PAGE para confirmar la expresión de la proteína MOG etiqueta usando las muestras tomadas en los pasos 1.4, 2.1, 3.4, y la proteína MOG purificada de la etapa 6.4.

7. Generación de MOG 1-125 de la etiqueta de MOG Uso de la proteasa TEV (Opcional)

NOTA: Este paso opcional continúa desde el final de la etapa 4. Si se requiere MOG 1-125 sin ningún tipo de etiqueta secuencias adicionales, las secuencias de etiqueta se pueden eliminar con proteasa TEV (Figura 4). Por lo que sabemos, no hay otro sistema de expresión capaz de generar pura MOG 1-125. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que sin la etiqueta de tiorredoxina, MOG 1-125 es muy insoluble y esto puede causar problemas durante la purificación y manipulación, y por esta razón quitar la etiqueta si es absolutamente necesario por razones experimentales. Se requieren varios pasos para generar puro MOG 1-125. MOG etiqueta se dializa en el búfer de corte de proteasa TEV. Después de la digestión con la proteasa TEV, el volumen se reduce para ayudar con la posterior purificación steps, dializados en tampón B, y luego la secuencia de etiqueta His-tag que contiene se elimina utilizando resina de níquel. Por último, la proteína se cuantificó y MOG puro 1-125 se concentra hasta la concentración final.

  1. Hacer 1 L de 10x tampón de disociación TEV (500 mM Tris-HCl, EDTA 5 mM) mediante la adición de 1,861 g de EDTA, 44,4 g de Tris-HCl, y 26,5 g de Tris a un vaso de 2 L. Añadir H 2 O hasta que el volumen alcanza 990 ml y luego ajustar el pH a 8 para disolver el EDTA. Transferir la solución a un cilindro graduado de 1 L y llevar el volumen hasta 1 L usando H 2 O.
  2. Diluir la proteína tag MOG desde el paso 3,6-0,5 mg / ml usando tampón B (el mismo tampón descrito en la etapa 3.1), basado en la cantidad de proteína calculado en la sección 4. Transferencia de 120 ml de proteína tag MOG diluido a un tubo de diálisis de piel de serpiente como se describe en pasos de 5.2 a 5.3. El volumen se puede ampliar sin embargo, la cantidad de proteasa TEV necesaria para escindir toda la proteína MOG etiqueta será subestaciónntial.
  3. Siga el protocolo de diálisis que aparece en el paso 5.5, excepto reemplazar el tampón 10x con acetato de 10x tampón de disociación TEV realizado en el paso 7.1.
  4. Transferir la etiqueta MOG, ahora en tampón de disociación TEV, a una nueva botella de vidrio de 250 ml y controlar el aumento del volumen de la diálisis. Añadir 1 l de β-mercapto-etanol por cada proteína tag 2,85 ml de MOG añadido a la botella. Añadir al menos 1 mg de proteasa TEV (TEV solución stock con 5 mg / ml) por cada 50 mg de proteína etiqueta MOG (proteasa TEV puede añadir hasta un TEV 01:10: proteína MOG) y se incuba a temperatura ambiente, protegida de la luz durante al menos 72 horas.
    NOTA: Al final de la incubación de la proteasa TEV, precipitados blancos deben verse en la parte inferior de la botella de vidrio.
  5. Antes de transferir la proteína a un tubo de diálisis, añadir guanidina-HCl a la solución hasta que las proteínas se disuelven para evitar que la proteína precipita se pegue a la botella de vidrio. Transferir 150 l deesta solución a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y la etiqueta del tubo como "MOG con TEV". Almacenar la solución a -20 ° C para el futuro análisis de SDS-PAGE.
  6. Transferir todo el fluido desde el paso 7.5 en un tubo de diálisis que se enumeran en los pasos 5.2 a 5.3. Llenar un cubo grande con 2 l de H2O y colocar el tubo de diálisis en el cubo. Incubar esta a 4 ° C con agitación durante la noche la luz. Este paso es importante para diluir la guanidina para permitir que la concentración de proteína que se produzca de forma rápida y para comenzar a retirar el EDTA de la solución que interfiera con la purificación de proteínas.
  7. Se concentra la proteína en el tubo de diálisis como se indica en los pasos 6.2 a 6.3 (la única excepción de utilizar PEG 8000) tal que el volumen final de la solución es de ~ 40 ml. Lavar el tubo de diálisis con H 2 O y eliminar cualquier PEG residual 8000 todavía unido a la tubería. Esta reducción de volumen hace que sea posible para adaptarse a todos de la proteína digerida en un tubo de 50 ml que contiene níquel repecado, tal como se describe en el paso 3.5.
  8. Se dializa la proteína digerida con Tampón B:
    1. Llenar un cubo grande con 1 L de tampón B (29,22 g de NaCl, 3,152 g de Tris-HCl, 0,3405 g de imidazol, 573,18 g de guanidina-HCl, pH 7,9).
    2. Colocar las pieles de serpiente que contienen proteína digerida del paso 7.7 en el cubo junto con un imán de agitación (como se describe en mayor detalle en el paso 5.5). Ponga el cubo en un 4 ° C habitación fría en una placa de agitación fijado a un revuelo lenta y permitir que las pieles de serpiente que se dializan durante 5 o más horas.
    3. Vaciar el cubo y volver a llenar con otro 1 L de tampón B y dejar que este se sienta en el 4 ° C habitación fría en una placa de agitación fijado a un revuelo lenta y permita que las pieles de serpiente que se dializan durante 5 o más horas.
  9. Realizar la purificación de la proteína MOG 1-125 como se detalla en el apartado 3, con la importante diferencia de que las secuencias de etiqueta escindidos se consideran obligados por la resina de níquel, dejando MOG 1-125 en solución. Una vez más, de 4 rondas de purificación seránlleva a cabo en el mismo volumen, pero en este caso el objetivo es mejorar la pureza, en lugar de recuperar tanta proteína como sea posible. Vea la Figura 4.
    1. Hacer que los tampones de purificación de proteínas enumeradas en el paso 3.1
    2. Cargar los dos tubos de resina de níquel como se describe en el paso 3.3.
    3. Purificar MOG 1-125 por el protocolo detallado en el paso 3.5, con la excepción esencial que el eluato de la resina de níquel que contiene la etiqueta se descarta (mantenga 150 l de eluato en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para el futuro análisis SDS-PAGE), mientras la solución que contiene MOG 1-125 se mantiene como el producto final.
  10. Medir la concentración de proteína MOG 1-125 como se describe en la Sección 4:
    1. Configurar dilución de la curva estándar de BSA como se describe en los pasos 4.2 y 4.4.
    2. Configurar las diluciones de MOG 1-125 como se describe en los pasos 4.5 y 4.6. Alternativamente, puede ser valiosa para generar una mayor gamade diluciones (1x, 1/2, 1/4, y 1/8, por ejemplo). Ajuste volúmenes de tampón de acetato de 1x y MOG 1-125 consecuencia.
    3. Realizar el ensayo de Bradford como se describe en los pasos 4.7 a 4.9 y calcular la cantidad de MOG 1-125 generado. El rendimiento esperado es de aproximadamente 4 mg o más proteínas.
  11. Vuelve a doblar MOG 1-125 de la eliminación gradual de guanidina a través de diálisis, tal como se describe en la sección 5.
  12. Concentrado de proteína MOG 1-125 como se describe en la sección 6. La concentración final debería ser 2,24 mg / ml, que es equimolar a 5 mg tag / ml MOG.

