Production et purification de souris myéline oligodendrocyte glycoprotéine simple et efficace pour auto-immune expérimentale encéphalomyélite études

Résumé

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

Résumé

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4⁺ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOG_tag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG_1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOG_tag or MOG_1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOG_tag protein. Immunization with either MOG_tag or MOG_1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

Introduction

La SEP est une maladie humaine chronique caractérisée par une inflammation et les maladies neurodégénératives du système nerveux central qui est censée être entraînée par une réponse auto-immune dirigée vers la myéline. La perte de la myéline et des axones au fil du temps le résultat de la baisse progressive de la fonction cognitive et motrice ^1. "Auto-immune expérimentale encéphalomyélite" est un terme générique pour les modèles animaux de la maladie auto-immune dirigée vers la myéline du SNC. Comme MS humaine, EAE est généralement caractérisée par une infiltration de cellules immunitaires du système nerveux central et, dans certains cas, ² démyélinisation. Cependant, la mesure dans laquelle un modèle EAE donné ressemble à MS humaine dépend en partie de l'espèce ou de la souche utilisée et de la complexité de la réponse auto-immune anti-myéline sous-jacente.

autoimmunité anti-myéline peut être induite expérimentalement de plusieurs façons, mais la méthode la plus couramment utilisée aujourd'hui consiste à immuniser des souris avec un peptide court d'acides aminés mimant le CD4 immunodominant ^{+ T épitope d'une protéine de myéline. Cela représente le minimum requis pour induire une réponse pathogène. Peut-être le plus commun de ces derniers est un peptide de 21 acides aminés dérivée de la myéline oligodendrocyte glycoprotéine (MOG _35-55), qui est utilisé pour induire l' EAE chez les souris C57BL / 6 3. Toutefois, pour certaines fins expérimentales, il est souhaitable, voire nécessaire, pour immuniser avec de plus grands antigènes protéiques et en effet il y a plusieurs avantages à cette immunisation avec plus de peptide court. Tout d'abord, en raison de la restriction du CMH, des peptides courts ne sont généralement efficaces dans une gamme très limitée de souches, tandis que les grands antigènes protéiques représentant soit l'ensemble de la protéine ou d'un domaine spécifique peuvent être traitées normalement pour la présentation sur plusieurs souches de souris consanguines ou même chez différentes espèces 4. En second lieu, un antigène de protéine plus grande est capable d'induire une réponse immunitaire plus complexe comportant plusieurs types de lymphocytes dans la reconnaissance des antigènes, plutôt que limiting reconnaissance de l' antigène aux lymphocytes T CD4 +. Par exemple, les cellules B via leur récepteur des cellules B (BCR) interagissent directement avec la protéine entière plutôt que de traiter. Nous et d' autres ont montré que les cellules B activées par MOG _35-55 vaccination ne reconnaissent pas la protéine MOG 5. Comme les cellules B ont été récemment démontré à jouer un rôle pathogène dans MS humaine 6, les modèles EAE qui incorporent les cellules B en pathologie auto - immune sont de plus en plus importante.}

Malgré les avantages de l'utilisation de plus grandes protéines d'antigènes pour induire l'EAE, il reste peu de sources disponibles dans le commerce pour de telles protéines. En effet, alors que les peptides courts comme MOG _35-55 peuvent être synthétisés très rapidement et à un coût relativement faible, les options commerciales pour la protéine MOG sont limitées et le coût nettement plus à l' achat. Néanmoins, il existe plusieurs vecteurs d'expression disponibles pour les groupes de recherche pour générer MOG domaine extracellulaire (MOG _1-125) eux - mêmes. However, tous les systèmes d'expression que nous avons identifiés dans la littérature sont basées sur les technologies plus anciennes qui ont depuis été remplacés par des systèmes d'expression plus efficaces ^7. En outre, la plupart sont basées sur le rat ou humain MOG ^8. Pour certaines enquêtes d'auto-immunité chez la souris, un antigène sur la base du autoantigène MOG de la souris est préférable. Enfin, toutes les protéines à base de MOG que nous avons identifiés, qu'ils soient commerciaux ou sous forme de vecteurs d'expression, sont des protéines de fusion contenant des acides aminés supplémentaires à la base MOG _1-125. Ceux-ci comprennent une étiquette pour la purification et le plus souvent d'autres séquences ainsi, dont beaucoup avec une fonction que nous étions incapables d'identifier.

Pour répondre à ces limitations, nous avons généré une nouvelle protéine de fusion sur la base du MOG domaine extracellulaire de la souris fusionnée à une étiquette contenant la thiorédoxine pour lutter contre l'insolubilité connu de la protéine MOG ^5. La séquence de balise contient également une séquence 6xHis pour la purification et une protéase TEV cleSite Avage qui permet l'élimination complète de toutes les séquences marqueur, si on le souhaite. Ceci est la seule méthode que nous sommes conscients de pour générer pur protéine MOG _1-125. Afin de faciliter la production de grandes quantités de protéine, dont la séquence a été MOG _1-125 codon optimisé pour l' expression bactérienne et la protéine _marqueur de fusion MOG a été insérée dans le système d'expression pET-32. Ici, nous décrivons en détail le protocole pour produire et purifier MOG protéine _étiquette, et MOG pur _1-125, en utilisant un équipement non spécialisé disponible pour la plupart des laboratoires d'immunologie.

