실험자가 면역 뇌척수염 연구 간단하고 효율적인 생산 및 마우스 미엘린 희소 돌기 아교 세포 당 단백질의 정제

요약

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

초록

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4⁺ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOG_tag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG_1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOG_tag or MOG_1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOG_tag protein. Immunization with either MOG_tag or MOG_1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

서문

MS 만성 염증과 미엘린 향하는자가 면역 반응에 의해 구동되는 것으로 생각되는 CNS의 신경 퇴행을 특징으로하는 인간의 질병이다. 시간이 지남에 따라 수초와 축색 돌기의 손실은인지 및 모터 기능을 ^하나의 점진적 감소가 발생. "실험자가 면역 뇌척수염은"중추 신경계의 수초 지향자가 면역 질환의 동물 모델에 대한 포괄적 인 용어이다. 인간의 MS와 마찬가지로 EAE는 일반적으로 어떤 경우에는 CNS의 면역 세포 침윤을 ^{특징으로하고,이} 탈수 초화. 그러나, 임의의 주어진 EAE 모델은 부분적으로 인간의 MS와 유사한 과정에 사용되는 화학 종 또는 균주 및 하부 반 미엘린 면역 반응의 복잡성에 좌우된다.

안티 미엘린 실험적자가 면역은 여러 가지 방법으로 유도하지만, 현재 사용되는 가장 일반적인 방법은 면역 CD4 흉내 아미노산의 짧은 펩타이드 마우스 면역화 될 수있다 + T 세포 에피토프입니다. 이 병원성 반응을 유도 할 수있는 최소 요구 사항을 나타냅니다. 아마도 이들 중 가장 일반적인 C57BL / 6 마우스 ³ EAE를 유도하기 위해 사용된다 (MOG _35-55) 미엘린 희소 돌기 아교 세포의 당 단백질에서 유래하는 21 개의 아미노산 펩타이드이다. 그러나 일부 실험 목적이 큰 단백질 항원 실제로 짧은 펩타이드와 예방 접종을 통해이 몇 가지 장점이와 예방 접종하는 것이 바람직 심지어 필요가있다. 전체 단백질 또는 특정 도메인의 어느 쪽인지를 표현하는 더 큰 단백질 항원이 다른 종에서도 여러 근친 마우스 변종에 프리젠 테이션을 위해 정상적으로 처리하거나 할 수 있지만 먼저, MHC의 제한 때문에, 짧은 펩티드는, 일반적으로 균주의 매우 제한된 범위에서만 유효하다 ^4. 둘째로, 더 큰 단백질 항원은 항원 인식 림프구 종 이상을 포함하는보다 복잡한 면역 반응을 유도하기보다는 limitin 할CD4 ⁺ T 세포에 항원 g 인식. 예를 들어, 그들의 B 세포 수용체 (BCR)을 통해 B 세포는 전체 단백질보다는 처리와 직접 상호 작용한다. 우리와 다른 MOG 단백질 ^(5)을 인식하지 못하는 MOG _35-55 예방 접종에 의해 활성화하는 B 세포를 보여 주었다. B 세포는 인간 최근 MS ^6에서 병원성 역할을하는 것으로 입증 되었기 때문에,자가 면역 병리에서 B 세포를 포함 EAE 모델은 점점 중요하다.

EAE를 유도하는 큰 단백질 항원을 사용하는 장점에도 불구하고, 단백질에 대한 몇 시판 소스가 남아있다. MOG _35-55 같은 짧은 펩티드가 매우 빠르고 상대적으로 낮은 비용으로 합성 할 수 있지만 실제로, MOG 단백질 상업 옵션을 구입 제한 및 비용 실질적으로 더 있습니다. 그럼에도 불구하고, MOG 세포 외 도메인을 생성하는 연구 그룹에 사용할 수있는 여러 가지 발현 벡터 (MOG _1-125) 자신이있다. HoweveR, 우리는 문헌에서 확인 하였다 발현 시스템의 모든 사람보다 효율적인 발현 시스템 ^(7)로 대체 한 이전 기술에 기초한다. 또한, 대부분의 쥐 또는 인간의 MOG ^8을 기반으로합니다. 마우스에서자가 면역 반응의 일부 수사 마우스 MOG의자가 항원에 기초하여 항원이 바람직하다. 마지막으로, 상업적 또는 발현 벡터와 같은 하나 우리가 식별 된 모든 MOG 계의 단백질은 상기 MOG _1-125 기재에 추가적인 아미노산을 포함하는 융합 단백질이다. 다음은 우리가 식별 할 수 없습니다 많은 기능이있는뿐만 아니라 정화 및 일반적으로 다른 시퀀스에 대한 태그를 포함한다.

이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 MOG 단백질 ^5의 공지 불용성 싸우는 오레 독신을 포함하는 태그에 융합 된 마우스 MOG 외 도메인에 기초하여 신규 한 융합 단백질을 생성. 태그 시퀀스는 정화와 TEV 프로테아제 CLE에 대한 6xHis 시퀀스를 포함원하는 경우, 모든 태그 서열의 완전한 제거를 허용 avage 사이트. 이것은 우리가 순수 MOG _1-125 단백질을 생성 할 알고있는 유일한 방법입니다. 단백질의 대량 생산을 용이하게하기 위해, MOG _1-125 서열은 박테리아 발현 코돈 - 최적화하고, MOG _태그 융합 단백질 애완-32 발현 시스템 내로 삽입되었다. 여기서는 가장 면역학 연구실 사용할 비 특수 장비를 사용하여 생산 MOG _{태그 단백질} 순수 MOG _1-125를 정화 상세히 프로토콜을 설명한다.

