La indiretto Neuron-astrociti co-coltura saggio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up per l&#39;indagine dettagliata delle Interazioni neuroni-glia

Riepilogo

Questo protocollo descrive l'indiretta co-coltura di neuroni-astrociti per l'analisi compartimenti stagni delle interazioni neuroni-glia.

Abstract

Corretto sviluppo e la funzione neuronale è il presupposto di sviluppo e il cervello adulto. Tuttavia, i meccanismi alla base della formazione altamente controllato e manutenzione di reti neuronali complesse sono state comprese finora. Le questioni aperte in materia di neuroni nella salute e nella malattia sono diversi e si estende da comprendere lo sviluppo di base per indagare le patologie legate umani, per esempio, il morbo di Alzheimer e la schizofrenia. L'analisi più dettagliata dei neuroni può essere eseguita in vitro. Tuttavia, i neuroni sono esigenti cellule e hanno bisogno del sostegno supplementare degli astrociti per la loro sopravvivenza a lungo termine. Questa eterogeneità cellulare è in conflitto con l'obiettivo di analizzare l'analisi di neuroni e astrociti. Presentiamo qui un test di coltura cellulare che consente la co-coltivazione a lungo termine di neuroni primari puri e astrociti, che condividono lo stesso mezzo chimicamente definito, pur essendo fisicamenteseparato. In questa configurazione, le culture sopravvivono per un massimo di quattro settimane e il test è adatto per una varietà di indagini riguardanti l'interazione neuroni-glia.

Introduzione

Nel corso degli ultimi decenni, l'interpretazione generale della funzione nevroglia si è evoluta da l'attribuzione di un solo supporto verso un ruolo regolatore attivo per quanto riguarda la funzione neuronale ^1. A causa del loro impatto di rilievo sulla omeostasi del cervello in salute e malattia ^2, astrociti sono di particolare interesse per la comunità scientifica. Negli ultimi anni, una diversità di studi si sono concentrati sulle interazioni neuroni-glia in vivo e in vitro ^3. Tuttavia, la maggior parte dei sistemi di coltura non consentono per l'analisi separata delle due tipi cellulari e dei rispettivi secretomes.

Diversi approcci sfruttano la co-coltivazione diretta dei neuroni e glia per raggiungere la sopravvivenza di lunga durata e fisiologicamente rilevanti di sviluppo della rete neuronale ^4-6. Il presente protocollo raggiunge gli stessi obiettivi, mantenendo entrambi i tipi di cellule separate fisicamente ^7. Rispetto al conditioned media si avvicina a ^8,9, il nostro sistema permette di studiare la comunicazione bidirezionale tra neuroni e astrociti. L'espressione di molecole di segnalazione secrete può essere monitorato mentre le cellule maturare nel mezzo condiviso. Questa opportunità è particolarmente rilevante, come astrociti rilasciano fattori solubili, come le citochine, fattori di crescita e molecole della matrice extracellulare ^10,11, regolando così la crescita neuronale e funzionano ^7,12. Pertanto, è stato dimostrato che l'aggiunta di trombospondina alle cellule gangliari retiniche in vitro induce la formazione di sinapsi ^13. Tuttavia, sono necessari per rendere sinapsi funzionali ¹³ altri fattori ancora sconosciuti. Inoltre, molecole rilasciate dagli astrociti devono essere identificati al fine di comprendere la base delle interazioni neuroni-glia.

La coltivazione di neuroni primari e astrociti di topo e ratto è stato descritto in precedenza ^14-16. Qui noipresentare uno strumento elegante e versatile per combinare entrambi i tipi cellulari in un approccio co-coltura indiretta. Poiché le due culture sono fisicamente separati ancora condividere lo stesso mezzo, l'impatto di neuroni, astrociti e molecole solubili, possono essere analizzate separatamente, creando così un potente strumento per studi di interazione neuroni-glia.

