La indirecta neurona-astrocito Coculture Ensayo: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Puesta en marcha de la investigación detallada de las interacciones neurona-glía

Resumen

Este protocolo describe el co-cultivo de neuronas-astrocito indirecta para el análisis de las interacciones neurona compartimentada-glia.

Resumen

el desarrollo neuronal y la función es el requisito previo del desarrollo como en el cerebro adulto. Sin embargo, los mecanismos que subyacen a la formación altamente controlada y mantenimiento de redes neuronales complejas no se entienden por completo hasta el momento. Las preguntas abiertas relativas a las neuronas en salud y la enfermedad son diversas y que va desde la comprensión del desarrollo de base a la investigación de patologías relacionadas con el hombre, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer y la esquizofrenia. El análisis más detallado de las neuronas se puede realizar in vitro. Sin embargo, las neuronas son células exigentes y necesitan el apoyo adicional de los astrocitos para su supervivencia a largo plazo. Esta heterogeneidad celular está en conflicto con el objetivo de diseccionar el análisis de las neuronas y astrocitos. Presentamos aquí un ensayo de cultivo celular que permite la co-cultivo a largo plazo de las neuronas y astrocitos primarios puros, que comparten el mismo medio químicamente definido, mientras que estar físicamenteapartado. En esta configuración, las culturas sobreviven durante un máximo de cuatro semanas y el ensayo es adecuado para una diversidad de investigaciones relativas a la interacción neurona-glía.

Introducción

A lo largo de las últimas décadas, la interpretación general de la función neuroglia ha evolucionado a partir de la atribución de un apoyo meramente hacia un papel regulador activo en relación con la función neuronal ^1. Debido a su impacto importante en la homeostasis cerebral en salud y enfermedad ^2, los astrocitos son de especial interés para la comunidad científica. En los últimos años, una diversidad de estudios se han centrado en las interacciones neurona-glía in vivo e in vitro ^3. Sin embargo, la mayoría de los sistemas de cultivo no permiten el análisis separado de los dos tipos de células y de sus respectivos secretomas.

Varios enfoques explotan el cocultivo directo de las neuronas y glía para lograr la supervivencia de larga duración y el desarrollo de la red neuronal fisiológicamente relevante ^4-6. El presente protocolo alcanza los mismos objetivos, manteniendo ambos tipos de células separadas físicamente ^7. En comparación con conditioned medio se aproxima a ^8,9, nuestro sistema permite estudiar la comunicación bidireccional entre neuronas y astrocitos. La expresión de moléculas de señalización secretadas se puede monitorizar mientras que las células maduran en el medio compartido. Esta oportunidad es especialmente relevante, como astrocitos liberan factores solubles, tales como citoquinas, factores de crecimiento y moléculas de matriz extracelular ^10,11, regulando de este modo el crecimiento neuronal y la función ^7,12. Por lo tanto, se ha demostrado que la adición de trombospondina a las células ganglionares de la retina in vitro induce la formación de sinapsis ^13. Sin embargo, otros factores desconocidos son necesarias para hacer sinapsis funcionales ^13. Además, las moléculas liberadas por los astrocitos tienen que identificarse con el fin de comprender la base de las interacciones neurona-glía.

El cultivo de las neuronas primarias y astrocitos de ratón y de rata se ha descrito previamente ^14-16. Aquí nosotrospresentar una herramienta elegante y versátil para combinar ambos tipos de células en un enfoque cocultivo indirecto. Dado que las dos culturas se separan físicamente aún compartiendo el mismo medio, el impacto de las neuronas, astrocitos y las moléculas solubles, pueden ser analizados por separado, creando así una poderosa herramienta para estudios de interacciones neurona-glía.

Protocolo

Los experimentos con ratones estaban de acuerdo con la Ley Alemana y la Sociedad Alemana para la Neurociencia directrices de la cría de animales. Los comités de cuidado de los animales y la utilización de la Ruhr-Universität Bochum han concedido los permisos apropiados.

1. Preparación y cultivo de astrocitos corticales

Nota: Complete estos pasos del protocolo de al menos 7 días antes de proceder a los pasos siguientes, ya que los cultivos de astrocitos deben desarrollar en monocapas confluentes se preparan antes de las neuronas. astrocitos primarios se derivan a partir de cultivos gliales mixtos obtenidos de crías de ratón de todo el día postnatal (P) 0-3. Tres cerebros (6 cortezas) por matraz T75 se van a utilizar.