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Protocole

1. L'induction de protéines

NOTE: Dans les étapes suivantes, BL21 bactéries Escherichia coli transformées avec un vecteur pET-32 contenant la séquence de la protéine MOG _tag de fusion (voir référence ⁵ et la figure 1) sont cultivées à des densités élevées et sont ensuite induites pour exprimer la _balise protéine MOG . Voir Figure 2 pour calendrier global - noter que les jours sont des points d'arrêt approximatives et alternatives sont notées dans le protocole. Si à partir de l' ADN _tag vecteur pET-32 MOG purifié, il sera nécessaire de transformer chimiquement en compétente BL21 E. bactéries coli en utilisant la sélection de l' ampicilline, comme cela a été bien décrit ^9. Transformation réussie peut être confirmée par la purification d' ADN à partir de bactéries sélectionnées à l' aide d' un kit commercial standard, suivie par une digestion avec les enzymes de restriction et Âge1 Sac1 pour produire une bande de 424 pb sur un gel d' agarose à ^10.

1. Inoculer 5 ml de bouillon Lysogénie (LB) de bouillon stérile (0,1 mg d' ampicilline / ml) avec un BL21-MOG _tag stock de glycérol et incuber pendant la nuit à 37 ° C, 200 rpm.
2. Placer deux flacons 1 L d'Erlenmeyer contenant 500 ml de bouillon LB stérile dans un incubateur à 37 ° C en préparation pour le lendemain.
3. Ajouter 500 ul de 100 mg / ml d'ampicilline à chacun des flacons contenant 500 ml de LB provenant de l'étape 1.2 (concentration finale 0,1 mg / ml d'ampicilline). Transférer 1 ml de la culture de la nuit à partir de l'étape 1.1 à chacun des deux flacons de bouillon LB. Incuber à 37 ° C et à 200 tours par minute pendant 5 heures ou jusqu'à une densité optique de 0,6.
4. Prendre une aliquote de 1 ml de l'un des flacons et la transfère dans un tube de 1,5 ml centrifugeuse séparée. Pellet les cellules à 16.000 xg pendant 1 min et retirer le surnageant. Étiqueter le tube en T ₀ (pré-induction) et ensuite mis le culot bactérien dans un congélateur à -20 ° C pour une future électrophorèse sur gel de Polyacrylamide dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) analyse (voir la section 8 et Figure 3).
5. Ajouter 0,5 ml de 1 M isopropyl β-D-thiogalactopyranoside 1, isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) à chaque flacon de culture. Incuber les flacons à 37 ° C, 200 rpm pendant 4 heures, puis à la température ambiante à 75 tours par minute pendant la nuit.

2. La récolte MOG _tag Protein

NOTE: A ce stade, les bactéries aura produit de grandes quantités de MOG _tag protéines. Pour récolter MOG _balise, les bactéries sont tout d' abord lysées dans un tampon Triton X-100 , suivi par sonication. MOG _tag est alors libéré de corps d'inclusion et dénaturé avec de l' imidazole et guanidine, résultant dans une solution de protéine brute contenant la _balise protéine MOG.

1. Prendre une aliquote de 1 ml de l'une des cultures d'une nuit à l'étape 1.5 et de le transférer dans un tube de 1,5 ml. Pellet les cellules à 16.000 xg pendant 1 min et retirer le surnageant. Étiquette de la baignoiree T _{O / N} (post-induction) puis mettre le culot bactérien dans un -20 ° C congélateur future analyse SDS page (Figure 3).
2. Distribuer les cultures équitablement entre 250 ml bouteilles compatibles avec centrifugation à grande vitesse et de garder ceux-ci sur la glace à partir de ce point. Pellet les cellules bactériennes à 22.000 xg pendant 15 min à 4 ° C.
3. Jeter le surnageant. Stocker les culots bactériens à -20 ° C ou passez à l'étape 2.4.
4. Préparer un tampon de lyse (0,1 mg / ml de lysozyme d'oeuf de poule, 0,1% de Triton-X (v / v) dans un tampon phosphate salin (PBS)) par l'addition de 60 ul de Triton X-100 et de 120 ul de 50 mg / ml d'oeuf de poule lysozyme solution mère à 60 ml de PBS.
5. Resuspendre et combiner tous les culots bactériens de l'étape 2.3 dans un total de 30 ml de tampon de lyse. Transférer ce volume à un tube de ml de fond 50 rond capable de centrifugation à grande vitesse. Placer ce tube dans un bain d'eau à 30 ° C pendant 30 min. Pendant le temps d'incubation, agiter le tubedeux fois pour remettre en suspension les cellules.
6. Après l'incubation, transférer le tube sur la glace et sonication la solution à 20 kHz, amplitude 70%, impulsion sur 3 sec, le pouls de 3 sec, et cinq impulsions par tour. Soniquer la solution pour six rounds totaux et laisser refroidir la solution sur la glace entre-deux tours.
7. Centrifuger la solution à 24.000 xg pendant 15 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et répétez les étapes 2,5-2,7 fois. Conserver le culot à -20 ° C ou passez à l'étape 2.8.
8. Préparer un tampon A (500 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, 5 mM d'imidazole, pH 7,9) par addition de 0,8766 g de NaCl, 0,09456 g de Tris-HCl et 0,01021 g d'imidazole à un bêcher de 100 ml. Ajouter la lettre H ₂ O jusqu'à ce que le volume atteint 28 ml , puis ajuster le pH de la solution à 7,9. Ensuite, transférer la solution à 100 ml graduée et ajouter H ₂ O jusqu'à ce que le volume est de 30 ml.
9. Remettre en suspension le culot de l'étape 2.7 dans 30 ml de tampon A et on incube cette solution à 4 ° C pendant 3 h. Pendant ce tempspeser 17,2 g de guanidine-HCl.
10. Soniquer la solution sur la glace en utilisant les mêmes paramètres que dans l'étape 2.6. Ensuite, ajouter 17,2 g de chlorhydrate de guanidine à la solution. Incuber cela sur la glace pendant 1 heure pour solubiliser la protéine MOG _{d'étiquette.}
11. Centrifuger la solution à 24.000 xg pendant 30 min à 4 ° C. Recueillir le surnageant et conserver le surnageant à 4 ° C jusqu'à la purification des protéines.

