実験的自己免疫性脳脊髄炎研究のためのシンプルで効率的な生産とマウスミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質の精製

要約

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

要約

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4⁺ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOG_tag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG_1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOG_tag or MOG_1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOG_tag protein. Immunization with either MOG_tag or MOG_1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

概要

MSは、ミエリンに向けられた自己免疫応答によって駆動されると考えられているCNSの慢性炎症および神経変性によって特徴付けられるヒト疾患です。時間の経過とともにミエリンおよび軸索の損失は、認知および運動機能¹の緩やかな衰退につながります。 「実験的自己免疫性脳脊髄炎」は、CNSミエリンに向け自己免疫疾患の動物モデルのための包括的な用語です。ヒトMSと同様に、EAEは、典型的には、CNSの免疫細胞の浸潤を特徴とし、場合によっては、脱髄²れます。しかし、任意のEAEモデルは、部分的に人間のMSに似ている度合いは、使用される種または株に、基礎となる抗ミエリン自己免疫応答の複雑さによって異なります。

抗ミエリン自己免疫は実験的に、いくつかの方法で誘導することができるが、今日使用される最も一般的な方法は、免疫優性CD4を模倣するアミノ酸の短いペプチドでマウスを免疫化することです + T細胞エピトープアップ。これは、病原性応答を誘導するための最小要件を示しています。おそらく、これらの中で最も一般的には、C57BL / 6マウス³にEAEを誘導するために使用されるミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG _35-55）に由来する21アミノ酸ペプチドです。しかし、いくつかの実験目的のためには、より大きなタンパク質抗原で免疫化することが望ましい、あるいは必要であり、実際にこれにはいくつかの利点が短いペプチドを用いた免疫化の上にあります。タンパク質全体または特定のドメインのいずれかを表す、より大きなタンパク質抗原は、異なる種であっても、複数の近交系マウスでのプレゼンテーションのために正常に処理されるか、またはすることができながら、まず、MHC制限のため、短いペプチドは、通常の株の非常に限られた範囲でのみ有効です^4。第二に、より大きなタンパク質抗原は、抗原認識にリンパ球の多くの種類を組み込んだより複雑な免疫応答を誘導するのではなくlimitinすることが可能ですCD4 ⁺ T細胞へのG抗原認識。例えば、それらのB細胞受容体（BCR）を介したB細胞は、全体ではなく、処理タンパク質と直接相互作用します。我々と他の人は、MOG _35-55免疫によって活性化されたB細胞は、MOGタンパク質^5を認識^しないことが示されました。 B細胞は、最近、ヒトMS ⁶に病原性の役割を果たすことが実証されたので、自己免疫病理にB細胞を組み込むEAEモデルは、ますます重要です。

EAEを誘導するために、より大きなタンパク質抗原を使用することの利点にもかかわらず、そのようなタンパク質のいくつかの市販の供給源が残ります。 MOG _35-55のような短いペプチドは、非常に迅速かつ比較的安価に合成することができるが、実際に、MOGタンパク質を商業オプション購入に限定されず、コスト実質的です。それにもかかわらず、MOGの細胞外ドメイン（MOG _1-125に ）自分自身を生成するために、研究グループのために利用可能ないくつかの発現ベクターがあります。 HoweveR、我々は文献で同定した発現系の全てを、以降、より効率的な発現系⁷で置換されている古い技術に基づいています。また、大部分はラットまたはヒトMOG ⁸に基づいています。マウスにおける自己免疫のいくつかの研究では、マウスMOG自己抗原に基づいて抗原が好ましいです。最後に、コマーシャルまたは発現ベクターのいずれかと、我々が同定したすべてのMOG系タンパク質は、MOG _1-125ベースに追加のアミノ酸を含む融合タンパク質です。これらは、同様に私たちは識別できなかった機能を備えているの多くを精製するためのタグと通常は他の配列が含まれます。

これらの制限に対処するために、我々は、MOGタンパク質⁵の既知の不溶性に対処するためにチオレドキシンを含むタグに融合したマウスMOGの細胞外ドメインに基づく新規な融合タンパク質を生成しました。タグ配列はまた、精製およびTEVプロテアーゼCLE用の6xHis配列を含みます必要に応じて、すべてのタグ配列を完全に除去することが可能avageサイト。これは、我々が純粋なMOG _1-125蛋白質を生成するの知っている唯一の方法です。タンパク質の大量生産を容易にするために、MOG _1-125配列を細菌発現のためにコドン最適化し、MOG _タグ融合タンパク質は、PET-32発現系に挿入しました。ここでは、最も免疫学研究所で使用可能な非専門的な装置を使用して、詳細にMOG _{タグタンパク}質を生成し精製するプロトコル、及び純粋MOG _1-125を記述する。