8. SDS-PAGE gel para Confirmar las MOG etiqueta de Producción y Pureza

Nota: Las muestras tomadas de los pasos 1.4, 2.1, 3.4, y 6.4 son analizados por norma SDS-PAGE para confirmar la producción de etiquetas MOG y pureza. Este paso debe realizarse después de la purificación final de cualquiera de etiqueta MOG o MOG 1-125.

  1. Hacer un tampón de carga 2x SDS-PAGE mediante la adición de 1,576 g de Tris-HCl a 2 ml de H 2 O y ajustar el pH a 6,8. Añadir 0,4 g de SDS en la solución de Tris-HCl y luego añadir H2O hasta que el volumen alcanza 7 ml.
  2. Añadir 0,2 g de azul de bromofenol a 10 ml de H 2 O a continuación, añadir 1 ml de esta solución a la realizada en el paso 8.1. Por último, añadir 2 ml de glicerol al terminar el tampón de carga 2x SDS-PAGE. Al almacenar esta solución, mantener a 4 ° C y protegerlo de la luz durante un máximo de 3 meses.
  3. Descongelar las alícuotas congeladas de las bacterias de los pasos 1.4 y 2.1, así como la proteína tag MOG solubilizado de los pasos 3.4 y 6.4 a temperatura ambiente.
  4. Eliminar las sales de las soluciones recogidas en los pasos 3.4 y 6.4 mediante la adición de 60 l de cada una de las columnas de desalación de proteínas. Purificar las proteínas siguiendo las instrucciones del fabricante.
  5. Añadir 20 l de β-mercapto-etanol para 1 ml de la solución preparada en el paso 8.2. Añadir 40 l de esto a los dos bacterial gránulos de la etapa 8.3 y 60 l a las proteínas desaladas del paso 8.4 e incubar éstos a 95 ° C durante 10 minutos.
  6. Hacer tampón de página SDS 1x pesando 5 g de Tris, 28,8 g de glicina, y 1 g de SDS. Añadir estos a un vaso de precipitados de 1 L y añadir 500 ml de H 2 O para disolver todo. Una vez disuelto, trasvasar la solución a una probeta graduada de 1 litro y rellenar con H2O hasta que el volumen alcanza 1 L.
  7. Establecer un gel de poliacrilamida al 12% en un aparato de gel a continuación, añadir el tampón de SDS-PAGE 1x al aparato de gel tal que el tampón de ejecución es justo por encima de la parte superior de los pocillos en el gel. Lavar los pocillos de la gel pipeteando 50 l de tampón de correr en los pocillos cinco veces cada uno.
  8. Carga de 10 l de escalera proteína en la primera bien y añadir 10 l de las soluciones hervidas de la etapa 8.5 en pocillos separados. Correr el gel a 115 V durante 60 minutos.
  9. Retire el gel del aparato y transferirlo a un recipiente pequeño. Llene la container con 100 ml de pura H 2 O y transferir el contenedor a una plataforma que gira lentamente para 8 min. Después del 8 minutos, verter el agua y lavar el gel dos veces más con H2O
  10. Volcar la H 2 O del recipiente y añadir 100 ml de reactivo de tinción rápida al recipiente. Permitir que este se sienta sobre una plataforma giratoria lentamente durante la noche, cubrir con papel de aluminio.
  11. Volcar el reactivo de tinción rápida y añadir aproximadamente 100 ml de H2O al contenedor. Permitir que este se sienta sobre una plataforma giratoria durante 8 minutos. Volcar el H 2 O y repetir el lavado H2O dos veces.
  12. La imagen del gel usando un generador de imágenes para las manchas de azul de Coomassie. Busque una banda alrededor de 31,86 kDa (proteína etiqueta MOG) y una banda más débil en 63.72 (dímeros etiqueta MOG) kDa.