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프로토콜

1. 단백질 유도

참고 : 다음 단계에서는 BL21 대장균 박테리아 MOG _{태그 융합} 단백질에 대한 서열을 포함하는 애완 동물-32 벡터로 형질 전환 된 고밀도로 성장하고 MOG _{태그 단백질을} 발현하도록 유도된다 (문헌 ⁵ 및도 1 참조) . 일 대략적인 대체 정지 점 프로토콜에 설명되어 있습니다 참고 - 전체 타임 라인 그림 2를 참조하십시오. 정제 애완 32 MOG _{태그 벡터} DNA로 시작하는 경우, 화학적 능력 BL21 E.로 변환 할 필요가있다 ^{9 잘} 설명 된 바와 같이, 암피실린 선택하여 대장균 박테리아. 성공적인 변환이 제한로 소화 한 다음 표준 상업용 키트를 사용하여 선택된 박테리아 DNA의 정제에 의해 확인 될 수있다 Age1과 SAC1은 아가 로스 겔 ^10에서 424 bp의 밴드를 생성하는 효소.

은 BL21-MOG _태그 글리세롤 재고와 멸균 원성 국물 (LB) 배지 (0.1 mg을 암피실린 / ㎖) 5 ㎖를 접종하고 37 ° C, 200 rpm에서 하룻밤을 품어.
1. 다음 날에 대비하여 37 ° C 배양기에서 멸균 LB 배지 500 ml에 포함 된 두 개의 1 L 삼각 플라스크를 놓습니다.
2. 단계 1.2 (최종 농도 0.1 ㎎ / ㎖ 암피실린)에서 500㎖의 LB를 함유하는 플라스크에 각각 100 ㎎ / ㎖의 암피실린 500 μL를 추가한다. LB의 국물의 두 플라스크의 각 단계 1.1에서 하룻밤 문화 1 ㎖를 전송합니다. 37 ° C에서 품어 200 rpm으로 5 시간 동안 0.6의 광학 밀도까지.
3. 플라스크 중 하나에서 하나를 1 ml의 분취 량을 가지고 별도의 1.5 ML의 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. 1 분 동안 16,000 XG에서 세포 펠렛과 뜨는을 제거합니다. T ₀ (프리 유도)와 튜브 라벨 다음으로 세균 펠렛을 넣어 -20 미래 소듐 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAG 용 냉동기 ° CE) 분석 (8 항 및 그림 3 참조).
4. 1 M 이소 프로필 β-D-1-D- 티오 갈 락토 피 라노 시드, 각 문화 플라스크에 이소 프로필 β-D-티오 갈 락토 시드 (IPTG)의 0.5 ML을 추가합니다. 밤새 75 rpm으로 실온에서 그 후, 37 ℃, 4 시간 동안 200 rpm으로 인큐베이션 플라스크.

2. 수확 MOG _태그 단백질

주 :이 단계에서, 박테리아 MOG _{태그 단백질의} 대량 생산된다. MOG _태그를 수확, 박테리아 먼저 초음파 다음에 트리톤 X-100 버퍼에 용해된다. MOG _태그는 다음 MOG _{태그 단백질을} 함유하는 조 단백질 용액 결과 봉입체로부터 방출 이미 다졸 및 구아니딘으로 변성된다.

1. 단계 1.5에서 하룻밤 문화 중 하나에서 하나를 1 ml의 분취 량을 가지고 1.5 ml의 microcentrifuge 관으로 전송합니다. 1 분 동안 16,000 XG에서 세포 펠렛과 뜨는을 제거합니다. 욕조 레이블전자 T _{O / N} (포스트 유도는) 다음 -20 미래 SDS 페이지 분석을위한 ° C의 냉동고 (그림 3)에 세균 펠렛을했습니다.
2. 고속 원심 분리와 균등의 사이에 250 ml의 병 호환 문화를 배포하고이 시점에서 얼음이 보관하십시오. 4 ℃에서 15 분 동안 22,000 XG에서 박테리아 세포 펠렛.
3. 상층 액을 버린다. -20 ° C에서 세균 펠렛을 저장 또는 2.4 단계로 진행합니다.
4. 용해 버퍼 준비 (0.1 ㎎ / ㎖ 암탉의 계란 라이소자임, 0.1 % 트리톤 - X를 (v / v)의 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에서) 트리톤 X-100의 60 μl를 50 mg을 120 μl를 추가하여 / ㎖ 암탉의 계란 라이소자임 PBS 60 mL의에 원액.
5. 재현 탁 용균 완충액 30 ㎖ 총 단계 2.3에서 세균 펠렛 모든 결합. 고속 원심 분리 할 수있는 둥근 바닥 50 ㎖ 튜브에이 볼륨을 전송합니다. 30 분 동안 30 ℃로 물 목욕이 튜브를 놓습니다. 배양 시간 동안 튜브 진탕두 세포를 재현 탁한다.
6. 배양 후, 얼음에 튜브를 전송하고 초음파 처리 솔루션을 20 kHz에서, 진폭 70 %, 펄스에서 3 초에서 3 초, 라운드 당 오 펄스를 펄스. 총 6 라운드의 솔루션을 초음파 처리 및 솔루션 라운드에서-사이에 얼음에 냉각 할 수 있습니다.
7. 4 ℃에서 15 분 동안 24,000 XG에 솔루션을 원심 분리기. 뜨는을 취소하고를 반복 한 번 2.5-2.7 단계를 반복합니다. -20 ° C에서 펠렛을 저장 또는 2.8 단계로 진행합니다.
8. 염화나트륨 0.8766 g, 트리스 염산 0.09456 g, 및 100 ml의 비이커에 이미 다졸 0.01021 g을 첨가하여 A (500 mM의 염화나트륨, 20 mM의 트리스 -HCl, 5 mM의 이미 다졸, pH를 7.9) 완충액 준비한다. 볼륨 후 7.9 용액의 pH를 조정 28 ml에 도달 할 때까지 H ₂ O를 추가한다. 그 후, 100 ㎖의 용액을 전송 눈금 실린더 및 체적 30 ㎖가 될 때까지 H ₂ O를 추가한다.
9. 버퍼 A의 30 ml의 단계 2.7에서 펠렛을 재현 탁하고 3 시간 동안 4 ° C에서이 솔루션을 품어. 이 시간 동안구아니딘 염산의 17.2 g을 무게.
10. 단계 2.6에서와 동일한 설정을 사용하여 얼음 위에서 초음파 처리 용액. 그런 다음이 용액에 구아니딘 염산의 17.2 g을 추가합니다. 모그 _{태그 단백질을} 가용화하는 1 시간 동안 얼음에이를 품어.
11. 4 ℃에서 30 분 동안 24,000 XG에 솔루션을 원심 분리기. 상층 액을 수집하고 단백질 정제까지 4 ° C에서 뜨는을 저장합니다.