Protocollo

Gli esperimenti con i topi erano in conformità con la legge tedesca e la Società tedesca per le linee guida Neuroscience di allevamento. La cura degli animali e di utilizzo comitati del Università della Ruhr a Bochum hanno concesso i permessi appropriati.

1. Preparazione e coltivazione di corticale astrociti

Nota: Completate queste fasi del protocollo almeno 7 d prima di procedere alle fasi successive, come le colture di astrociti dovrebbero svilupparsi in monostrati confluenti prima che i neuroni sono preparati. astrociti primari sono derivati ​​da colture gliali miste ottenute da cuccioli di topo intorno al giorno postnatale (P) 0-3. Tre cervelli (6 cortecce) per beuta T75 devono essere utilizzati.

1. Preparare il mezzo astrociti completandolo Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) con il 10% di siero v / v cavallo e 0,1% v / v gentamicina in condizioni sterili. Conservare il mezzo a 4 ° C per 2 settimane.
2. Cappotto 3x T75 Boccette with 10 ug / mL Poly-D-lisina (PDL; in acqua coltura cellulare-grade) per almeno 1 ora a 37 ° C in presenza di 6% v / v CO _2. Dopo il rivestimento, lavare i flaconi due volte con tampone fosfato salino (PBS) per rimuovere i cationi non legati, e aggiungere 9 ml di media astrociti.
3. Per la preparazione dei cervelli, aggiungere soluzione salina bilanciata di Hank 10 mL (HBSS) a 1x 10 centimetri Petri e 1 mL HBSS a 1x 15 mL tubo (indipendentemente dal numero di cervelli che verrà utilizzato). Tenere un paio di forbici chirurgiche, 2 pinza sottile e un binocolo a portata di mano per la procedura.
4. Decapitare 3 cuccioli rapidamente con le forbici chirurgiche e raccogliere le teste in un vuoto 10 centimetri piatto.
   1. Eseguire la preparazione delle cortecce sotto il binocolo. Utilizzando due pinza sottile, rimuovere la pelle dorsale dal cranio alla linea mediana, partendo dal collo verso il livello degli occhi. Successivamente, il cervello con i suoi vasi sanguigni è visibile sotto il cranio.
   2. Fissare la testa alla fine rostrale con un paio di pinze e incidere la linea mediana del cranio, a partire dalla fine posteriore. Successivamente, la clip fuori le metà sinistra del cranio a destra e per esporre il cervello.
   3. Chiudere la punta della pinza e posizionarlo sul ventre sotto il cervello. Sollevare il cervello fuori dal cranio e trasferirlo in HBSS pieno di 10 centimetri Petri. Procedere allo stesso modo con gli altri campioni fino a quando tutti i cervelli sono raccolti nel piatto.
5. Dopo aver raccolto il cervello, inizia con la separazione delle cortecce pizzicando fuori romboencefalo usando un paio di pinze, come un paio di forbici. Eseguire un'incisione mediana tra i due emisferi, con un paio di pinze. fissare con cura il cervello con una pinza e tagliare il mesencefalo e bulbi olfattivi utilizzando un secondo pinza per finire con le due metà corticali.
6. Fissare la metà corticale con un paio di pinze e sbucciare le meningi dalle emisferi da loro distacco FROM il bordo laterale e successivamente tirando dalla superficie corticale utilizzando un secondo pinza.
7. Capovolgere la parte corticale con la sua superficie orientata verso il piatto; attenzione sezionare e rimuovere l'ippocampo a forma di mezzaluna con un paio di pinze. Trasferire i singoli cortecce nel conico tubo da 15 ml utilizzando una pinza chiusi per portare un individuo corteccia.
8. Dopo aver raccolto tutte le cortecce, transito verso la cappa a flusso laminare sterile e iniziare con i preparativi per la dissociazione del tessuto corticale.