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プロトコル

1.タンパク質誘導

注：以下の手順で、BL21 大腸菌細菌はMOG _タグ融合タンパク質のための配列を含有するpET-32ベクターで形質転換された高密度まで増殖され、次いで、MOG _{タグタンパク}質を発現するように誘導されている（参考文献⁵及び図1参照） 。日は概算と代替ストップポイントはプロトコールに記載されていていることに注意してください-全体的なタイムラインについては、 図2を参照してください。精製されたpET-32 MOG _タグベクターDNAで開始した場合、化学的コンピテントBL21 大腸菌に変換する必要があります⁹十分に説明したように、アンピシリン選択を用いて、 大腸菌の細菌。成功した形質転換は、制限で消化し、続いて、標準的な市販のキットを使用して、選択された細菌からDNAを精製することにより確認することができるAGE1及びSAC1をアガロースゲル¹⁰上で424 bpのバンドを生成する酵素。

1. はBL21-MOG _タググリセロールストックと滅菌LB培地（LB）ブロス（0.1 mgのアンピシリン/ ml）を5ミリリットルを接種し、37℃、200rpmで一晩静置します。
2. 次の日の準備のために37℃のインキュベーターで滅菌LBブロス500 mlを含む2 1 L三角フラスコを置きます。
3. ステップ1.2（最終濃度0.1mg / mlのアンピシリン）から500ミリリットルのLBを含むフラスコのそれぞれに100ミリグラム/ mlのアンピシリンを500μlを追加します。 LBブロスの2つのフラスコのそれぞれにステップ1.1から一晩培養物の1ミリリットルを転送します。 37℃でインキュベートし、200rpmで5時間または0.6の光学密度まで。
4. フラスコの1から1 1ミリリットルのアリコートを取り、別の1.5ミリリットル遠心管にそれを転送します。 1分間16,000×gで細胞をペレット化し、上清を除去します。 T _0（プレ誘導）などのチューブにラベルを付け、その後に細菌ペレットを入れて-20将来のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGのための℃の冷凍庫E）解析（セクション8および図3を参照）。
5. 各培養フラスコに1 Mイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド、イソプロピルβ-D-チオガラクトシド（IPTG）の0.5ミリリットルを追加します。一晩75 rpmで室温で、その後、37℃、4時間、200 rpmでフラスコをインキュベートします。

2.収穫MOG _タグプロテイン

注：この段階では、細菌は、MOG _{タグタンパク}質を大量に生産しているであろう。 MOG _タグを収集するために、細菌は、まず、超音波処理、続いてトリトンX-100緩衝液中で溶解されます。 MOG _タグは、その後_{、MOG タグタンパク}質を含む粗タンパク質溶液を得、封入体から放出され、イミダゾールおよびグアニジンで変性されています。

1. ステップ1.5から一晩培養の1から1 1ミリリットルのアリコートを取り、1.5 mlのマイクロ遠心チューブにそれを転送します。 1分間16,000×gで細胞をペレット化し、上清を除去します。浴槽にラベルを付けますE T _{O / N（}誘導後）は、その後、-20将来のSDS PAGE分析のための℃の冷凍庫（ 図3）に細菌ペレットを入れます。
2. 高速遠心分離と互換性の250ミリリットル瓶の中で均等に文化を配布し、この時点から氷上にこれらを保ちます。 4℃で15分間22,000×gで細菌細胞をペレット化。
3. 上清を捨てます。 -20℃で細菌ペレットを保存するか、2.4に進みます。
4. トリトンX-100の60μlの50 mg / mlで鶏卵リゾチームの120μLを加えることによって、溶解緩衝液（0.1mg / mlの鶏卵リゾチーム、0.1％のTriton-X（v / v）のリン酸緩衝生理食塩水（PBS））を準備しますPBSの60 mLまで原液。
5. 再懸濁し、溶解緩衝液を30mlの総ステップ2.3からの細菌ペレットのすべてを組み合わせて。高速遠心分離が可能な丸底50mlチューブにこのボリュームを転送します。 30分間、30℃の水浴中で、このチューブを置きます。インキュベーション時間の間、チューブを振ります二回細胞を再懸濁します。
6. インキュベーション後、氷の上にチューブを転送し、20 kHzの、振幅70％、3秒、3秒オフパルス、およびラウンドあたり5パルス上のパルスで溶液を超音波処理します。 6総ラウンドのためのソリューションを超音波処理し、溶液がラウンドで、間に氷上で冷却します。
7. 遠心分離機4℃で15分間、24,000×gでソリューションを提供します。上清を捨て、ステップ一度2.5から2.7を繰り返します。 -20℃でペレットを保存するか、2.8に進みます。
8. 100mLのビーカーにNaClを0.8766 gのトリス-HCl 0.09456 g及びイミダゾール0.01021グラム添加することによって、バッファーA（500mMのNaCl、20mMのトリス-HCl、5mMのイミダゾール、pHは7.9）を準備します。体積28ミリリットルに達するまで、7.9まで、溶液のpHをH ₂ Oを加えます。その後、100ミリリットルの解決策を転送するメスシリンダー、ボリュームが30ミリリットルになるまでH ₂ Oを追加します。
9. 緩衝液A 30mlにステップ2.7からペレットを再懸濁し、3時間、4℃でこの溶液をインキュベートします。この時間の間にグアニジン-HClの17.2グラムを量ります。
10. ステップ2.6の場合と同じ設定を使用して、氷の上でソリューションを超音波処理します。次いで、溶液に塩酸グアニジンの17.2グラムを追加します。 MOG _{タグタンパク}質を可溶化するために、氷上で1時間、これをインキュベートします。
11. 遠心分離機4℃で30分間、24,000×gでソリューションを提供します。上清を収集し、タンパク質精製まで4℃で上清を保存します。