1. Preparar el medio de astrocitos completándolo medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% v / v de suero de caballo y 0,1% v / v de gentamicina en condiciones estériles. Almacenar el medio a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas.
2. Escudo 3x T75 frascos wiTH 10 mg / ml de poli-D-lisina (PDL; en el agua de cultivo celular de grado) durante al menos 1 h a 37 ° C en presencia de 6% v / v CO _2. Después del recubrimiento, lavar los frascos dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar los cationes no unidos, y añadir 9 ml medio de astrocitos.
3. Para la preparación de los cerebros, añadir solución salina equilibrada de 10 ml Hank (HBSS) a 1x 10 cm placa de Petri y 1 ml de HBSS a 1x 15 ml tubo (independientemente del número de los cerebros que se utilizará). Tenga un par de tijeras quirúrgicas, 2 pinzas finas y un binocular a su alcance para el procedimiento.
4. Decapitar a 3 crías rápidamente con las tijeras quirúrgicas y recoger las cabezas en un plato vacío de 10 cm.
   1. Realizar la preparación de la corteza bajo el binocular. El uso de dos pinzas finas, quitar la piel dorsal del cráneo en la línea media, comenzando desde el cuello hacia el nivel de los ojos. A partir de entonces, el cerebro con sus vasos sanguíneos es visible debajo del cráneo.
   2. Fijar la cabeza en el extremo rostral con un par de pinzas y una incisión en la línea media del cráneo, comenzando en el extremo posterior. Posteriormente, recortar la derecha y las mitades izquierda del cráneo para exponer el cerebro.
   3. Cierre la punta del fórceps y posicionarlo ventralmente bajo el cerebro. Levantar el cerebro fuera del cráneo y la transfiere en el HBSS-llenado 10 cm placa de Petri. Proceder de la misma manera con el modelo que faltan para que todos los cerebros se recogen en el plato.
5. Después de recoger los cerebros, comenzar con la separación de las cortezas pellizcando fuera de la parte posterior del cerebro usando un par de pinzas, como un par de tijeras. Realizar una incisión en la línea media entre los dos hemisferios con un par de fórceps. Fije cuidadosamente el cerebro con una pinza y corte el mesencéfalo y los bulbos olfatorios utilizando un segundo fórceps para terminar con las mitades corticales.
6. Fijar la mitad cortical con un par de pinzas y pelar las meninges de los hemisferios por separarlos fesde el borde lateral y posteriormente tirando de ellas desde la superficie cortical utilizando un segundo fórceps.
7. Da la vuelta al medio cortical con su superficie orientada hacia el plato; diseccionar cuidadosamente y retire el hipocampo forma de media luna utilizando un par de pinzas. La transferencia de las cortezas individuales en el cónica tubo de 15 ml usando un fórceps cerrados para realizar una corteza individuo.
8. Después de recoger todas las cortezas, el tránsito a la campana de flujo laminar estéril y comenzar con los preparativos para la disociación del tejido cortical.
9. Añadir 1 ml de DMEM a un tubo de reacción 2 ml y añadir 0,1% w / v de papaína (30 unidades). Incubar la suspensión en un baño de agua a 37 ° C hasta una solución clarificada se desarrolla (aproximadamente 3 min). Añadir 0,24 mg / ml de L-cisteína y 20 mg / ml de DNAsa y agitar suavemente.
   NOTA: Para la digestión, se necesita aproximadamente 1 ml de solución de enzima.
10. Filtro (0,22 micras de tamaño de poro) para obtener 1 ml de solución estéril antes de añadirque en el tejido cortical. Incubar los tubos durante 30 min - 1 h a 37 ° C (es decir, en un baño de _agua).
    NOTA: Los pasos 1.11 a 1.14 son críticos y deberían completarse dentro de 15 min.
11. Para terminar la reacción de digestión, añadir 1 ml de medio de astrocitos y se tritura cuidadosamente el tejido digerido usando una pipeta de 1 mL. Para la trituración, mueva suavemente el émbolo de la pipeta, la aspiración y la extrusión de la suspensión de tejido cortical de ese modo.
12. Una vez que el tejido ha sido disociado en una suspensión de una sola célula, añadir 5 ml de medio de astrocitos y centrifugar durante 5 min a 216 x g.
13. Aspirar el sobrenadante cuidadosamente del sedimento resultante y resuspender las células en 1 ml de medio de astrocitos.
14. Añadir las suspensiones de células a matraces T75 se repone con 9 ml de medio de astrocitos (véase 1.2).
15. Se incuban las células a 37 ° C en la incubadora en presencia de 6% v / v CO _2. Después de 4 días, lleve a cabo el primer cambio de medio completo (10 ml). A partir de entonces, cambiar el medio de cultivo cada 2 - 3 d.
16. Después de 7 días, comprobar si las células han formado una monocapa confluente. Si no es así, esperar otros 2 - 3 días hasta que se alcanza la confluencia completa de la cultura.
    NOTA: Los astrocitos muestran cuerpos de las células aplanadas grandes, localice en el fondo del matraz y no desarrollan procesos celulares notables. Se diferencian de las pequeñas células progenitoras brillantes de contraste de fase y microglia que residen en la parte superior de la monocapa ^17.
17. Con el fin de deshacerse de las células progenitoras y obtener un cultivo de astrocitos pura, poner los matraces T75 en un agitador orbital y agitar las culturas O / N a 250 rpm. Asegúrese de que la temperatura se ajusta a 37 ° C y que el filtro del matraz se selló con película de laboratorio para evitar la evaporación del CO _2.
18. El día siguiente, aspirar el medio y añadir medio de cultivo fresco de 10 ml rellena con 20 M de citosina-1-β-D-arabinofuranósido (AraC) para Eliminacélulas que se dividen residuales TE.
    NOTA: la incubación con AraC para 2 - 3 d en la incubadora a 37 ° C, 6% de CO ₂ resultará en un cultivo de astrocitos puro.
19. Vigilar la pureza de los cultivos de astrocitos mediante inspección visual bajo el microscopio óptico. Si contraste de fase residual brillante células progenitoras y microglia todavía residen en la parte superior de la monocapa de los astrocitos ¹⁷ (véase el paso 1.16), repita los pasos 1.18 y 1.19.
    NOTA: El confluentes y monocapas de astrocitos puros se pueden mantener durante un máximo de 14 días en la incubadora (37 ° C, v 6% v ₂ CO /) antes de proceder al siguiente paso. Cambiar la mitad del medio cada 3 d. No se debe recoger, de congelación y descongelación de los astrocitos, ya que estas células pierden sus propiedades neuronales de apoyo a través del procedimiento de almacenamiento.