3. 단백질 정제

참고 : MOG _{태그 단백질이} 용출 (그분의 태그를 통해) 충전 니켈 수지에 흡수 4 라운드를 통해 정제 될 것입니다 다음 단계에서.

1. 뒤에 오는 버퍼를 확인합니다 :
   1. 완충액 B (500 mM의 염화나트륨, 20 mM의 트리스 -HCl, 5 mM의 이미 다졸, 6 M 구아니딘 - 염산, pH를 7.9)을 준비한다. 500㎖의 비이커에의 NaCl 5.844 g, 트리스 - 염산의 0.6304 g, 이미 다졸의 0.0681 g 및 114.64 g 구아니딘 염산을 추가합니다. 그런 다음 190 ml에 도달 할 때까지 H ₂ O를 추가하고 7.9 pH를 조정합니다. 졸 이동250 ml의에의 ution 실린더를 졸업하고 볼륨을 200 ml의 때까지 H ₂ O를 추가합니다.
   2. 용출 완충액 (500 mM의 염화나트륨, 20 mM의 트리스 -HCl, 0.5 M 이미 다졸, 6 M 구아니딘 - 염산, pH를 7.9)을 준비한다. 500 mL의 비커에의 NaCl 5.844 g, 트리스 - 염산의 0.6304 g, 이미 다졸의 6.808 g 및 114.64 g 구아니딘 염산을 추가합니다. 그것은 190 ml에 도달 할 때까지 H ₂ O를 추가하고 7.9 pH를 조정합니다. 250 ml의의 해결책 실린더를 졸업 전송하고 볼륨을 200 ml의 때까지 O를 H _{2를 추가합니다.}
   3. 스트립 완충액 (500 mM의 염화나트륨, 20 mM 트리스 -HCl, 100 mM EDTA, pH를 7.9)을 준비한다. 500 mL의 비커에의 NaCl 5.844 g, 트리스 - 염산의 0.6304 g, 40 ml의 500 mM의 EDTA를 추가합니다. 그것은 190 mL로 도달 할 때까지 H ₂ O를 추가하고 7.9 pH를 조정합니다. 250 ml의의 해결책 실린더를 졸업 전송하고 볼륨을 200 ml의 때까지 O를 H _{2를 추가합니다.}
   4. 충전 완충액 (0.1 M 황산 니켈)을 준비한다. 500㎖의 비이커에 5.257 g의 황산 니켈을 추가하고 190 ml에 도달 할 때까지 (H에게주의 ₂ O를 추가 니켈을 처리하지 않는니켈 황산염까지 흄 후드의 외측 설페이트) H ₂ O에 용해되었다. 니켈 설페이트가 용해되면, 250 ml의 용액을 눈금 실린더로 전송하고 부피가 200 ㎖에 도달 할 때까지를 O H _2를 추가한다.
2. 4500 XG (각 관에 5 ㎖)을 통해 원심력을 견딜 수있는 두 개의 원뿔 50 ㎖ 원심 분리 튜브 사이 니켈 수지 10ml의 분할.
3. 충전 니켈 수지 평형 :
   1. 40 ml의 H ₂ O 수지를 포함하는 각 튜브에 추가하여 수지를 씻으십시오. 로커에 수평으로 튜브를 배치하고 4 ℃에서 5 분 동안 교반 할 수 있습니다. 일단 4 ℃에서 8 분 동안 4,500 XG에서, 원심 분리기 튜브를 마쳤다.
   2. 펠렛을 방해하지 않도록 피펫으로 상층 액을 버린다. 각 튜브에 충전 버퍼의 40 ML을 추가합니다. 로커에 튜브를 전송하고 4 ° C에서 15 분 동안 교반 할 수 있습니다. 일단 4 ℃에서 8 분 동안 4,500 XG에서, 원심 분리기 튜브를 마쳤다.
   3. 뜨는을 폐기 한 다음 튜브에 버퍼 B의 40ml를 추가합니다. 로커에 튜브를 전송하고 4 ℃에서 5 분 동안 교반 할 수 있습니다. 일단 다음 상층 액을 버리고 4 ° C에서 8 분 동안 4,500 XG에서 튜브를 원심 분리 완료.
4. 옵션 : 단계 2.11에서 수집 된 가용성 단백질의 150 μl를 타고 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 전송할 수 있습니다. 사전 배양과 튜브를 라벨 및 미래 SDS 페이지 분석을 위해 -20 ° C에서이 동결 (그림 3, 원유 MOG _태그).
5. 모그 _태그 단백질을 정제 :
   1. 단계 3.3에서 니켈 계 수지를 포함하는 제 1 튜브 (도 2 튜브 (1)) 내지 (~ 40 ㎖, 마이너스 단계 3.4에서 제거 작은 샘플) 단계 2.11에서 가용화 된 단백질의 전체 볼륨을 전송 혼합 및 로커에 가로로 배치 1 시간 동안 4 ° C에서.
   2. 4 ℃에서 8 분 동안 4,500 XG에서 튜브를 원심 분리기. 일단 완료, 두 번째로 뜨는을 전송튜브 (도 2, 튜브 2) 니켈 수지의 이전 단계에 기재된 바와 같이 배양한다. 한편, 관 (1)와 3 단계 아래 6 계속합니다.
   3. 용출 완충액 40ml를 튜브 1 니켈 계 수지를 재현 탁하고 4 ℃에서 5 분간 로커에 수평 튜브를 놓는다. 그런 다음, 4 ℃에서 8 분 동안 4,500 XG에서 튜브를 원심 분리기.
   4. '정제 된 MOG _태그 단백질'라고 표시된 250 ml의 병에 용출 MOG _태그 단백질을 포함 뜨는을 전송하고 4 ℃에서이 병을 유지합니다. 각 용출 단계로,이 병의 결과 뜨는 수영장.
   5. 니켈 수지에 스트립 버퍼의 40 ML을 추가하고 4 ℃에서 5 분 동안 로커에 가로로 배치합니다.
   6. 4 ℃에서 8 분 동안 4,500 XG에서 튜브를 원심 분리기. 단계 3.3에 나열된 뜨는을 버리고, 다음 니켈 수지를 충전하십시오.
   7. 일단 단계 3.5에 나열된 두 번째 튜브를 앞으로 이동, 완료했다. 4 라운드의 총원하는 경우 단계 2.11에서 충전 니켈 수지 있지만 단백질의 대부분을 회복 용출 상에 용해 된 단백질의 흡수들, 추가 단백질은 흡수 및 용출 추가 라운드에서 복구 할 수 있습니다.
6. 흡수 및 용출 네 가지 (또는 그 이상)의 라운드가 완료되면, 밤새 4 ° C에서 풀링 된 정제 단백질을 저장합니다. 다시 필요할 때까지 니켈 수지는 4 ℃에서 20 % 에탄올 용액 40 ㎖에 저장 될 수있다.