9. Aggiungere 1 ml DMEM in una provetta 2 mL di reazione e aggiungere 0,1% w / v papaina (30 unità). Incubare la sospensione in un bagno d'acqua a 37 ° C fino a quando una soluzione chiarificata sviluppa (circa 3 min). Aggiungere 0,24 mg / ml di L-cisteina e 20 mg / ml DNAsi e agitare delicatamente.
   NOTA: Per la digestione, è necessario circa 1 mL di soluzione enzimatica.
10. Filtro (0,22 micron dimensione dei pori) per ottenere 1 ml di soluzione sterile prima di aggiungereal tessuto corticale. Incubare le provette per 30 min - 1 ora a 37 ° C (cioè, in un bagno _d'acqua).
    NOTA: i passaggi 1,11-1,14 sono critici e dovrebbe essere completato entro 15 minuti.
11. Per terminare la reazione di digestione, aggiungere 1 ml di media astrociti e triturare con cura il tessuto digerito con una pipetta 1 ml. Per triturazione, spostare delicatamente lo stantuffo della pipetta, aspirando così e estrusione la sospensione tessuto corticale.
12. Una volta che il tessuto è stato dissociato in una cella singola sospensione, aggiungere 5 ml di media astrociti e centrifugare per 5 min a 216 x g.
13. Aspirare il surnatante con cura dal pellet risultante e sospendere nuovamente le cellule in 1 media astrociti ml.
14. Aggiungere le sospensioni cellulari per fiaschi T75 rifornito con 9 medio astrociti mL (vedi 1.2).
15. Incubare le cellule a 37 ° C in incubatore in presenza di 6% v / v CO _2. Dopo 4 d, eseguire il primo cambio terreno completo (10 mL). Successivamente, modificare il terreno di coltura ogni 2 - 3 d.
16. Dopo 7 d, verificare se le cellule hanno formato un monostrato confluente. In caso contrario, attendere per altri 2 - 3 giorni fino è raggiunto completa confluenza della cultura.
    NOTA: Gli astrociti visualizzare grandi corpi cellulari appiattite, localizzare sul fondo del pallone e non sviluppano processi cellulari notevoli. Essi differiscono dalle piccole cellule progenitrici luminose a contrasto di fase e microglia risiedono in cima al monostrato ^17.
17. Al fine di eliminare le cellule progenitrici e di ottenere una coltura pura astrociti, posizionare i contenitori T75 su un agitatore orbitale e scuotere le culture O / N a 250 rpm. Assicurarsi che la temperatura viene regolata a 37 ° C e che il filtro del pallone viene sigillato con una pellicola di laboratorio per evitare l'evaporazione del CO _2.
18. Il giorno successivo, aspirare il terreno e aggiungere terreno di coltura di 10 ml di fresca rifornito con 20 mM citosina-1-β-D-arabinofuranoside (AraC) a eliminacellule che si dividono residue te.
    NOTA: incubazione con AraC per 2 - 3 d in incubatore a 37 ° C, il 6% di CO ₂ si tradurrà in una coltura pura astrociti.
19. Monitorare la purezza delle colture di astrociti mediante ispezione visiva sotto il microscopio ottico. Se le cellule progenitrici luminoso residuo a contrasto di fase e microglia risiedono ancora in cima alla monostrato astrociti ¹⁷ (vedi punto 1.16), ripetere i punti 1.18 e 1.19.
    NOTA: Il confluenti e monostrati astrociti puri possono essere mantenuti fino a 14 d in incubatrice (37 ° C, il 6% v / v di CO ₂₎ prima di procedere alla fase successiva. Cambiare la metà del mezzo ogni 3 d. Non raccogliere, congelare e scongelare i astrociti, come queste cellule perdono le loro proprietà di supporto neuronali attraverso la procedura di memorizzazione.

2. Gli astrociti preparando per il co-coltura indiretta

Nota: 48 - 72 ore prima di preparare i neuroni, astrociti trasferimento al celInserti l-cultura. Generalmente, una singola beuta T75 fornisce un numero sufficiente di cellule per sostenere le colture neuronali ottenuti con una preparazione.