2. Los astrocitos se preparan para el cocultivo indirecto

Nota: 48 - 72 h antes de preparar las neuronas, astrocitos transferencia a la cell-insertos de cultivo. Generalmente, un solo matraz T75 proporciona un número suficiente de células para apoyar los cultivos neuronales obtenidos con un preparado.

1. Colocar tantas como sea necesario insertos en 24 pocillos de placas. Escudo cada inserto con 10 mg / ml PDL (disuelto en agua de cultivo celular de grado) por alrededor de 1 h a 37 ° C, 6% v / v CO _2. Después de la incubación, lavar las piezas de inserción dos veces con PBS. Mientras tanto, proceder a la preparación de los astrocitos.
   NOTA: Los insertos llenos de PBS se pueden mantener hasta que la suspensión de células de astrocitos está listo para su uso.
2. Aspirar el medio de astrocitos (con AraC) y lavar la cultura una vez con 10 ml de PBS para asegurar que se quite cualquier suero residual.
3. Añadir 3 ml de tripsina-EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) 0,05% a los matraces y se incuban las células durante tripsinización a 37 ° C, 6% v / v _{de CO2} durante aproximadamente 10 min.
4. Controlar el desprendimiento de las células por inspección visual usando un microscopio y FacilitaTA El desprendimiento de las células tocando el lado de los matraces contra el escritorio.
   NOTA: Los pasos 2.5 a 2.8 son críticos y deberían ser terminado dentro de 15 - 20 min.
5. Después de la tripsinización, suavemente volver a suspender las células en medio de astrocitos 7 ml y transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml. Centrifugar durante 5 min a 216 x g.
6. aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 1 ml de medio de astrocitos.
7. Contar las células utilizando una cámara de recuento.
8. Llene el fondo de los pocillos de la placa de pocillos-24 con 500 l medio de astrocitos y la transferencia de 25.000 células en 500 l medio de astrocitos en cada inserto individual. Incubar el cultivo a 37 ° C, 6% v / v CO _2.
   NOTA: Tras recorrer 42 - 72 horas los cultivos alcanzarán aproximadamente el 100% de confluencia. En esta etapa la pureza del cultivo puede ser verificada mediante inmunohisto ^11. Los cultivos confluentes se pueden mantener durante un máximo de 7 días hasta que proceder a lapróximo paso. Cambiar la mitad del medio cada 3 d.