3.タンパク質精製

注：MOG _{タグタンパク質}は、溶出（Hisタグを介して）に帯電したニッケル樹脂に吸収の4ラウンドを通して精製されるであろう次の手順で。

1. 以下の緩衝液を作成します。
   1. 緩衝液B（500mMのNaCl、20mMのトリス-HCl、5mMイミダゾール、6 Mグアニジン-HCl、pHは7.9）を準備します。 500ミリリットルのビーカーに、NaClの5.844グラム、トリス塩酸の0.6304グラム、イミダゾールの0.0681グラム、および114.64グラムグアニジン-HClを追加します。そして、それが190ミリリットルになるまでH ₂ Oを追加し、7.9にpHを調整します。ゾルを転送250ミリリットルのutionは、メスシリンダー、ボリュームが200ミリリットルになるまでH ₂ Oを追加します。
   2. 溶出バッファー（500mMのNaCl、20mMのトリス-HCl、0.5 Mイミダゾール、6 Mグアニジン-HCl、pHは7.9）を準備します。 500 mLビーカーに、NaClの5.844グラム、トリス塩酸の0.6304グラム、イミダゾールの6.808グラム、および114.64グラムグアニジン-HClを追加します。それが190ミリリットルになるまでH ₂ Oを追加し、7.9にpHを調整します。 250ミリリットルにソリューションを移しメスシリンダー、ボリュームが200ミリリットルになるまでH ₂ Oを追加します。
   3. ストリップバッファー（500mMのNaCl、20mMのトリス-HCl、100mMのEDTA、pHは7.9）を準備します。 500 mLビーカーに、NaClの5.844グラム、トリス塩酸の0.6304グラム、40ミリリットルの500mM EDTAを追加します。それが190ミリリットルになるまでH ₂ Oを追加し、7.9にpHを調整します。 250ミリリットルにソリューションを移しメスシリンダー、ボリュームが200ミリリットルになるまでH ₂ Oを追加します。
   4. チャージバッファー（0.1 M硫酸ニッケル）を準備します。 500ミリリットルビーカーに5.257グラムの硫酸ニッケルを追加し、190ミリリットル（注意に達するまでH ₂ Oを追加し、ニッケルを処理しませんヒュームフードの外側の硫酸ニッケル、硫酸は、H ₂ O中に溶解されるまで）。硫酸ニッケルが溶解した後、250ミリリットルにソリューションを転送シリンダーを卒業し、体積が200ミリリットルになるまでH ₂ Oを追加します。
2. 4,500×gで（各チューブ5 ml）の上に遠心力に耐えることが可能な2コニカル50ml遠心管の間ニッケル樹脂10mlの分割。
3. 充電およびニッケル樹脂を平衡化：
   1. 40ミリリットルのH ₂ O樹脂を含む各チューブに添加することにより、樹脂を洗浄します。ロッカーの上に水平にチューブを置き、それらを4℃で5分間攪拌しましょう。一度、4℃で8分間、4500×gで、遠心管を終えました。
   2. ペレットを乱さないためにピペットで上清を捨てます。各チューブにチャージバッファの40ミリリットルを追加します。ロッカー上にチューブを移し、それらを4℃で15分間攪拌しましょう。一度、4℃で8分間、4500×gで、遠心管を終えました。
   3. 上清を捨てた後、チューブに緩衝液Bの40ミリリットルを追加します。ロッカー上にチューブを移し、それらを4℃で5分間攪拌しましょう。完了したら、遠心分離機、4℃で8分間、4500×gでチューブは、その後、上清を捨てます。
4. オプション：ステップ2.11に回収可溶化タンパク質の150μLを取り、1.5 mlのマイクロ遠心チューブに移します。プレインキュベーションのようなチューブにラベルを付け、将来のSDS PAGE分析のために-20℃で、これを凍結する（ 図3、原油MOG _タグ ）。
5. MOG _タグタンパク質を精製：
   1. 、ステップ3.3からのニッケル樹脂を含む第1のチューブ（ 図2、チューブ1）に（〜40ミリリットル、マイナスステップ3.4で削除少量のサンプルを）ステップ2.11から可溶化タンパク質のボリューム全体を移し混合し、ロッカー上に水平に置きます1時間4℃で。
   2. 4℃で8分間、4500×gでチューブを遠心。完成したら、第二に上清を移しますチューブ（ 図2、チューブ2）ニッケル樹脂の、前のステップで説明したようにインキュベートします。一方で、チューブ1と、以下の6のステップ3に進みます。
   3. 溶出緩衝液40mlにチューブ1中のニッケル樹脂を再懸濁し、4℃で5分間ロッカー上に水平にチューブを配置します。その後、4℃で8分間、4500×gでチューブを遠心します。
   4. 「精製されたMOG _{タグタンパク}質」の標識250ミリリットル瓶に溶出したMOG _{タグタンパク}質を含有する上清を移し、4℃で、このボトルを保持します。各溶出段階では、この瓶の中で得られた上清をプールします。
   5. ニッケル樹脂にストリップバッファの40ミリリットルを加え、4℃で5分間ロッカー上に水平に配置します。
   6. 4℃で8分間、4500×gでチューブを遠心。ステップ3.3に記載されているニッケル樹脂を充電、その後、上清を捨てます。
   7. いったん終了し、ステップ3.5に記載されているように、第二の管を進めます。 4ラウンドの合計希望、追加のタンパク質が吸収および溶出のさらなるラウンドで回収することができれば、帯電したニッケル樹脂および溶出へのステップ2.11から可溶化タンパク質の吸収のsが、けれども、タンパク質のほとんどを回復します。
6. 吸収および溶出の4（またはそれ以上）のラウンドが完了したら、一晩4℃でプールされた精製タンパク質を格納します。それが再び必要になるまでニッケル樹脂は、4℃で20％のエタノール溶液40mlに格納することができます。