4. 단백질 농도 측정

주 : 제 3 절에서 생성 된 정제 된 MOG _{태그 단백질의} 양을 계량 할 필요가 더 진행하기 전에이 값은 프로토콜의 마지막에 단백질을 집중 최종 부피를 결정하는 데 사용된다. 우리는 여기서 표준 브래드 포드 분석에 대해 설명합니다. 정제 MOG _{태그 단백질의} 농도는 연속적 dilut의 스펙트럼의 흡광도를 비교하여 판단공지 된 농도의 소 혈청 알부민 (BSA)을 표준 곡선 ED MOG _{태그 단백질.}

1. 3 L 비커에 23 ml의 빙초산 8.2 g 소듐 아세테이트를 첨가하여 10 배의 아세트산 버퍼를 확인하고 아세트산 나트륨을 용해 H ₂ O 1.9 L를 추가한다. 2 L이 용액을 눈금 실린더에 옮기고 볼륨 2 L.은 실온에서 2 L 병에 저장 될 때까지 H _{2 O를} 추가. H ₂ O 900 μL에 10 배 아세테이트 완충액 100 ㎕를 첨가하여 1X 아세테이트 완충액 1 mL로
2. 우물 G2-8 및 G9 60 μL에 1 배 아세테이트 버퍼의 30 μl를 첨가하여 희석에 대한 96 웰 플레이트를 설정합니다. H2와 H3에 1 배 아세테이트 버퍼의 48 μl를 추가합니다.
3. 1 배 아세테이트 버퍼의 216 μl를 잘 G1에서 시판 2 ㎎ / ㎖ BSA 표준의 54 μl를 추가하고 철저하게 혼합 다음과 같이 행 G의 BSA 표준의 초기 일련의 희석을 설정합니다. 잘 G2에 잘 G1에서 210 μl를 추가 철저하게 혼합,다음 잘 G3에 잘 G2의 180 μl를 추가합니다. 잘 G4에 잘 G3의 150 μL를 추가 철저하게 혼합, 잘 G8까지 이후의 각도에 적은 수의 30 μl를 추가 이러한 추세를 계속합니다. (등가 희석 인자 목록에 대한 표 1 참조).
4. 그래서 우물의 A1, B1 및 C1, 우물 A2, B2, C2에서 잘 G2의 10 μL, 그리고 잘 G1의 10 μl를 전송하여 각 희석의 세중의 샘플을 설정합니다. 멀티 채널 피펫을 사용합니다.
5. , MOG _태그의 희석을 설정 잘 H1 단계 3.6에서 정제 MOG _{태그 단백질의} 60 μl를 추가합니다. (이것은 1 배 H1에 희석, H2의 1/5 희석하고, H3의 1/25 희석을 생산), 다음 잘 H3에 잘 H2의 12 μl를 추가, 철저하게 혼합, 잘 H2 잘 H1 12 μl를 추가 철저하게 혼합 .
6. 단계 4.4에 기술 된 바와 같이, H1-H3 행 D, E 및 F에 우물 10 μl를 전송하여 MOG _태그 희석에 대한 세중의 샘플을 설정합니다.
7. 단백질 분석 염료 2 ㎖ 믹스H ₂ O 8 mL를 시약 농축액 가능한 경우, 멀티 채널 피펫을 사용하여 행 A, B, C, D, E 및 F 모두 프리로드 웰에이 혼합물을 200 μL를 추가한다. 단백질 농도를 읽기 전에 바늘을 사용하여 웰에서의 기포 팝.
8. 염색 시약의 첨가 10 분 내에 행 A, B, C, D, E 및 F. 모든 웰의 595 nm의 흡광도를 측정
9. 1-9 대응하는 위치를 사용하여 위치를 행 A, B 및 C는 표준 곡선을 설정하는 0.4, 0.35, 0.3, 0.25, 0.2, 0.15, 0.1, 0.05 및 0 ㎎ / ㎖ BSA. 이 곡선에 기초하여, 가장 표준 곡선에 맞는 MOG _태그의 희석을 사용 MOG _{태그 단백질의} 농도를 계산한다. 일반적으로, 프로토콜이 여기에 기술하여 박테리아 배양 한 L에서 MOG _{태그 단백질의} 200 내지 250 mg의이있을 것이다.
   참고 : MOG _1-125이 프로토콜의 끝 부분에 나와있는 옵션 부 (7) 여기에서 계속 확인하십시오. 그렇지 않으면, 섹션 5로 진행합니다.