3. Purification de la protéine

NOTE: Dans les étapes suivantes de la _balise protéine MOG sera purifiée à travers 4 séries d'absorption sur résine de nickel chargé (via l'étiquette His) et l' élution.

1. Faire les tampons suivants:
   1. Préparer le tampon B (500 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, 5 mM d'imidazole, guanidine 6 M-HCl, pH 7,9). Ajouter 5,844 g de NaCl, 0,6304 g de Tris-HCl, 0,0681 g d'imidazole et 114,64 g de chlorhydrate de guanidine dans un bêcher de 500 ml. Ajouter ensuite de H ₂ O jusqu'à ce qu'elle atteigne 190 ml et ajuster le pH à 7,9. Transférer le solution à 250 ml graduée et ajouter H ₂ O jusqu'à ce que le volume est de 200 ml.
   2. Préparer un tampon d'élution (500 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, 0,5 M d'imidazole, guanidine 6 M-HCl, pH 7,9). Ajouter 5,844 g de NaCl, 0,6304 g de tris-HCl, 6,808 g d'imidazole et 114,64 g de chlorhydrate de guanidine dans un bêcher de 500 ml. Ajouter H ₂ O jusqu'à ce qu'il atteigne 190 ml et ajuster le pH à 7,9. Transférer la solution à 250 ml graduée et ajouter H ₂ O jusqu'à ce que le volume est de 200 ml.
   3. Préparer un tampon bande (500 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, 100 mM d'EDTA, pH 7,9). Ajouter 5,844 g de NaCl, 0,6304 g de Tris-HCl, 40 ml d'EDTA 500 mM à un bécher de 500 ml. Ajouter H ₂ O jusqu'à ce qu'il atteigne 190 ml et ajuster le pH à 7,9. Transférer la solution à 250 ml graduée et ajouter H ₂ O jusqu'à ce que le volume est de 200 ml.
   4. Préparer le tampon de charge (sulfate de 0,1 M de nickel). Ajouter 5,257 g de sulfate de nickel à un bécher de 500 ml et ajoutez H ₂ O jusqu'à ce qu'il atteigne 190 ml (ATTENTION, ne pas manipuler le nickelsulfate extérieur d'une hotte jusqu'à ce que le sulfate de nickel a été dissous dans H ₂ O). Une fois que le sulfate de nickel est dissous, transférer la solution dans 250 ml cylindre gradué et ajouter la lettre H ₂ O jusqu'à ce que le volume atteigne 200 ml.
2. Diviser 10 ml de résine de nickel entre deux coniques tubes de 50 ml de centrifugeuses capables de résister à des forces centrifuges plus de 4500 xg (5 ml dans chaque tube).
3. Chargez et équilibrer la résine de nickel:
   1. Laver la résine par addition de 40 ml de H ₂ O dans chaque tube contenant de la résine. Poser les tubes horizontalement sur une bascule et laissez-les agiter pendant 5 min à 4 ° C. Une fois terminé, centrifuger les tubes à 4500 xg pendant 8 min à 4 ° C.
   2. Jeter le surnageant par pipetage pour ne pas perturber le culot. Ajouter 40 ml de tampon de charge à chaque tube. Transférer les tubes sur un rocker et laissez-les agiter pendant 15 min à 4 ° C. Une fois terminé, centrifuger les tubes à 4500 xg pendant 8 min à 4 ° C.
   3. Jeter le surnageant puis ajouter 40 ml de tampon B dans les tubes. Transférer les tubes sur un rocker et laissez-les agiter pendant 5 min à 4 ° C. Une fois terminé, centrifuger les tubes à 4500 xg pendant 8 min à 4 ° C puis jeter les surnageants.
4. Facultatif: Prendre 150 pi de la protéine solubilisée recueillies à l'étape 2.11 et le transférer dans un tube de 1,5 ml. Etiqueter le tube comme pré-incubation et congeler ce à -20 ° C pour une future analyse SDS page (Figure 3, brut MOG _tag).
5. Purifier le MOG _tag Protein:
   1. Transférer la totalité du volume de la protéine solubilisée de l' étape 2.11 (~ 40 ml, moins le petit échantillon prélevé à l' étape 3.4) dans le premier tube (figure 2, le tube 1) contenant une résine de nickel à partir de l' étape 3.3, mélanger et placer horizontalement sur un basculeur à 4 ° C pendant 1 heure.
   2. Centrifuger le tube à 4500 xg pendant 8 min à 4 ° C. Une fois terminé, transférer le surnageant à la secondeTube (figure 2, le tube 2) de résine de nickel et laisser incuber comme décrit dans l'étape précédente. En attendant, continuez avec les étapes 3 à 6 ci-dessous avec tube 1.
   3. Remettre en suspension la résine de nickel dans le tube 1 dans 40 ml de tampon d'élution et de placer le tube horizontalement sur une bascule à 4 ° C pendant 5 min. Ensuite, centrifuger le tube à 4500 xg pendant 8 min à 4 ° C.
   4. Transférer le surnageant contenant la protéine éluée MOG _d'étiquette dans un flacon de 250 ml étiqueté «protéine MOG _tag purifiée» et de garder cette bouteille à 4 ° C. A chaque étape d'élution, en commun le surnageant résultant dans cette bouteille.
   5. Ajouter 40 ml de tampon de bande à la résine de nickel et de placer horizontalement sur un balancier pendant 5 min à 4 ° C.
   6. Centrifuger le tube à 4500 xg pendant 8 min à 4 ° C. Jeter le surnageant, puis rechargez la résine de nickel comme indiqué dans l'étape 3.3.
   7. Une fois terminé, aller de l'avant avec le second tube comme indiqué dans l'étape 3.5. Un total de 4 roundl 'absorption de la protéine solubilisée de l'étape 2.11 sur la résine chargée de nickel et une élution va récupérer la majeure partie de la protéine, bien que, si on le souhaite, la protéine supplémentaire peut être récupérée dans des cycles supplémentaires d'absorption et élution.
6. Une fois que les quatre (ou plus) cycles d'absorption et l'élution sont terminées, stocker la protéine purifiée regroupées à 4 ° C pendant une nuit. une résine de nickel peut être stockée dans 40 ml d'une solution d'éthanol à 20% à 4 ° C jusqu'à ce qu'il soit à nouveau nécessaire.