4.タンパク質濃度を測定

注：さらに進む前に、この値は、プロトコルの終了時に、タンパク質を濃縮するために、最終的な体積を決定するために使用される部3で生成された精製されたMOG _{タグタンパク}質の量を定量化することが必要です。ここでは、標準的なブラッドフォードアッセイを説明します。精製されたMOG _{タグタンパク}質の濃度を連続dilutの分光吸光度を比較することによって決定されます既知の濃度のウシ血清アルブミン（BSA）の標準曲線とED MOG _タグタンパク質。

1. 3リットルのビーカー8.2グラムの酢酸ナトリウム、23 mlのに氷酢酸を添加することにより10倍の酢酸緩衝液を作り、次いで、酢酸ナトリウムを溶解し、H ₂ Oの1.9 Lを加えます。 2 Lに、このソリューションを移しメスシリンダー、ボリュームが2 Lに達するまで、次に室温で2 Lボトルに保管し、H ₂ Oを追加します。 H ₂ O 900μlに10倍の酢酸緩衝液100μlを添加することにより、1×酢酸緩衝液1mlを行います
2. G9に井戸G2-8と60μlに1×酢酸緩衝液30μlを添加することにより、希釈液用の96ウェルプレートを設定します。 H2およびH3に1×酢酸緩衝液の48μLを加えます。
3. 1×酢酸緩衝液の216μlを、よくG1で市販の2mg / mlのBSA標準の54μLを加え、よく混ぜ、次のように行GにおけるBSA標準の最初の連続希釈を設定します。 、よく混ぜ、よくG1からもG2に210μLを加えますそしてその後もG3によくG2の180μlを添加します。 、よくG4によくG3の150μLを加えよく混ぜ、よくG8まで後続の各ウェルに30μlの少ないを追加するこの傾向を続けています。 （同等の希釈因子のリストについては、 表1を参照）。
4. 井戸A1、B1、およびC1によくG1の10μLを転送することにより、各希釈の三重のサンプルを設定し、ウェルA2、B2、およびC2によくG210μlの、というように。マルチチャンネルピペットを使用してください。
5. MOG _タグの希釈液を設定するには、ステップ3.6からよくH1に精製されたMOG _{タグタンパク}質の60μlを添加します。 （これは1×H1で希釈、H2で1/5希釈、およびH3で1/25希釈を生産）完全に混合し、その後もH3によくH2の12μlを添加、よく混ぜ、ウェルH2にH1から12μlを添加します。
6. ステップ4.4で説明したように、列D、E、およびFに、ウェルH1〜H3の10μLを転送することにより、MOG _タグ希釈のための三重のサンプルを設定します。
7. タンパク質アッセイ色素を2mlを混合H ₂ Oの8ミリリットルと試薬の濃縮物利用可能な場合、マルチチャンネルピペットを使用して、列A、B、C、D、E、及びF内のすべてのプレロードのウェルにこの混合物の200μLを加えます。タンパク質濃度を読み取る前に針を使用してウェル内の気泡を開きます。
8. 色素試薬を添加する10分以内に、行A、B、C、D、E、およびF内のすべてのウェルの595 nmの吸光度を測定
9. 位置1-9が0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.05、および0 mg / mlでBSAに対応し、標準曲線を設定する行A、B、およびCを使用してください。この曲線に基づいて、最高の標準曲線にフィットMOG _タグの希釈を使用して、MOG _{タグタンパク}質の濃度を算出。通常、ここに記載されているプロトコルを使用して細菌培養液1 LからMOG _{タグタンパク}質の200〜250ミリグラムがあります。
   注：MOG _1-125がプロトコルの最後に記載されているオプションのセクション7に、ここから進行させるために。それ以外の場合は、セクション5に進みます。