(5)에게. 투석

주 : 투석 서서히 단백질 접힘 수 있도록 정제 변성 MOG _태그를 함유하는 용액으로부터 구아니딘을 제거한다. MOG 자체가 매우 불용성이며, 이는 티 오레 독신 태그의 존재에 의해 개선되지만, 여전히 용액 나올 경향이 있으므로주의가이 단계에서 수행되어야한다. 따라서, 리 폴딩은 점진적으로 수행 상대적으로 낮은 MOG _태그 농도해야합니다.

1. 농도는 (4)에서 산출 MOG _태그의 양에 기초하여, 0.5 ㎎ / ㎖ 이하까지 투석을 시작하기 전에, 버퍼 B (단계 3.1에 열거 할 수 완충액 B)로 정제 MOG _{태그 단백질을} 희석.
2. 뱀 투석 튜브 약 30cm를 잘라 세 번에 걸쳐 뱀 피부의 끝을 접는 및 지혈으로 접어 끝을 체결하여 잠금 지혈과 한쪽 끝을 고정합니다. 희석와 뱀 채우기MOG _태그 단백질 열기 끝에서 그들을 강제로 뱀에서 공기 방울을 제거 (튜브 당 MOG _{태그 단백질의} 60 ~ 90 ml의 사이). 마지막으로, 제 2 로킹 지혈제를 사용하여 상기 튜브의 다른 쪽 끝을 밀봉.
3. 모든 MOG _태그 단백질이 뱀 투석 튜브로 전송 될 때까지 단계를 반복 5.2 투석 튜브의 추가 부분을 채우기 위해. 누수가 없는지 확인합니다.
4. 구아니딘 염산의 382.12 g을 계량하고 2 L 비커에 단계 4.1에서 만든 10 배 아세테이트 버퍼의 100 ㎖를 추가하여 4 M 구아니딘와 1 배 아세테이트를 확인합니다. 비커에 H ₂ O의 0.5 L를 추가하고 구아니딘 염산이 용해 할 수 있습니다. 일단 용해, 1 L에 솔루션을 전송 실린더를 졸업하고 볼륨이 1 L.가 필요합니다 매 2 snakeskins이 레시피를 반복에 도달 할 때까지 O를 H _{2를 추가합니다.}
5. 다음과 같이 투석을 수행 단계 5.4에서 4 M 구아니딘와 1 배 아세테이트 버퍼의 1 L에 큰 양동이 (최소 10 L)를 입력합니다. t를 배치오 자기 교반 막대위한 공간을 떠나 버킷에 MOG _태그를 포함 투석 튜브, 2 절은 바닥에 방해받지 않고 회전합니다. 자기 볶음 접시에 4 ° C 형 방에 양동이를 놓고 (즉, 높은 유체를 이동 충분하지 않음) 느린 회전 속도에 전원을 켜십시오 :
   참고 서서히 버퍼 구아니딘의 양을 줄이기 위해 다음 단계를 수행한다. 교반 시간은 최소로 제공되지만, 밤새 남아있을 수 있습니다. 투석 3 최소 일 걸리지 만하다면이 확장 될 수있다. 정기적으로 튜브가 손상되지 있는지 확인하고 끝이 제대로 닫혀 있는지 확인하십시오.
   1. 버킷 앉아서 4 ~ 5 시간 동안 교반 보자.
   2. 각 버킷 1X 아세테이트 완충액 1 L (100 ㎖ 배 아세트산 버퍼와 H ₂ O 900 ml)에 추가한다.
   3. 반복 5.5.1과 5.5.2 버킷에 버퍼의 4 L의 총 3 회 총 단계를 반복합니다.
   4. (1 버킷에서 버퍼의 절반을 버리고 1X 아세테이트 완충액 1 L로 보충00 ml의 10 배 아세테이트 버퍼와 H ₂ O, 아니 구아니딘)과 튜브 및 교반 막대를 설정 한 900 ml의.
   5. 반복 한 번 5.5.1와 5.5.2 단계 (즉, 양동이에 버퍼의 4 L의 총이있을 때까지).
   6. 마지막으로, 신선한 1X 아세테이트 버퍼의 4 L과 양동이에 전체 4 L 볼륨을 교체하고 4 ~ 5 시간 동안 교반을 할 수 있습니다. 최상의 결과를 얻으려면, 단백질 농도의 날에이 단계를 수행합니다.
   7. 조심스럽게 폴딩 MOG _태그 투석 튜브를 제거하고 버킷 버퍼를 폐기합니다.

6. 집중 MOG _태그 단백질

주 : 최종 단계에서, 폴딩 MOG _{태그 단백질} 수납 작업 희석 농축 하였다. MOG _{태그 매우} 불용성으로, 5 ㎎ / ㎖를 초과하지 않아야한다. 완전한 프로 인트 adjuv 1 :이 농도는 일반적으로 1 혼합 된 마우스 (에 EAE를 유도하는 데 사용되는 0.4 ㎎ / ㎖ MOG _35-55 펩타이드, 대략 몰입니다개미 (CFA)). 단백질 소량의 백색 침전물의 형태로 용액으로부터 올위한 농축 과정 중에 드물지 않다. 과도한 석출하지만, 문제가된다.