4. Mesure de la concentration de la protéine

NOTE: Avant d' aller plus loin , il est nécessaire de quantifier la quantité de protéine purifiée MOG _d'étiquette générée dans la section 3. Cette valeur sera utilisée pour déterminer le volume final de concentrer la protéine à la fin du protocole. Nous décrivons une norme Bradford Assay ici. La concentration de la protéine purifiée MOG _d'étiquette est déterminée en comparant l'absorbance spectrale de la série diluted protéine MOG _étiquette à une courbe étalon de sérum albumine bovine (BSA) à une concentration connue.

1. Faire 10x tampon acétate en y ajoutant 23 ml d' acide acétique glacial et 8,2 g d' acétate de sodium dans un bêcher de 3 litres, puis ajouter 1,9 l de H ₂ O pour dissoudre l'acétate de sodium. Transférer cette solution à un 2 L graduée et ajouter H ₂ O jusqu'à ce que le volume atteint 2 L. Puis rangez - le dans un 2 L bouteille à la température ambiante. Faire 1 ml de tampon acétate 1x en ajoutant 100 ul de 10 x tampon acétate à 900 pl de H ₂ O.
2. Mettre en place une plaque à 96 puits pour des dilutions en ajoutant 30 pi de tampon d'acétate 1x puits G2-8 et 60 pi à G9. Ajouter 48 ul de tampon acétate 1x à H2 et H3.
3. Mettre en place la dilution en série initiale de la norme BSA dans la ligne G comme suit: Ajouter 216 pi de tampon d'acétate 1x et 54 pi de disponible dans le commerce 2 mg norme / ml de BSA dans G1 bien et bien mélanger. Ajouter 210 ul de G1 et G2 bien, bien mélanger,puis ajouter 180 pi de G2 et G3 ainsi. Ajouter 150 pi de G3 et G4 à bien, bien mélanger et poursuivre cette tendance de l'ajout de 30 ul moins à chaque puits subséquent jusqu'à ce G8 ainsi. (Voir le tableau 1 pour les listes de facteurs de dilution équivalente).
4. Mettre en place trois échantillons de chaque dilution en transférant 10 pi de G1 bien aux puits A1, B1 et C1, et 10 pi de G2 et aux puits A2, B2, C2 et, et ainsi de suite. Utiliser une pipette à canaux multiples.
5. Pour mettre en place des dilutions de MOG _tag, ajouter 60 pi de protéine purifiée MOG _d'étiquette de l' étape 3.6 à H1 bien. Ajouter 12 ul de H1 puits à H2, bien mélanger, puis ajouter 12 pi de H2 puits à H3, mélanger soigneusement (cela produit une dilution de 1x en H1, 1/5 dilution dans H2, et 1/25 dilution dans H3) .
6. Mettre en place des échantillons en triple pour les dilutions _variables MOG en transférant 10 ul de puits H1-H3 à des lignes D, E et F comme décrit à l' étape 4.4.
7. Mélanger 2 ml de dosage de protéine de colorantConcentré de réactif avec 8 ml de H ₂ O. Ajouter 200 ul de ce mélange dans tous les puits pré-chargés dans les lignes A, B, C, D, E et F, en utilisant une pipette à canaux multiples, si elle est disponible. Pop les bulles dans le puits à l'aide d'une aiguille avant de lire la concentration en protéines.
8. En 10 minutes de l'addition du réactif de coloration, la mesure de l'absorbance 595 nm de chaque puits dans les rangées A, B, C, D, E et F.
9. Utilisez les lignes A, B et C pour mettre en place une courbe standard où les positions 1-9 correspondent à 0,4, 0,35, 0,3, 0,25, 0,2, 0,15, 0,1, 0,05 et 0 mg / ml de BSA. Sur la base de cette courbe, calculer la concentration de MOG _tag protéine en utilisant la dilution de MOG _balise qui correspond le mieux à la courbe standard. En règle générale, il y aura 200 à 250 mg de protéine MOG _marqueur de 1 litre de culture bactérienne en utilisant le protocole décrit ici.
   NOTE: Pour faire MOG _1-125 procéder d'ici à la section optionnelle 7 indiqué à la fin du protocole. Sinon, passez à l'article 5.