3. Preparación de las neuronas del hipocampo primaria

Nota: las neuronas del hipocampo de ratones primaria deben derivarse de E15.5 - E16 embriones de ratones embarazadas cronometrados.

1. Preparar medio neurona (MEM con piruvato de sodio 10 mM, 0,1% w / v ovoalbúmina, 2% v / v B27 suplemento de medio, y 0,1% v / v de gentamicina (esterilizada por filtración)), y medio de preparación (HBSS con 0,6% w / v de glucosa y 10 mM HEPES (ácido 4- (2-hidroxietil) -1-ácido etanosulfónico piperazina)). Pre-calentamiento y pre-equilibrar el medio de neuronas en frascos de filtro a 37 ° C, 6% v / v _{de CO2.}
2. Colocar los portaobjetos de vidrio (12 mm de diámetro) en los pocillos de 24 pocillos de placas (utilizar los cubreobjetos especiales, que tienen una muesca para el uso con insertos de cultivo celular).
   1. Escudo durante al menos 1 h con 15 mg / ml de poli-DL-ornitina en agua (cultivo celular de grado) a 37 ° C. Use por lo menos 500 l por pocillo para asegurar quelos cubreobjetos están completamente cubiertos. Lavar los pocillos dos veces con PBS. Deje el PBS en los pocillos hasta en placas las células. Asegúrese de que los pozos no se sequen.
3. Para diseccionar los hipocampos, preparar 3x 10 cm platos llenos con medio de preparación y 1x tubo de 2 ml con 1 ml medio preparación. Preparar tijeras y 2 pinzas finas.
4. Sacrificar el ratón embarazadas por dislocación cervical, esterilizar el abdomen mediante lavado con 70% v / v de etanol, y abrir el abdomen con unas tijeras afiladas. Extirpar el útero de cuentas cuidadosamente con unas tijeras y transferir el órgano en 1x 10 cm plato lleno de medio de preparación.
5. A continuación, retire los embriones del útero. incisión cuidadosamente el útero y eliminar el amnios sin dañar los embriones mediante el uso de 2 fórceps. A partir de entonces, decapitar cada embrión con un par de tijeras y transferir las cabezas en un segundo plato 10 cm suministrado con medio de preparación.
6. Proceder a la preparación de los cabezales (similar a la preparación se describe en 1.4 hasta 1.7).
   1. Inmovilizar la cabeza con un par de pinzas y una incisión en el cráneo y la piel en la región del cuello cerca de la parte posterior del cerebro, perpendicular a la neuroeje. Use un segundo par de pinzas para levantar tanto el cráneo y la piel que cubre, y doblar la tapa del cráneo suave hacia el extremo rostral de la cabeza, exponiendo de esta manera el cerebro.
   2. Con la ayuda de unas pinzas 2, separar el cerebro de la cavidad craneal. Para ello, cerca de 1 par de pinzas y separar el cerebro del cráneo a partir de los bulbos olfatorios y moviéndose hacia la parte posterior del cerebro. Recoge los cerebros en otra placa de 10 cm lleno de medio de preparación.
7. Diseccionar los hipocampos de los restos de la corteza, como se describe anteriormente para la preparación de astrocitos (paso 1.6). Retire el hipocampo de cada hemisferio y recogerlas en el tubo de 2 ml lleno de medio de preparación.
8. Después de completar la disección, transferir el tubo a la cámara de flujo laminar estéril y Digest el tejido del hipocampo con 1 ml solución de digestión que contiene papaína. Preparar la solución de digestión como se describe en el paso 01.09 a 01.10, pero el uso MEM lugar DMEM.
   NOTA: Los pasos 3.9 a 3.12 son críticos y deben ser completado dentro de los 10 - 15 min.
9. Después de la terminación de la digestión, retirar cuidadosamente la solución de digestión por succión suave con una pipeta.
10. Lavar los hipocampos 3 veces con medio neuronal añadiendo secuencialmente y posteriormente aspirar cuidadosamente 1 ml de medio de cultivo fresco por ciclo de lavado. No centrifugar la suspensión celular.
11. Después de la etapa de lavado final, se tritura cuidadosamente el tejido en 1 ml medio de la neurona.
12. Contar las células usando una cámara de recuento y la placa 35.000 células en 500 l de medio neurona por un solo pocillo de una de 24 pocillos de la placa (la placa mencionada en 3.2).
    NOTA: Opcionalmente, una alícuota de células se puede contratinción con azul de tripán para evaluar la vitalidad de la preparación de células. Controlar la densidad de placas por inspección visualion utilizando el microscopio (típicamente 90 - 110 células por campo visual de un objetivo estándar 10X).
13. Colocar las neuronas en la incubadora a 37 ° C, 6% v / v _{de CO2} durante 1 h.
14. Publicar incubación, tomar las inserciones preparados (sembradas con monocapas confluentes de astrocitos) fuera de la incubadora (véase el paso 2.8). Intercambiar el medio por aspiración el medio de astrocitos y reemplazándolo con 500 l de medio fresco neurona.
    NOTA: Los insertos deben albergar monocapas de astrocitos confluentes después de 2 - 3 Días DIV (in vitro).
15. Coloque los insertos con astrocitos cuidadosamente en los pocillos que contienen los cultivos de neuronas (paso 3.13) usando pinzas estériles.
16. Coloque el cocultivo neurona-astrocito indirecta resultante de nuevo en la incubadora a 37 ° C, 6% v / v CO _2.
    NOTA: En estas condiciones, las neuronas pueden ser cultivadas para un máximo de 4 semanas en medio completamente definido. Ningún cambio medio es necesario. Para los cultivos de largo plazo, se recomienda llenar correopozos MPTY con agua estéril con el fin de reducir la evaporación de la placa de pocillos 24.
17. Realizar análisis in vitro de células de cultivo después de períodos deseado (por ejemplo, para inmunocitoquímica, PCR, Western blot, los registros electrofisiológicos de pinzamiento zonal (o matriz multielectrodo) ^7,15,18).
    NOTA: El sistema de cultivo también es adecuado para el tratamiento farmacológico agudo y crónico de las culturas ^11.