5。透析

注：透析は徐々にタンパク質をリフォールディングすることを可能にする精製、変性MOG _タグを含む溶液からのグアニジンを除去します。 MOG自体は非常に不溶性であり、そしてこれはチオレドキシンタグの存在によって改善される一方で、まだ溶液から出てくるしやすいようにケアは、このステップの間に採取されなければなりません。したがって、リフォールディングは徐々に比較的低いMOG _タグ濃度で行われるべきです。

1. 濃度部4で算出されたMOG _タグの量に基づいて、0.5ミリグラム/ ml以下になるまで、透析を開始する前に、緩衝液B（ステップ3.1に記載されているとすることができる緩衝液B）を用いて精製したMOG _{タグタンパク}質を希釈します。
2. 蛇皮の透析チューブの約30センチカットし、3回にわたるヘビ皮の端を折り曲げると止血剤との折り畳まれた端部をクランプすることによってロック止血剤で一端を固定します。希で蛇を埋めますMOG _{タグタンパク}質その後開放端部からそれらを強制することにより、蛇から気泡を除去（チューブあたりMOG _{タグタンパク質}の60〜90ミリリットルの間）。最後に、第二のロック止血剤を使用して、チューブのもう一方の端をシールします。
3. すべてのMOG _{タグタンパク}質まで、透析チューブの追加セクションを埋めるための手順を繰り返し5.2は、蛇の透析チューブに転送されています。漏れがないことを確認してください。
4. グアニジン-HClの382.12グラムを秤量し、2リットルのビーカーにステップ4.1で行われた10倍の酢酸緩衝液の100ミリリットルを追加することで、4 Mグアニジンと1xの酢酸を加えます。ビーカーにH ₂ Oの0.5 Lを追加し、グアニジンHClを溶解させます。溶解後、1Lにソリューションを転送メスシリンダー、ボリュームが1 L.が必要とされる全ての2 snakeskinsためのこのレシピを繰り返し達するまでH ₂ Oを追加します。
5. 次のように透析を実行します。ステップ5.4から4 Mグアニジンと1xの酢酸緩衝液1Lで大きなバケツ（最小10 L）を記入してください。トンを置きますバケツにMOG _タグを含む透析チューブの2セクションO、底に妨害されずに回転させる磁気攪拌棒の余地を残します。磁気撹拌プレート上で4℃の部屋にバケツを置き、（ すなわち 、高い流体を移動させるだけで十分ではありません）遅い回転速度にそれをオンに：
   注：徐々にバッファにグアニジンの量を減らすために、次の手順を実行します。攪拌時間は最小値として与えられているが、一晩放置することができます。透析は、3日以上かかりますが、必要に応じてこれを拡張することができます。定期的にチューブが無傷であると端部がしっかりと閉じていることことを確認してください。
   1. バケットが座って、4-5時間撹拌してみましょう。
   2. 各バケットに1×酢酸緩衝液（100ミリリットル10倍の酢酸バッファー及びH ₂ Oの900ミリリットル）の1 Lを追加します。
   3. 繰り返しは、5.5.1と5.5.2バケット内のバッファの4 Lの合計3回の合計を繰り返します。
   4. （1バケットにバッファの半分を捨て、1×酢酸緩衝液1Lで補充00ミリリットル10倍の酢酸バッファー及びH ₂ Oの900ミリリットル、無グアニジン）とチューブと撹拌棒を設定します。
   5. 繰り返しは一度5.5.1と5.5.2ステップ（ すなわちバケット内のバッファの4 Lの合計があるまで）。
   6. 最後に、新鮮な1×酢酸緩衝液の4 Lとバケツで全体4 Lのボリュームを交換し、4-5時間攪拌してみましょう。最良の結果を得るために、タンパク質濃度の日に、この手順を実行します。
   7. 慎重にリフォールディングMOG _タグを持つ透析チューブを削除して、バケットバッファを破棄。

6.集中MOG _タグプロテイン

注：最後のステップでは、リフォールディングMOG _{タグタンパク}質を格納するための作業希釈液に濃縮します。 MOG _タグは非常に不溶性であるように、それは5 mg / mlとを超えてはなりません。完全フロイントadjuvで1：この濃度は、一般的に、マウスにおいてEAEを誘導するために使用される0.4 mg / mlでMOG _35-55ペプチド、（混合1とほぼ等モルでありますアリ（CFA））。少量のタンパク質は、白色の沈殿物の形で溶液から来るの濃縮プロセスの間、それは珍しいことではありません。過度の降水量は、しかし、問題となっています。