5. Dialyse

REMARQUE: La dialyse est effectuée pour éliminer progressivement guanidine de la solution contenant purifiée, _étiquette MOG dénaturé pour permettre à la protéine de se replier. Des précautions doivent être prises au cours de cette étape que MOG lui-même est très insoluble, et tout cela est améliorée par la présence de la balise thiorédoxine, il est toujours enclin à sortir de la solution. Par conséquent, le repliement doit être effectué progressivement et à une concentration relativement faible MOG _{d'étiquette.}

1. Avant de commencer la dialyse, diluer la MOG protéine _étiquette purifiée avec un tampon B (tampon B peut être réalisé comme indiqué dans l' étape 3.1) jusqu'à ce que la concentration est de 0,5 mg / ml ou moins, en fonction de la quantité de MOG _tag calculé à la section 4.
2. Couper environ 30 cm de tube de dialyse peau de serpent et fixer une extrémité d'une pince hémostatique de verrouillage en repliant l'extrémité de la peau de serpent sur trois fois et serrer l'extrémité repliée de la pince hémostatique. Remplissez le snakeskin avec diluéProtéine MOG _tag (entre 60 à 90 ml de MOG protéine _étiquette par tube) , puis éliminer les bulles d'air de la peau de serpent en les forçant hors de l'extrémité ouverte. Enfin, sceller l'autre extrémité du tube à l'aide d'une seconde pince hémostatique de verrouillage.
3. Répétez l' étape 5.2 pour remplir les sections supplémentaires de tube de dialyse jusqu'à ce que toute _étiquette protéine MOG a été transféré dans un tube de dialyse snakeskin. Assurez-vous qu'il n'y a pas de fuites.
4. Faire l'acétate 1x avec 4 M guanidine en pesant 382,12 g de guanidine-HCl et en ajoutant 100 ml de 10x tampon d'acétate faites à l'étape 4.1 à 2 L bêcher. Ajouter 0,5 l de H ₂ O dans le bêcher et laisser le chlorhydrate de guanidine pour dissoudre. Une fois dissous, transférer la solution à un 1 L éprouvette graduée et ajouter H ₂ O jusqu'à ce que le volume atteint 1 L. Répétez cette recette pour tous les 2 peaux de serpents qui sont nécessaires.
5. Effectuer la dialyse comme suit: remplir un grand seau (minimum 10 L) avec 1 L de tampon acétate 1x avec 4 M guanidine de l'étape 5.4. Placez jusqu'à to 2 sections de tube de dialyse contenant MOG _tag dans le seau, laissant place à une barre d'agitation magnétique pour tourner librement dans le fond. Mettez le seau dans une chambre de 4 C ° sur une plaque d'agitation magnétique et tourner à une vitesse de rotation lente (c. -à- pas élevé, juste assez pour déplacer le fluide):
   REMARQUE: Effectuez les étapes suivantes pour réduire progressivement la quantité de guanidine dans la mémoire tampon. temps de Stir sont donnés à titre minimum, mais peuvent être laissés pendant la nuit. La dialyse prendra un minimum de 3 jours, mais cela peut être étendu si désiré. Vérifiez régulièrement pour vous assurer que le tube est intact et que les extrémités sont bien fermé.
   1. Laissez le seau asseoir et agiter pendant 4-5 heures.
   2. Ajouter 1 litre de tampon acétate 1x (100 ml 10x tampon acétate et 900 ml de H ₂ O) dans chaque godet.
   3. Répétez les étapes 5.5.1 et 5.5.2 un total de 3 fois pour un total de 4 L de tampon dans le seau.
   4. Jeter la moitié de la mémoire tampon dans le seau et le remplir avec 1 litre de tampon acétate 1x (100 ml 10x tampon acétate et 900 ml de H ₂ O, pas guanidine) et mettre en place la barre de tube et remuer.
   5. Répétez les étapes 5.5.1 et 5.5.2 une fois (soit jusqu'à il y a un total de 4 L de tampon dans le seau).
   6. Enfin, remplacer la totalité du volume 4 L dans le seau avec 4 litres de tampon acétate de 1x frais et laisser l'agitation pendant 4-5 heures. Pour de meilleurs résultats, cette étape le jour de la concentration en protéines.
   7. Retirez délicatement le tube de dialyse avec repliée _tag MOG et jeter le tampon du godet.

6. Concentrer MOG _tag Protein

NOTE: Dans la dernière étape, la protéine repliée _tag MOG est concentré à la dilution de travail pour le stockage. Comme MOG _tag est très insoluble, il ne doit pas dépasser 5 mg / ml. Cette concentration est à peu près équimolaire avec 0,4 mg / ml de peptide MOG _35-55, qui est couramment utilisé pour induire l' EAE chez les souris (mélange 1: 1 avec complet de Freund adjuvant (CFA)). Au cours du processus de concentration, il est fréquent qu'une petite quantité de protéines pour sortir de la solution sous forme de précipité blanc. précipitation excessive est un problème, cependant.