Resultados

El análisis de los cultivos neuronales a través del sistema de cocultivo indirecto es múltiple y se puede realizar en diferentes etapas de la maduración de la cultura. Debido al hecho de que las células se pueden mantener durante un máximo de 4 semanas, son posibles investigaciones a largo plazo de los cultivos.

El esquema en el panel central izquierda de la Figura 1 demuestra la configuración de cocult...

Discusión

El objetivo principal del protocolo actual consiste en cultivos neuronales y los astrocitos completamente separados, mientras se mantiene en medio compartido. Por esta razón, la pureza de los cultivos obtenidos debe ser verificada en el comienzo del procedimiento. Se recomienda el uso de la tubulina específico de neuronas, o la proteína de neurofilamentos NeuN como marcadores neuronales, GFAP como marcador de los astrocitos, antígeno O4 como marcador precursor de oligodendrocitos y la proteína Iba1 para identificar...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
B27	Gibco (Life Technologies)	17504-044
Cell-culture-grade water	MilliQ
Cytosine-β-D-arabinofuranoside (AraC)	Sigma-Aldrich	C1768	CAUTION: H317, H361
DMEM	Gibco (Life Technologies)	41966-029
DNAse	Worthington	LS002007
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1397	CAUTION: H317-334
Glucose	Serva	22700
HBSS	Gibco (Life Technologies)	14170-088
HEPES	Gibco (Life Technologies)	15630-056
Horse serum	Biochrom AG	S9135
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C-2529
MEM	Gibco (Life Technologies)	31095-029
Ovalbumin	Sigma-Aldrich	A7641	CAUTION: H334
Papain	Worthington	3126
PBS	self-made
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P0899
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P3655
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636
Trypsin-EDTA	Gibco (Life Technologies)	25300054
Equipment
24-well-plates	Thermoscientific/Nunc	142475
24-wells-plate (for the  indirect co-culture)	BD Falcon	353504
Binocular	Leica	MZ6
Cell-culture inserts	BD Falcon	353095
Centrifuge	Heraeus	Multifuge 3S-R
Counting Chamber	Marienfeld	650010
Forceps	FST Dumont (#5)	11254-20
glass cover slips (12 mm)	Carl Roth (Menzel- Gläser)	P231.1
Incubator	Thermo Scientific	Heracell 240i
Micro-tube (2 mL)	Sarstedt	72,691
Microscope	Leica	DMIL
Millex Syringe-driven filter unit	Millipore	SLGV013SL
Orbital shaker	New Brunswick Scientific	Innova 4000
Parafilm	Bemis	PM-996
Petri dishes (10 cm)	Sarstedt	833,902
pipette (1 mL)	Gilson	Pipetman 1000
Sterile work bench	The Baker Company	Laminar Flow SterilGARD III
Surgical scissors	FST Dumont	14094-11
Syringe	Henry Schein	9003016
T75 flask	Sarstedt	833,911,002
tube (15 mL)	Sarstedt	64,554,502
Water bath	GFL	Water bath type 1004