1. セクション4で算出された値に基づいて、5 mg / mlでのMOG _タグの濃度を達成するために、最終的な所望の体積を計算します。
2. アルミ箔とラインパン1において、ポリエチレングリコール（PEG）3350及びPEG 8,000とアルミ箔をカバー：1の比。 PEG 3350は、それが濃縮中にタンパク質凝集を防ぐかつ有効cyropreservative ¹¹であることができ、この混合物に組み込まれます。
3. ボリュームがステップで算出された推定最終容量（以下であるまで、これは室温で座って、定期的にボリュームを確認してみましょうアルミホイルの上に（内部MOG _{タグタンパク}質と_の ）蛇チューブを入れて、PEG 8000でカバー6.1）、実際の音量は、次のステップで測定されます。パンはなくなった場合濃縮プロセス中に水で過飽和は、アルミ箔とPEG 3350およびPEG 8000で新鮮なパンを設定します。
4. H ₂ Oでsnakeskinsの外側を洗浄し、血清学的ピペットを使用して、別のガラスボトルにMOG _{タグタンパク}質を転送します。タンパク質は、ボリュームが正しいことを確認するために転送されるボリュームを追跡します。
   1. 容積が推定最終容量よりも小さくされている場合、所望の体積に達するまで、1×酢酸塩緩衝液を加えます。ボリュームは、推定最終容量を超える場合、透析チューブに戻しMOG _{タグタンパク}質を転送し、濃度を続ける（6.2から6.3ステップ）。
   2. 1.5 mlチューブ（チューブ当たり0.5ミリリットル）の間でMOG _{タグタンパク}質を配布し、必要になるまで-80℃でチューブを保存します。 CFAで1：EAEを誘導するために、このボリューム1を混ぜます。
5. ステップ1で採取した試料を用いて、MOG _{タグタンパク}質の発現を確認するためにSDS PAGEゲルを実行します。4、2.1、3.4、およびステップ6.4から精製されたMOGタンパク質。

TEVプロテアーゼを使用したMOG _タグから7の生成MOG _1-125（オプション）

注：このオプションのステップは、ステップ余分なタグ配列のないMOG _1-125が必要な場合_は 、タグ配列は、TEVプロテアーゼを用いて除去することができる4（ 図4）の端から継続されます。限り我々が知っているように、純粋なMOG _1-125を生成することが可能な他の発現系はありません。しかし、チオレドキシンタグなしで、MOG _1-125は非常_に不溶性であることに留意すべきであり、これは、精製および取り扱い中に問題を引き起こし、そしてこの理由のための実験的な理由のために絶対に必要な場合、タグを除去することができます。いくつかのステップは、純粋なMOG _1-125を生成するために必要とされます。 MOG _タグが最初TEVプロテアーゼ切断緩衝液中に透析します。 TEVプロテアーゼによる消化に続いて、ボリュームが後の精製番目に支援するために低減されEPSは、次に緩衝液B中で透析し、次いでHisタグを含むタグ配列は、ニッケル樹脂を用いて除去されます。最後に、タンパク質を定量し、純粋MOG _1-125を最終濃度まで濃縮します。