1. (4)에서 산출 된 값에 기초하여 5 ㎎ / ㎖의 MOG _{태그 농도를} 달성하기 위해 원하는 최종 부피를 계산한다.
2. : 1 비율 라인 알루미늄 박을 가진 팬은 하나의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 3350 및 PEG 8000과 알루미늄 포일을 커버. 이 농도 동안 단백질 응집을 방지하고 유효 cyropreservative ^11있는 바와 같이, PEG 3350이 혼합물에 포함된다.
3. 알루미늄 포일 위에 (내부 MOG _태그 단백질)에 뱀 튜브를 넣고 PEG 8000으로 덮고 실온이 앉게 볼륨이 예상 최종 부피와 같거나 그 이하가 될 때까지 주기적으로 양을 확인한다 (스텝에서 산출 6.1)의 실제 부피는 다음 단계로 측정된다. 팬이 될 경우, 농축 과정에서 물 과포화 알루미늄 호일 및 PEG 3350과 PEG 8000과 새로운 팬을 설정합니다.
4. H ₂ O로 snakeskins의 외부를 세척하고, 혈청 학적 피펫을 사용하여 별도의 유리 병에 MOG _{태그 단백질을} 전송합니다. 단백질이 볼륨이 올바른지 확인하기 위해 전송과 같이 볼륨을 추적.
   1. 볼륨이 예상 최종 부피 이하로 감소 된 경우 목적하는 양에 도달 할 때까지, 1X 아세테이트 버퍼를 추가한다. 볼륨이 예상 최종 부피를 초과하면, 투석 튜브로 다시 MOG _{태그 단백질을} 전송하고 계속 농도 (6.2-6.3 단계).
   2. 1.5 ml의 튜브 (튜브 당 0.5 ㎖)의 사이에 MOG _{태그 단백질을} 배포 필요할 때까지 -80 ° C에서 튜브를 저장합니다. 1 CFA와 : EAE를 유도하기 위해,이 볼륨 1을 섞는다.
5. 단계 1에서 취해진 샘플을 사용하여 MOG _{태그 단백질의} 발현을 확인하는 SDS PAGE 젤을 실행합니다.4, 2.1, 3.4, 6.4 및 단계에서 정제 MOG 단백질.

TEV 단백질 분해 효소를 사용하여 MOG _태그 7. 생성 MOG _1-125 (선택 사항)

주 :이 단계는 선택적 단계 여분 태그 서열없이 MOG _1-125이 필요한 경우, 태그 서열 TEV 단백질 분해 효소를 사용하여 제거 할 수 4 (도 4)의 끝에서 계속된다. 지금까지 우리가 알고있는 바와 같이, 순수한 MOG _1-125을 생성 할 수있는 다른 발현 시스템이 없습니다. 그러나, 티 오레 독신 태그없이 MOG _{1-125 매우} 불용성 인 것을 유의해야하고이 정화 처리 중에 문제를 야기하고, 이러한 이유로 실험 이유로 반드시 필요한 경우 태그를 제거 할 수있다. 몇 가지 단계가 순수 MOG _1-125을 생성해야합니다. MOG _태그 제 TEV 단백질 분해 효소 절단 완충액으로 투석한다. TEV 단백질 분해 효소로 소화 후, 볼륨은 나중에 정제 성 돕기 위해 감소EPS 후 완충액 B로 투석 한 다음, 그 태그 함유 태그 서열은 니켈 계 수지를 사용하여 제거된다. 마지막으로, 단백질 정량화, 순수 MOG _{1-125 최종} 농도로 농축된다.