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Resultados

Una vez que la purificación es completa, las muestras recogidas en los pasos 1.4, 2.1, 3.4, y el producto final de la etapa 6.4 se deben ejecutar en un gel de proteína (Figura 3A). MOG etiqueta debe aparecer en primer lugar como una banda de 31,86 kDa en la muestra T / N, pero no t 0, y debe ser la única banda en el producto puro final. Para probar si la proteína tag MOG ha plegado correctamente, la proteína tag...

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Discusión

Aquí, hemos descrito un protocolo para la producción de proteína MOG etiqueta y cómo generar MOG 1-125 pura de la proteína MOG etiqueta. Este protocolo se basa tanto en los métodos estándar His-tag base de purificación de proteínas, así como un protocolo previamente descrito para la generación de una proteína de más edad a base de MOG 15. A pesar de que no se describe aquí, el uso principal de la proteína etiqueta MOG es inducir EAE mediante inmunizac...

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Divulgaciones

The authors declare no competing financial interests.

Agradecimientos

This work was supported by a grant from the Multiple Sclerosis Society of Canada. RWJ is the recipient of the Waugh Family MS Society of Canada Doctoral Studentship Award.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
BL21 E. coli- pet32-MOGtagKerfoot labThese bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request.
LB broth millerBioshopLBL407.1
Ampicillinbio basicAB0028Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C.
IPTGBioshopIPT002.5Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C.
Chicken-egg lysozymeBioshopLYS702.10Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C.
Triton-X100SigmaT-8532
Phosphate buffered salinelife technologies20012-027Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient.
Sodium chlorideBioshopSOD004.1
Tris-HClBioshopTRS002.1
ImidazoleBioshopIMD508.100
Guanidine-HClSigmaG3272The quality must be greater than 98% purity.
0.5 M EDTAbioshopEDT111.500
Nickel (II) sulfateBioshopNIC700.500
His bind resinEMD Millipore69670-3Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C
Anhydrous ethanolCommercial AlcoholsP016EAANDilute with water as needed.
Glacial acetic acidBioshopACE222.1
Sodium acetate trihydrateBioshopSAA305.500
bovine serum albumin standardbio-rad500-0206
Bio-rad protein assay dye reagent concentratebio-rad500-0006
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrateFisher scientificBP120-500
Tris-baseBioshopTRS001.1
7000 MW Snakeskin dialysis tubingThermoscientific68700
2-mercaptoethanolSigmaM3148-25mlThis reagent should not be handled outside of a fume hood.
AcTEV proteaselifetechnologies12575-015Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17
Polyethyleneglycol 3350BioshopPEG335.1
polyethyleneglycol 8000BioshopPEG800.1
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plateebioscience44-2404-21
SonicatorFisher scientificFB-120-110
Eon microplate spectrometerBiotek11-120-611This equipment uses the Gen5 data analysis software.
Gen5 data analysis softwareBioTek
sodium dodecyl sulphateBioshopSDS001
bromophenol blueBioshopBRO777
GlycerolBioshopGLY001
Protein desalting columnsThermoscientific89849
GlycineBioshopGLN001
precast 12% polyacrylamide gelbio-rad456-1045
Rapid stain reagentEMD Millipore553215
Gel dock EZ imagerbio-rad1708270
White Light Sample Traybio-rad1708272 Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains
Protein ladderbio-rad1610375

Referencias

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