1. 1.861グラムのEDTA、44.4グラムのTris-HCl、および2リットルのビーカーに26.5グラムのトリスを追加することで、10倍TEV切断緩衝液（500mMのトリス-HCl、5mMのEDTA）の1 Lにします。容量990ミリリットルに達するまでEDTAを溶解するpHを8に調整し、次いでH ₂ Oを加えます。 1 Lの解決策は、メスシリンダーを転送し、H ₂ Oを使用して1 Lまでのボリュームをもたらします
2. ステップ3.6〜0.5 mgの希薄MOG _{タグタンパク}質は、/ mlの説明したように120ミリリットルは、蛇の透析チューブに希釈したMOG _{タグタンパク}質のセクションで計算されたタンパク質の量に基づいて、4転送を緩衝液B（ステップ3.1で説明したのと同じバッファ）を使用して、手順5.3〜5.2インチボリュームはMOG _{タグタンパク}質のすべてを切断するために必要なTEVプロテアーゼの量はsubstaになりますがスケールアップすることができますntial。
3. ステップ7.1で行われた10倍のTEV切断緩衝液で10倍の酢酸緩衝液を交換する以外は、ステップ5.5に記載されている透析プロトコルに従ってください。
4. 新しい250ミリリットルのガラス瓶に、TEV切断緩衝液中で、今、MOG _タグを移し、透析からの増加量を監視します。ボトルに加えMOG _{タグタンパク}質のあらゆる2.85ミリリットルあたりのβメルカプトエタノールの1μLを加えます。 MOG _{タグタンパク}質のすべての50mgのために（5 mg / mlでの在庫のTEV溶液）TEVプロテアーゼの少なくとも1mgを追加します（TEVプロテアーゼが1時10分TEVまで追加することができます：MOGタンパク質比）、室温でインキュベートし、少なくとも72時間、光から保護。
   注：TEVプロテアーゼインキュベーションの終わりに、白色沈殿物をガラス瓶の底に見られるべきです。
5. タンパク質はガラス瓶に付着するタンパク質の沈殿物を防止するために、溶解するまで、透析管にタンパク質を転送する前に、この溶液に塩酸グアニジンを追加します。 150μlのを転送このソリューション1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブへと「TEVとMOG」としてチューブにラベルを付けます。将来のSDS-PAGE分析のために-20℃で溶液を保管してください。
6. ステップ5.3から5.2に記載されている透析チューブにステップ7.5からの流体のすべてを転送します。 H ₂ O 2Lで大きなバケツを記入し、バケツに透析チューブを配置します。光は一晩攪拌しながら4℃でインキュベートします。このステップは、タンパク質濃度が急速に発生し、タンパク質精製を妨害する溶液からEDTAの削除を開始できるようにするためにグアニジンを希釈することが重要です。
7. ステップ6.2〜6.3に記載された溶液の最終体積は〜40ミリリットルであるように（のみPEG 8000を使用することを除いて）透析チューブ中のタンパク質を濃縮します。 H ₂ Oで透析チューブを洗浄し、まだチューブに接続されているすべての残留PEG 8000を削除します。体積の減少は、ニッケルの再を含む50 mlチューブに消化されたタンパク質のすべてに適合することができます罪、ステップ3.5で説明したように。
8. 緩衝液Bに消化されたタンパク質を透析：
   1. バッファーB（29.22グラムのNaCl、3.152グラムのTris-HCl、0.3405グラムイミダゾール、グアニジン-HCl、pHが7.9の573.18グラム）の1 Lで大きなバケツを埋めます。
   2. （ステップ5.5でより詳細に説明するように）攪拌マグネットと一緒にバケツにステップ7.7から消化されたタンパク質を含むsnakeskinsを置きます。ゆっくりと攪拌に設定攪拌プレート上に4℃の低温室にバケツを置き、snakeskinsが5以上の時間透析することができます。
   3. バケツを空にし、バッファBの別の1 Lでそれを補充し、これが低速攪拌に設定攪拌プレート上に4℃の低温室で座ってsnakeskinsが5以上の時間透析することを可能にしましょう。
9. 切断されたタグ配列は、溶液中のMOG _1-125を残し_て 、ニッケル樹脂に拘束されることとなる重要な違いは、セクション3で説明するようにMOG _1-125タンパク質の精製を行います。この場合も、精製の4回になります同じボリュームで実行するが、この場合、目標は、純度を改善するためではなく、できるだけ多くのタンパク質を回収することです。 図4を参照してください。
   1. ステップ3.1に記載されているタンパク質精製バッファを作ります
   2. ステップ3.3で説明したようにニッケル樹脂の両方の管を充電してください。
   3. タグを含むニッケル樹脂からの溶出液は廃棄されることが不可欠除いて、ステップ3.5で詳述したプロトコルによってMOG _1-125を浄化しながら、（将来のSDS-PAGE分析では1.5 mlのマイクロ遠心チューブ内の溶出液の150μLを保ちます） MOG _1-125を含む溶液は、最終生成物として保持されています。
10. 第4節で説明したようにMOG _1-125タンパク質の濃度を測定します。
    1. ステップ4.2および4.4に記載されているように、BSA標準曲線希釈液を設定します。
    2. ステップ4.5および4.6に記載されているようにMOG _1-125の希釈液を設定します。あるいは、広い範囲を生成するために貴重であり得ます希釈（例えば1倍、1/2、1/4、1/8、）の。それに応じて1×酢酸緩衝液およびMOG _1-125のボリュームを調整します。
    3. 4.9にステップ4.7で説明したようにブラッドフォードアッセイを実行し、生成されたMOG _1-125の量を計算します。予想収量は約4 mg以上のタンパク質です。
11. セクション5で説明したように、透析を介したグアニジンの段階的除去によってMOG _1-125をリフォールディング。
12. 最終濃度は、5mg / mLのMOG _タグと等モルである2.24 mg / mlで、あるべきである項6に記載されているようMOG _1-125蛋白質を濃縮します。

8. SDS-PAGEゲルMOG _タグの生産及び純度を確認します

注：ステップ1.4から採取した試料を、2.1、3.4、6.4がMOG _タグ生産及び純度を確認するために、標準的なSDS-PAGEによって分析します。このステップは、MOG _タグまたはMOG _1-125のいずれかの最終精製した後に行われるべきです。