1. Calculer le volume final désiré pour obtenir une concentration _de MOG _tag de 5 mg / ml, sur la base de la valeur calculée à la section 4.
2. Tapisser un moule de papier d'aluminium et couvrir la feuille d'aluminium avec du polyéthylène glycol (PEG) 3350 et le PEG 8000 à un ratio de 1: 1. Le PEG 3350 est incorporé dans ce mélange , car il peut aider à prévenir l' agrégation des protéines lors de la concentration et est un moyen efficace cyropreservative ^11.
3. Mettre le tube de serpent (avec MOG protéine _étiquette à l' intérieur) sur le dessus de la feuille d'aluminium et couvrir avec PEG 8000. Que ce sit à la température ambiante et de vérifier le volume régulièrement jusqu'à ce que le volume est égal ou inférieur au volume final estimée (calculée à l' étape 6.1) le volume réel sera mesuré dans l'étape suivante. Si la casserole devientsursaturé avec de l'eau pendant le processus de concentration, mis en place une nouvelle casserole avec une feuille d'aluminium et PEG 3350 et le PEG 8000.
4. Laver l'extérieur des peaux de serpent avec H ₂ O et transférer la protéine MOG _d'étiquette sur une bouteille de verre séparé en utilisant une pipette sérologique. Garder une trace du volume que la protéine est transférée à assurer le volume est correct.
   1. Si le volume a été réduit en dessous du volume final prévu, ajouter un tampon d'acétate 1x jusqu'à ce que le volume souhaité soit atteint. Si le volume est supérieur au volume final estimé, transférer le _tag protéine MOG retour dans le tube de dialyse et de poursuivre la concentration (étapes 6.2-6.3).
   2. Distribuer la _balise protéine MOG entre tubes de 1,5 ml (0,5 ml par tube), stocker les tubes à -80 ° C jusqu'à ce que nécessaire. Pour induire l'EAE, mélanger ce volume 1: 1 avec CFA.
5. Exécuter un gel de SDS - PAGE pour confirmer l'expression de la protéine _étiquette MOG en utilisant les échantillons prélevés dans les étapes 1.4, 2.1, 3.4, et la protéine MOG purifiée à partir de l'étape 6.4.

7. Génération MOG _1-125 de MOG _tag utilisant TEV Protease (Facultatif)

REMARQUE: Cette étape facultative continue à partir de la fin de l' étape 4. Si MOG _1-125 sans séquences de balises supplémentaires est nécessaire, les séquences de balises peuvent être éliminées en utilisant la protéase TEV (Figure 4). Pour autant que nous le sachions, il n'y a aucun autre système d'expression capable de générer pur MOG _1-125. Toutefois, il convient de noter que , sans l'étiquette thioredoxine, MOG _1-125 est fortement insoluble, ce qui peut causer des problèmes lors de la purification et la manipulation, et pour cette raison enlever l'étiquette si cela est absolument nécessaire pour des raisons expérimentales. Plusieurs étapes sont nécessaires pour générer pur MOG _1-125. MOG _tag est d' abord dialysée dans un tampon de clivage de protéase TEV. Après la digestion avec la protéase TEV, le volume est réduit à l'aide d'une purification ultérieure de steps, puis dialysées dans le tampon B, puis la séquence de marqueur His-tag contenant est éliminé en utilisant la résine de nickel. Enfin, la protéine est quantifiée et MOG pur _1-125 est concentré à la concentration finale.