1. 1.861 g의 EDTA, 44.4 g 트리스 - 염산 및 2 L 비이커에 26.5 g의 트리스을 추가하여 10 배 TEV 절단 버퍼 (500 mM 트리스 - 염산, 5 mM의 EDTA)의 1 L합니다. 볼륨 후 EDTA를 용해 8로 pH를 조정할 990 ml에 도달 할 때까지 H _{2 O를} 추가. 1 L의 해결책 실린더를 졸업 전송하고 O. H _2를 사용하여 1 L에 볼륨을 가지고
2. 0.5 mg의 단계 3.6에서 MOG _{태그 단백질을} 희석 / 4 전송은 뱀 투석 튜브로 희석 MOG _{태그 단백질} 120 ml에 기술 된 바와 같이 섹션에서 계산 된 단백질의 양에 기초하여, 버퍼 B (단계 3.1에 기재된 동일한 완충액)을 사용 ML 단계 5.3-5.2있다. 볼륨 그러나 MOG _{태그 단백질} 모두를 절단하는 데 필요한 TEV 단백질 분해 효소의 양은 substa 것까지 확장 될 수있다ntial.
3. 단계 7.1에서 만든 10 배 TEV 절단 버퍼로 10 배 아세테이트 버퍼 교체를 제외하고, 단계 5.5에 나와있는 투석 프로토콜을 따르십시오.
4. 새로운 250 ㎖의 유리 병에, TEV 절단 완충액 이제 MOG _{태그 전송} 투석에서 증가 된 양을 모니터링한다. 병에 추가 모든 2.85 ml의 MOG의 _{태그 단백질} 당 β 메르 캅토 에탄올 1 μl를 추가합니다. MOG _{태그 단백질마다} 50 mg의 (5 ㎎ / ㎖로 스톡 TEV 용액) TEV 단백질 분해 효소의 적어도 1 ㎎을 추가 (TEV 프로테아제 1:10 TEV까지 첨가 될 수있다 : MOG 단백질 비) 실온에서 부화 최소 72 시간 동안 빛으로부터 보호.
   주 : TEV 단백질 분해 효소 인큐베이션의 끝에, 백색 침전물을 유리 병의 바닥에서 이해되어야한다.
5. 단백질은 단백질을 유리 병에 부착되는 석출물 방지 용해까지 투석 튜브에 단백질을 전송하기 전에, 상기 용액에 염산 구아니딘을 추가한다. 150 μl를 전송이 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 솔루션은 "TEV와 MOG"로 튜브 라벨. 미래의 SDS-PAGE 분석을 위해 -20 ° C에서 솔루션을 저장합니다.
6. 단계 5.3-5.2에 나열된 투석 튜브로 단계 7.5에서 유체를 모두 전송합니다. H ₂ O 2 L로 큰 양동이를 채우고 양동이에 투석 튜브를 배치합니다. 빛이 밤새 교반 4 ° C에서이 품어. 이 단계는 단백질 농도를 신속하게 발생하고, 단백질 정제를 방해 용액으로부터 EDTA를 제거하기 시작할 수 있도록 구아니딘을 희석시키는 것이 중요하다.
7. 용액의 최종 부피가 ~ 40 mL의 6.2 ~ 6.3 (단 PEG 8000을 사용 제외)되도록 단계에 나열된 투석 튜브에 단백질을 농축시킨다. H ₂ O와 투석 튜브를 세척하고 잔여 PEG 8000 여전히 튜브에 부착 제거합니다. 용적 감소는 가능 니켈 재를 함유하는 50 ㎖ 튜브에 단백질 분해 모두 적합하게죄 단계 3.5에 설명 된대로.
8. 완충액 B로 분해 된 단백질을 투석 :
   1. 버퍼 B의 1 L (29.22 g의 NaCl, 3.152 g 트리스 - 염산, 0.3405 g 이미 다졸, 구아니딘 염산의 573.18 g, pH를 7.9)으로 큰 양동이를 입력합니다.
   2. (단계 5.5에서 자세히 설명) 파문 자석과 함께 버킷 단계 7.7에서 소화 단백질을 포함하는 snakeskins를 놓습니다. 느린 파문으로 설정 저어 접시에 4 ℃로 냉각 방으로 버킷을 넣고 snakeskins 5 이상의 시간 동안 투석 할 수 있습니다.
   3. 물통을 비우고 버퍼 B의 또 다른 1 L로 리필이 느린 파문으로 설정 저어 접시에 4 ° C 차가운 방에 앉아서 snakeskins 5 이상의 시간 동안 투석 할 수 있도록 할 수 있습니다.
9. 쪼개진 태그 서열 용액에 MOG _1-125을 떠나, 니켈 수지에 구속되는 중요한 차이점으로, 3 절에 설명 된대로 MOG _1-125 단백질의 정제를 수행합니다. 다시 말하지만, 정화의 4 라운드가 될 것입니다동일한 부피에서 수행하지만,이 경우에 목표 순도를 향상시키기 위해,보다 가능한 많은 단백질을 복구하는 것이다. 그림 4를 참조하십시오.
   1. 단계 3.1에 나와있는 단백질 정제 버퍼를 확인
   2. 단계 3.3에 설명 된대로 니켈 수지의 두 튜브를 충전합니다.
   3. 태그를 함유하는 니켈 계 수지로부터 용출 폐기된다는 본질적인 제외 단계 3.5에 설명 된 프로토콜에 의해 MOG _{1-125 정화하면서,} (미래 SDS-PAGE 분석을 위해 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 용출액을 150 ㎕의 계속) MOG _1-125를 포함하는 용액을 최종 제품으로 유지된다.
10. 제 4 장에서 설명한 바와 같이 MOG _1-125 단백질의 농도를 측정한다 :
    1. 단계 4.2 및 4.4에 설명 된대로 BSA 표준 곡선의 희석을 설정합니다.
    2. 단계 4.5 및 4.6에 설명 된대로 MOG _1-125의 희석을 설정합니다. 대안 적으로,보다 큰 범위를 생성하기 위해 유용 할 수있다희석액 (예 1X, 1/2, 1/4, 1/8)의. 1 배 아세테이트 버퍼와 그에 따라 MOG _1-125의 볼륨을 조정합니다.
    3. 4.7 4.9 단계에 설명 된대로 브래드 포드 분석을 수행하고 생성 된 MOG _1-125의 양을 계산한다. 예상 수익률은 약 4 mg의 이상 단백질이다.
11. 섹션 5에 설명 된대로 투석을 통해 구아니딘의 점진적 제거에 의해 MOG _1-125을 접힘.
12. 5 ㎎ / ㎖ MOG _태그 등몰 인 2.24 ㎎ / ㎖이어야 부 (6)의 최종 농도에 기재된 MOG _1-125 단백질을 농축시킨다.

8. SDS-PAGE 젤 MOG _태그 생산 및 순도를 확인하기

참고 : 샘플 단계 1.4, 2.1, 3.4에서 촬영하고, 6.4 MOG _태그 생산 및 순도를 확인하기 위해 표준 SDS-PAGE에 의해 분석된다. 이 단계는 MOG _태그 또는 MOG _1-125 하나의 최종 정제 한 후 수행해야합니다.