1. Posto come molti inserti come necessario in 24-pozzetti-. Coat ciascun inserto con 10 ug / mL PDL (disciolto in acqua coltura cellulare-grade) per circa 1 ora a 37 ° C, 6% v / v CO _2. Dopo l'incubazione, lavare gli inserti due volte con PBS. Nel frattempo, procede all'elaborazione di astrociti.
   NOTA: Gli inserti riempiti con PBS possono essere mantenuti fino alla sospensione cellulare astrociti è pronto all'uso.
2. Aspirare il mezzo di astrociti (con AraC) e lavare la cultura una volta con 10 ml di PBS per garantire qualsiasi siero residuo viene rimosso.
3. Aggiungere 3 ml di 0,05% tripsina-EDTA (acido etilendiamminotetraacetico) ai flaconi e incubare le cellule per tripsinizzazione a 37 ° C, 6% v / v CO ₂ per circa 10 min.
4. Controllare il distacco delle cellule mediante ispezione visiva utilizzando un microscopio e facilitaTE il distacco delle cellule toccando il lato dei flaconi contro desktop.
   NOTA: i passaggi 2,5-2,8 sono critici e dovrebbe essere completato entro 15 - 20 min.
5. Dopo la tripsinizzazione, delicatamente risospendere le cellule in 7 mL medio astrociti e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml. Centrifugare per 5 min a 216 x g.
6. Con attenzione aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 media astrociti ml.
7. Contare le cellule utilizzando una camera di conteggio.
8. Riempire il fondo dei pozzetti della 24-ben piatto con 500 microlitri di media astrociti e trasferire 25.000 cellule in 500 microlitri di media astrociti in ogni singolo inserimento. Incubare la coltura a 37 ° C, 6% v / v CO _2.
   NOTA: dopo 42 - 72 ore, le culture raggiungerà circa il 100% di confluenza. In questa fase la purezza della coltura può essere verificata mediante immunocitochimica ^11. Le colture confluenti possono essere mantenute per un massimo di 7 d fino procedere allaprossimo passo. Cambiare la metà del mezzo ogni 3 d.

3. Preparazione di primaria neuroni dell'ippocampo

Nota: neuroni dell'ippocampo di topo primaria dovrebbero essere derivati ​​da E15.5 - E16 embrioni di topi in gravidanza cronometrati.