1. Faire 1 litre de tampon 10x TEV de clivage (500 mM de Tris-HCl, 5 mM EDTA) en y ajoutant 1,861 g d'EDTA, 44,4 g de Tris-HCl et 26,5 g de Tris à un bécher de 2 L.. Ajouter H ₂ O jusqu'à ce que le volume atteint 990 ml , puis ajuster le pH à 8 pour dissoudre l'EDTA. Transférer la solution à un 1 L graduée et porter le volume à 1 L en utilisant H ₂ O.
2. Diluer MOG _tag protéine à partir de l' étape de 3,6 à 0,5 mg / ml en utilisant un tampon B (le même tampon décrit dans l' étape 3.1), sur la base de la quantité de protéine calculée à la section 4. Transfert 120 ml de diluée protéine MOG _d'étiquette à un tube de dialyse de snakeskin comme décrit dans les étapes 5.2 à 5.3. Le volume peut être étendu cependant la quantité de protéase TEV nécessaire pour cliver la totalité de la protéine MOG _tag sera SUBSTAntial.
3. Suivre le protocole de dialyse énumérés à l'étape 5.5, à l'exception de remplacer le tampon 10x acétate avec un tampon de clivage 10x TEV faite à l'étape 7.1.
4. Transférer la _balise MOG, maintenant dans un tampon de clivage TEV, à un nouveau flacon de 250 ml en verre et surveiller l'augmentation du volume de la dialyse. Ajouter 1 pi de β-mercapto-éthanol par tous les 2,85 ml de MOG protéine ajoutée à la bouteille _{d'étiquette.} Ajouter au moins 1 mg de TEV protéase (solution de TEV à 5 mg / ml) pour 50 mg de MOG _tag protéines (TEV protéase peut être ajouté jusqu'à 1:10 TEV: rapport de la protéine MOG) et incuber à température ambiante, abri de la lumière pendant au moins 72 heures.
   NOTE: A la fin de la protéase TEV incubation, des précipités blancs devraient être considérés au fond de la bouteille en verre.
5. Avant de transférer la protéine à un tube de dialyse, ajouter le chlorhydrate de guanidine à la solution jusqu'à ce que les protéines se dissolvent pour empêcher la précipitation des protéines de coller à la bouteille en verre. Transférer 150 ul decette solution dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml et d'étiqueter le tube comme "MOG avec TEV". Conserver la solution à -20 ° C pour une future analyse SDS-PAGE.
6. Transférer la totalité du liquide provenant de l'étape 7.5 dans un tube de dialyse comme indiqué dans les étapes 5.2 à 5.3. Remplir un grand seau avec 2 litres de H ₂ O et placer le tube de dialyse dans le seau. Incuber ce à 4 ° C avec de la lumière une nuit d'agitation. Cette étape est importante pour diluer la guanidine pour permettre à la concentration des protéines de se produire rapidement et de commencer à enlever l'EDTA à partir de la solution qui va interférer avec la purification des protéines.
7. Concentrer la protéine dans le tube de dialyse comme indiqué dans les étapes 06.02 à 06.03 (à l'exception seulement d'utiliser le PEG 8000), de sorte que le volume final de la solution est d'environ 40 ml. Laver le tube de dialyse avec du H ₂ O et éliminer tout résidu de PEG 8000 toujours fixée à la tubulure. Cette réduction du volume permet d'adapter l'ensemble de la protéine digérée dans un tube de 50 ml contenant du nickel rele péché, tel que décrit à l'étape 3.5.
8. Dialyser la protéine digérées au tampon B:
   1. Remplir un grand seau avec 1 litre de tampon B (29,22 g de NaCl, 3,152 g de Tris-HCl, 0,3405 g Imidazole 573,18 g de guanidine-HCl, pH 7,9).
   2. Placez les peaux de serpent contenant de la protéine digérée de l'étape 7.7 dans le seau le long d'un aimant d'agitation (comme décrit plus en détail dans l'étape 5.5). Mettez le seau dans un 4 ° C chambre froide sur une plaque d'agitation réglée à une agitation lente et laisser les peaux de serpent à dialyser pendant 5 ou plusieurs heures.
   3. Vider le seau et le remplir avec un autre 1 L de tampon B et que ce sont assis dans la salle C 4 ° froide sur une plaque d'agitation réglée à une agitation lente et laisser les peaux de serpent à dialyser pour 5 ou plus h.
9. Effectuer la purification de la MOG _1-125 protéines comme indiqué dans la section 3, avec la différence importante que les séquences de balises clivées seront liés par la résine de nickel, laissant MOG _1-125 en solution. Encore une fois, 4 cycles de purification serontréalisée sur le même volume, mais dans ce cas, le but est d'améliorer la pureté, plutôt que de récupérer autant de protéine que possible. Voir la figure 4.
   1. Faire les tampons de purification des protéines énumérées à l'étape 3.1
   2. Chargez les deux tubes de résine de nickel comme décrit dans l'étape 3.3.
   3. Purifier MOG _1-125 par le protocole détaillé dans l' étape 3.5, à l'exception essentiel que l'éluat de la résine contenant du nickel marqueur est mis au rebut (keep 150 pi de l'éluat dans un tube de 1,5 ml pour une analyse ultérieure par SDS-PAGE), tandis que la solution contenant _1-125 MOG est retenu comme produit final.
10. Mesurer la concentration de MOG _1-125 protéine telle que décrite dans la section 4:
    1. Mettre en place les dilutions de courbe standards BSA comme décrit dans les étapes 4.2 et 4.4.
    2. Mettre en place les dilutions de MOG _1-125 comme décrit dans les étapes 4.5 et 4.6. En variante, il peut être utile de générer un plus grand éventailde dilutions (1x, 1/2, 1/4 et 1/8, par exemple). Ajustez les volumes de 1x tampon acétate et MOG _1-125 en conséquence.
    3. Effectuer le dosage de Bradford comme décrit dans les étapes 04.07 à 04.09 et de calculer la quantité de MOG _1-125 généré. Le rendement attendu est d'environ 4 mg ou plus de protéines.
11. Replier MOG _1-125 par l' élimination progressive de guanidine par dialyse, comme décrit dans la section 5.
12. Concentrez - MOG _1-125 protéine telle que décrite dans la section 6. La concentration finale devrait être de 2,24 mg / ml, qui est équimolaire à 5 mg / _tag MOG mL.

8. SDS-PAGE Gel pour la confirmation MOG _tag Production et Pureté

NOTE: Les échantillons prélevés sur les étapes 1.4, 2.1, 3.4 et 6.4 sont analysées par SDS-PAGE standard pour confirmer MOG production _{d'étiquettes} et de pureté. Cette étape doit être effectuée après la purification finale soit _tag MOG ou MOG _1-125.