<리> H ₂ O 2 ㎖에 트리스 - 염산의 1.576 g을 추가하여 2 배 SDS-PAGE 로딩 버퍼를 확인하고 6.8로 pH를 설정합니다. 트리스 - 염산 용액에 0.4 g의 SDS를 추가하고 볼륨이 7 ml에 도달 할 때까지 H ₂ O를 추가합니다.
1. 단계 8.1에서 만든 솔루션이 1 ㎖를 추가 H ₂ O 10 ml의에 브로 모 페놀 블루 0.2 g을 추가합니다. 마지막으로, 배 SDS-PAGE 로딩 버퍼를 완료 글리세롤 2 ㎖를 추가합니다. 이 솔루션을 저장하는 경우, 4 ° C에서 유지하고 최대 3 개월 동안 빛으로부터 보호.
2. 단계 1.4 및 2.1과 같이 실온에서 3.4 및 6.4에서 가용화 MOG _{태그 단백질을} 박테리아의 동결 분취 량을 해동.
3. 단백질 탈염 컬럼에 각각 60 μl를 추가하여 단계 3.4 및 6.4에서 수집 한 솔루션에서 염을 제거합니다. 제조업체의 지침에 따라 단백질을 정화.
4. 단계 8.2에서 만든 액 1ml에 β 메르 캅토 에탄올 20 μL를 추가합니다. 두 혈중 알코올 농도이 40 μl를 추가terial 단계 8.3 펠렛 단계 8.4에서 탈염 단백질 60 ㎕를 10 분 동안 95 ° C에서 배양 한이.
5. 트리스 5 g, 28.8 g 글리신, 1 g의 SDS를 무게에 의해 1 배 SDS 페이지 실행 버퍼를 확인합니다. 1 L 비이커에 추가 할 모든 것을 녹여 500 mL의 H ₂ O를 추가합니다. 용해 후에는 부피가 1 L. 도달 할 때까지, 1 L의 용액을 눈금 실린더로 전송하고 H ₂ O 채우기
6. 다음 겔 장치에 1X SDS-PAGE에서 러닝 버퍼를 추가 겔 장치에서 12 % 폴리 아크릴 아미드 겔을 설정 실행 버퍼가 단지 겔의 웰의 맨 위가되도록. 우물에 다섯 번을 각각 버퍼를 실행의 50 μl를 피펫 팅에 의해 젤의 우물을 씻으십시오.
7. 로드 (10) 제 1 웰에 단백질 사다리 ㎕의 우물을 분리하는 단계 8.5에서 삶은 솔루션의 10 μl를 추가합니다. 60 분 동안 115 V에서 젤을 실행합니다.
8. 장치로부터 겔을 제거하고 작은 용기로 옮긴다. 접점 채우기H ₂ O 순수 100㎖로 INER 8 분 동안 천천히 회전 플랫폼에 컨테이너를 옮긴다. 8 분 후, 물을 버리고 O. H ₂ 회 더 세척 겔
9. 컨테이너에서 H ₂ O 덤프 및 컨테이너에 빠른 염색 시약을 100 ㎖를 추가합니다. 이 밤새 천천히 회전하는 플랫폼에 앉아 알루미늄 호일로 커버 할 수 있습니다.
10. 빠른 염색 시약을 덤프 용기에 H ₂ O 약 100 ㎖를 추가합니다. 이 8 분 동안 회전 플랫폼에 앉아 할 수 있습니다. 가 H ₂ O를 덤프하고 두 번 H ₂ O 세척을 반복합니다.
11. 이미지 쿠마 푸른 얼룩에 대해 이미 저를 사용하여 젤. 밴드 약 31.86 kDa의 (MOG _태그 단백질) 및 63.72 kDa의 (MOG _태그 이량 체)에서 희미한 밴드를 찾습니다.

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결과

정화가 완료되면, 샘플 단계 1.4, 2.1, 3.4에서 수집하고, 단계 6.4의 최종 생성물은 단백질 겔 (도 3A)에서 실행되어야한다. MOG _{태그 먼저} T _{O / N 샘플에서} 31.86 kDa의 밴드로 나타날 수 있지만 ₀ T, 최종 순수한 생성물의 유일한 밴드되어야한다. 모그 _{태그 단백질이} 올바르게 접혀 여부를 테스트하기 위해, MOG _{태그 단백질} FACS?...

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토론

여기서는 MOG _{태그 단백질} 및 방법 MOG _{태그 단백질} 순수한 MOG _1-125을 생성하는 생산을위한 프로토콜을 기술 하였다. 이 프로토콜은 표준 그의 태그 기반의 단백질 정제 방법뿐만 아니라 이전 MOG 단백질 계 ^(15)의 생성을위한 전술 한 두 프로토콜에 기초한다. 그것은 여기에서 설명되지 않지만, MOG _{태그 단백질의} 주 사용은 단백질 항원을 면역 EAE를 유도하는 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BL21 E. coli- pet32-MOGtag	Kerfoot lab		These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request.
LB broth miller	Bioshop	LBL407.1
Ampicillin	bio basic	AB0028	Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C.
IPTG	Bioshop	IPT002.5	Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C.
Chicken-egg lysozyme	Bioshop	LYS702.10	Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C.
Triton-X100	Sigma	T-8532
Phosphate buffered saline	life technologies	20012-027	Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient.
Sodium chloride	Bioshop	SOD004.1
Tris-HCl	Bioshop	TRS002.1
Imidazole	Bioshop	IMD508.100
Guanidine-HCl	Sigma	G3272	The quality must be greater than 98% purity.
0.5 M EDTA	bioshop	EDT111.500
Nickel (II) sulfate	Bioshop	NIC700.500
His bind resin	EMD Millipore	69670-3	Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C
Anhydrous ethanol	Commercial Alcohols	P016EAAN	Dilute with water as needed.
Glacial acetic acid	Bioshop	ACE222.1
Sodium acetate trihydrate	Bioshop	SAA305.500
bovine serum albumin standard	bio-rad	500-0206
Bio-rad protein assay dye reagent concentrate	bio-rad	500-0006
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate	Fisher scientific	BP120-500
Tris-base	Bioshop	TRS001.1
7000 MW Snakeskin dialysis tubing	Thermoscientific	68700
2-mercaptoethanol	Sigma	M3148-25ml	This reagent should not be handled outside of a fume hood.
AcTEV protease	lifetechnologies	12575-015	Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17
Polyethyleneglycol 3350	Bioshop	PEG335.1
polyethyleneglycol 8000	Bioshop	PEG800.1
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate	ebioscience	44-2404-21
Sonicator	Fisher scientific	FB-120-110
Eon microplate spectrometer	Biotek	11-120-611	This equipment uses the Gen5 data analysis software.
Gen5 data analysis software	BioTek
sodium dodecyl sulphate	Bioshop	SDS001
bromophenol blue	Bioshop	BRO777
Glycerol	Bioshop	GLY001
Protein desalting columns	Thermoscientific	89849
Glycine	Bioshop	GLN001
precast 12% polyacrylamide gel	bio-rad	456-1045
Rapid stain reagent	EMD Millipore	553215
Gel dock EZ imager	bio-rad	1708270
White Light Sample Tray	bio-rad	1708272	Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains
Protein ladder	bio-rad	1610375