<李>はH ₂ Oの2ミリリットルにトリス塩酸の1.576グラムを添加することにより、2倍のSDS-PAGEローディングバッファーを作成し、pHを6.8に設定します。トリス-塩酸溶液中に0.4グラムのSDSを加え、ボリューム7ミリリットルに達するまで、H ₂ Oを加えます。
1. ステップ8.1で行われた溶液に、本の1ミリリットルを追加し、H ₂ Oの10ミリリットルにブロモフェノールブルーの0.2グラムを追加します。最後に、2×SDS-PAGEローディングバッファーを終了するグリセロールの2ミリリットルを追加します。このソリューションを保管する場合は、4℃で維持し、3ヶ月までのための光から保護します。
2. 室温でのステップ3.4および6.4からステップ1.4および2.1からの細菌の凍結アリコートと同様に可溶化されたMOG _{タグタンパク}質を解凍します。
3. タンパク質脱塩カラムに各60μlのを追加することにより、ステップ3.4および6.4に回収溶液から塩を除去します。製造者の指示に従って、タンパク質を精製します。
4. ステップ8.2で作られた溶液1mlにβメルカプトエタノールの20μLを追加します。 2 BACにこの40μlのを追加します。ステップ8.4から脱塩したタンパク質へのステップ8.3および60μlのからterialペレットおよび95℃で10分間これらをインキュベートします。
5. トリスの5グラム、28.8グラムのグリシン、および1グラムのSDSを計量することにより1×SDSページランニングバッファーを作成します。 1リットルのビーカーにこれらを追加し、すべてを溶解するために500mLのH ₂ Oを追加します。溶解したら容量が1リットルになるまで、1リットルの溶液をメスシリンダーに移し、H ₂ Oで充填
6. ランニングバッファーは、単にゲル中のウェルの上部上にあるようなゲル装置1X SDS-PAGEのランニングバッファーを追加し、ゲル装置12％ポリアクリルアミドゲルを設定します。ウェルに5回ずつバッファを実行して、50μlのピペットでゲルのウェルを洗浄します。
7. 第一のウェルにロードしたタンパク質ラダーを10μl、ウェルを分離するためにステップ8.5から煮ソリューションの10μlを添加します。 60分間115 Vでゲルを実行します。
8. 装置からゲルを外し、小さな容器に移します。コンタ塗りつぶし純粋なH ₂ O 100mlでINERし、8分間ゆっくり回転プラットフォームにコンテナを転送します。 8分後、水をダンプし、H ₂ Oで二回以上のゲルを洗います
9. 容器からのH ₂ Oをダンプし、容器に迅速な染色試薬の100ミリリットルを追加します。これは、一晩ゆっくりと回転台の上に座ってアルミホイルでカバーすることができます。
10. 迅速な染色試薬をダンプし、容器にH ₂ Oの約100ミリリットルを追加します。これは8分間の回転台の上に座ってできるようにします。 H ₂ Oをダンプし、H ₂ Oで2回洗浄を繰り返します。
11. 画像クーマシーブルー汚れ用イメージャーを用いてゲル。付近のバンド31.86 kDaの（MOG _{タグタンパク}質）および63.72 kDaの（MOG _{タグダイマー} ）でかすかなバンドを探してください。

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結果

精製が完了すると、サンプルがステップ1.4、2.1、3.4に回収し、ステップ6.4からの最終生成物は、タンパク質ゲル（ 図3A）上で実行する必要があります。 MOG _タグは、最初のT _{O / Nの}サンプルで31.86 kDaのバンドとして表示されますが、ないT _0、および最終的に純粋な生成物にのみバンドでなければならない必要があります。 MOG _タ?...

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ディスカッション

ここでは、MOG _{タグタンパク}質および方法MOG _{タグタンパク}質から純粋MOG _1-125を生成するための製造のためのプロトコルを記載しています。このプロトコルは、両方の標準的なHisタグベースのタンパク質精製方法、ならびに古いMOGベースのタンパク質¹⁵の世代のために以前に記載されたプロトコルに基づいています。それはここで説明されていないが、MOG _タ?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BL21 E. coli- pet32-MOGtag	Kerfoot lab		These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request.
LB broth miller	Bioshop	LBL407.1
Ampicillin	bio basic	AB0028	Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C.
IPTG	Bioshop	IPT002.5	Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C.
Chicken-egg lysozyme	Bioshop	LYS702.10	Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C.
Triton-X100	Sigma	T-8532
Phosphate buffered saline	life technologies	20012-027	Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient.
Sodium chloride	Bioshop	SOD004.1
Tris-HCl	Bioshop	TRS002.1
Imidazole	Bioshop	IMD508.100
Guanidine-HCl	Sigma	G3272	The quality must be greater than 98% purity.
0.5 M EDTA	bioshop	EDT111.500
Nickel (II) sulfate	Bioshop	NIC700.500
His bind resin	EMD Millipore	69670-3	Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C
Anhydrous ethanol	Commercial Alcohols	P016EAAN	Dilute with water as needed.
Glacial acetic acid	Bioshop	ACE222.1
Sodium acetate trihydrate	Bioshop	SAA305.500
bovine serum albumin standard	bio-rad	500-0206
Bio-rad protein assay dye reagent concentrate	bio-rad	500-0006
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate	Fisher scientific	BP120-500
Tris-base	Bioshop	TRS001.1
7000 MW Snakeskin dialysis tubing	Thermoscientific	68700
2-mercaptoethanol	Sigma	M3148-25ml	This reagent should not be handled outside of a fume hood.
AcTEV protease	lifetechnologies	12575-015	Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17
Polyethyleneglycol 3350	Bioshop	PEG335.1
polyethyleneglycol 8000	Bioshop	PEG800.1
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate	ebioscience	44-2404-21
Sonicator	Fisher scientific	FB-120-110
Eon microplate spectrometer	Biotek	11-120-611	This equipment uses the Gen5 data analysis software.
Gen5 data analysis software	BioTek
sodium dodecyl sulphate	Bioshop	SDS001
bromophenol blue	Bioshop	BRO777
Glycerol	Bioshop	GLY001
Protein desalting columns	Thermoscientific	89849
Glycine	Bioshop	GLN001
precast 12% polyacrylamide gel	bio-rad	456-1045
Rapid stain reagent	EMD Millipore	553215
Gel dock EZ imager	bio-rad	1708270
White Light Sample Tray	bio-rad	1708272	Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains
Protein ladder	bio-rad	1610375