1. Faire un tampon de charge 2x SDS-PAGE en y ajoutant 1,576 g de Tris-HCl à 2 ml de H ₂ O et réglé le pH à 6,8. Ajouter 0,4 g SDS dans la solution de Tris-HCl, puis ajouter H ₂ O jusqu'à ce que le volume atteint 7 ml.
2. Ajouter 0,2 g de bleu de bromophénol à 10 ml de H ₂ O puis ajouter 1 ml de ce à la solution faite à l' étape 8.1. Enfin, ajouter 2 ml de glycérol pour terminer le tampon de charge 2x SDS-PAGE. Lors du stockage de cette solution, garder à 4 ° C et le protéger de la lumière pour un maximum de 3 mois.
3. Décongeler les aliquotes congelées de bactéries à partir des étapes 1.4 et 2.1, ainsi que la MOG solubilisé protéine _étiquette des étapes 3.4 et 6.4 à la température ambiante.
4. Retirer les sels des solutions recueillies dans les étapes 3.4 et 6.4 en ajoutant 60 pi de chaque colonnes de protéine de dessalage. Purifier les protéines en suivant les instructions du fabricant.
5. Ajouter 20 ul de β-mercapto-éthanol, 1 ml de la solution préparée à l'étape 8.2. Ajouter 40 pi de cette aux deux bacGranulés maté- de l'étape 8.3 et 60 pi aux protéines dessalée provenant de l'étape 8.4 et incuber ceux-ci à 95 ° C pendant 10 min.
6. Faire la page SDS tampon de course 1x en pesant 5 g de Tris, 28,8 g de glycine et 1 g SDS. Ajouter à un bêcher de 1 litre et ajouter 500 ml de H ₂ O pour dissoudre tout. Une fois dissous, transférer la solution à un 1 L éprouvette graduée et remplir avec H ₂ O jusqu'à ce que le volume atteint 1 L.
7. Mise en place d'un gel de Polyacrylamide à 12% dans un appareil à gel puis ajouter le tampon en cours d'exécution par SDS-PAGE 1x à l'appareil de gel, tel que le tampon est en cours d'exécution juste au-dessus du sommet des puits dans le gel. Laver les puits du gel par pipetage de 50 ul d'un tampon en cours d'exécution dans les puits cinq fois chacun.
8. Charge 10 pi de protéine échelle dans le premier puits et ajouter 10 pi des solutions bouillies de l'étape 8.5 pour séparer les puits. Exécutez le gel à 115 V pendant 60 min.
9. Retirer le gel de l'appareil et de le transférer dans un petit récipient. Remplissez le container avec 100 ml de pur H ₂ O et transférer le récipient vers une plate - forme en rotation lente pendant 8 min. Après 8 minutes, vider l'eau et laver le gel deux fois avec H ₂ O.
10. Vider le H ₂ O à partir du récipient et ajouter 100 ml de réactif de coloration rapide au récipient. Permettre que cette reposer sur une plate-forme tournante lentement pendant la nuit, couvrir de papier d'aluminium.
11. Vider le réactif de coloration rapide et ajouter environ 100 ml de H ₂ O au récipient. Permettre que cette reposer sur une plate-forme tournante pendant 8 min. Dump de l'H ₂ O et répéter deux fois le H ₂ O lavage.
12. Image du gel en utilisant un imageur pour les taches bleu Coomassie. Recherchez une bande autour de 31,86 kDa (MOG _tag protéine) et une bande plus faible à 63.72 kDa (MOG _tag dimères).

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Résultats

Une fois la purification terminée, les échantillons prélevés dans les étapes 1.4, 2.1, 3.4, et le produit final de l' étape 6.4 doivent être exécutés sur un gel de protéine (figure 3A). MOG _tag devrait d' abord apparaître comme une bande 31,86 kDa dans l'échantillon T _{O / N,} mais pas T _0, et devrait être le seul groupe dans le produit pur final. Pour tester si la _balise protéine MOG a correctement repl...

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Discussion

Ici, nous avons décrit un protocole pour la production de MOG protéine _étiquette et comment générer MOG pur _1-125 de la protéine MOG _{d'étiquette.} Ce protocole est basé à la fois sur la base des procédés de purification de protéines His-tag standard, ainsi qu'un protocole décrit précédemment pour la production d'une protéine à base de MOG âgée ^15. Bien qu'il ne soit pas décrit ici, l'utilisation primaire de la protéine MOG _tag...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BL21 E. coli- pet32-MOGtag	Kerfoot lab		These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request.
LB broth miller	Bioshop	LBL407.1
Ampicillin	bio basic	AB0028	Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C.
IPTG	Bioshop	IPT002.5	Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C.
Chicken-egg lysozyme	Bioshop	LYS702.10	Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C.
Triton-X100	Sigma	T-8532
Phosphate buffered saline	life technologies	20012-027	Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient.
Sodium chloride	Bioshop	SOD004.1
Tris-HCl	Bioshop	TRS002.1
Imidazole	Bioshop	IMD508.100
Guanidine-HCl	Sigma	G3272	The quality must be greater than 98% purity.
0.5 M EDTA	bioshop	EDT111.500
Nickel (II) sulfate	Bioshop	NIC700.500
His bind resin	EMD Millipore	69670-3	Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C
Anhydrous ethanol	Commercial Alcohols	P016EAAN	Dilute with water as needed.
Glacial acetic acid	Bioshop	ACE222.1
Sodium acetate trihydrate	Bioshop	SAA305.500
bovine serum albumin standard	bio-rad	500-0206
Bio-rad protein assay dye reagent concentrate	bio-rad	500-0006
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate	Fisher scientific	BP120-500
Tris-base	Bioshop	TRS001.1
7000 MW Snakeskin dialysis tubing	Thermoscientific	68700
2-mercaptoethanol	Sigma	M3148-25ml	This reagent should not be handled outside of a fume hood.
AcTEV protease	lifetechnologies	12575-015	Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17
Polyethyleneglycol 3350	Bioshop	PEG335.1
polyethyleneglycol 8000	Bioshop	PEG800.1
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate	ebioscience	44-2404-21
Sonicator	Fisher scientific	FB-120-110
Eon microplate spectrometer	Biotek	11-120-611	This equipment uses the Gen5 data analysis software.
Gen5 data analysis software	BioTek
sodium dodecyl sulphate	Bioshop	SDS001
bromophenol blue	Bioshop	BRO777
Glycerol	Bioshop	GLY001
Protein desalting columns	Thermoscientific	89849
Glycine	Bioshop	GLN001
precast 12% polyacrylamide gel	bio-rad	456-1045
Rapid stain reagent	EMD Millipore	553215
Gel dock EZ imager	bio-rad	1708270
White Light Sample Tray	bio-rad	1708272	Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains
Protein ladder	bio-rad	1610375