1. Preparare mezzo neurone (MEM con 10 mM piruvato di sodio, 0,1% w / v ovalbumina, 2% v / v B27 mezzo integratore, e 0,1% v / v gentamicina (sterile filtrato)), e media di preparazione (HBSS con 0,6% w / v glucosio e 10 mM HEPES (4- (2-idrossietil) acido etansolfonico -1-piperazina)). Pre-calda e pre-equilibrare il mezzo neurone in beute per filtrazione a 37 ° C, 6% v / v CO _2.
2. Posizionare il vetro-coprioggetti (diametro 12 mm) nei pozzetti di 24 pozzetti piastre (utilizzare i coprioggetti speciali, che sono dentata per l'utilizzo con inserti colture cellulari).
   1. Coat per almeno 1 h con 15 ug / mL Poly-DL-ornitina in acqua (coltura cellulare-grade) a 37 ° C. Utilizzare almeno 500 microlitri per pozzetto per garantire chei coprioggetti sono completamente coperti. Lavare i pozzetti due volte con PBS. Lasciare il PBS nei pozzetti fino placcatura le cellule. Assicurarsi che i pozzi non si asciugano.
3. Per sezionare i ippocampi, preparare 3x 10 cm piatti pieni di media preparazione e 1x tubo di 2 ml con 1 mezzo di preparazione ml. Preparare forbici e 2 pinza sottile.
4. Sacrificare il mouse incinta di dislocazione cervicale, sterilizzare l'addome mediante lavaggio con il 70% v / v di etanolo, e aprire l'addome con le forbici affilate. Asportare l'utero di perline accuratamente con le forbici e trasferire l'organo in 1x 10 centimetri piatto pieno di media preparazione.
5. Quindi, rimuovere gli embrioni dall'utero. incidere con cura l'utero e rimuovere la membrana amniotica senza danneggiare gli embrioni utilizzando 2 pinze. Successivamente, decapitate ogni embrione con un paio di forbici e trasferire le teste in un secondo piatto 10 centimetri fornito con media preparazione.
6. Procede all'elaborazione delle teste (simile al preparzione descritto nella 1,4-1,7).
   1. Immobilizzare la testa con un paio di pinze e incidere il cranio e pelle nella regione del collo vicino al hindbrain, perpendicolare al nevrasse. Utilizzare un secondo paio di pinze per sollevare sia cranio e pelle che ricopre, e piegare la calotta morbida verso la fine rostrale della testa, esponendo così il cervello.
   2. Con l'aiuto di 2 pinze, staccare il cervello dalla cavità cranica. Per fare questo, chiudi 1 paio di pinze e separare il cervello dal cranio a partire da bulbi olfattivi e lo spostamento verso il rombencefalo. Raccogliere il cervello in un altro 10 centimetri piatto pieno di media preparazione.
7. Sezionare ippocampi dalle porzioni corteccia come descritto sopra per la preparazione astrociti (passo 1.6). Rimuovere il ippocampi da ciascun emisfero e raccoglierli nel tubo 2 ml riempita con il mezzo di preparazione.
8. Dopo aver completato la dissezione, trasferire il tubo al banco flusso laminare sterile e Digest il tessuto dell'ippocampo con 1 soluzione di digestione mL contenente papaina. Preparare la soluzione di digestione come descritto nella fase 1,9-1,10, ma utilizzare MEM invece DMEM.
   NOTA: i passaggi 3,9-3,12 sono critici e dovrebbe essere completato entro 10 - 15 minuti.
9. Dopo il completamento della digestione, prelevare con attenzione la soluzione digestione delicata aspirazione con una pipetta.
10. Lavare il ippocampi 3 volte con mezzo neurone dalla sequenza aggiungendo e, successivamente, con attenzione aspirare 1 ml di coltura fresco di media per ogni ciclo di lavaggio. Non centrifugare la sospensione cellulare.
11. Dopo l'ultimo lavaggio, triturare accuratamente il tessuto 1 medium neurone mL.
12. Contare le cellule utilizzando una camera di conteggio e piastra 35.000 cellule in 500 microlitri di media neurone per un singolo pozzo di un 24-ben piastra (il piatto di cui al 3.2).
    NOTA: Facoltativamente, un'aliquota cella può essere contrastate con trypan blu per valutare la vitalità della preparazione cellulare. Controllare la densità di placcatura da Visual ispezionareionico usando il microscopio (tipicamente 90 - 110 cellule per campo visivo di un obiettivo standard di 10X).
13. Inserire neuroni nel incubatore a 37 ° C, 6% v / v CO ₂ per 1 h.
14. Invia le incubazione, prendere gli inserti preparati (seminato con monostrati confluenti astrociti) fuori dell'incubatore (vedi punto 2.8). Sostituire il supporto aspirando medio astrociti e la sua sostituzione con 500 microlitri di media neurone fresco.
    NOTA: Gli inserti deve ospitare monostrati astrociti confluenti dopo 2 - 3 DIV (giorni in vitro).
15. Posizionare gli inserti con astrociti attenzione nei pozzetti che contengono le culture neuronali (punto 3.13) con pinza sterile.
16. Posizionare la risultante indiretta co-coltura di neuroni-astrociti di nuovo nel incubatore a 37 ° C, il 6% v / v di CO _2.
    NOTA: In queste condizioni, i neuroni possono essere coltivate per 4 settimane mezzo completamente definito. Nessun cambiamento mezzo è necessaria. Per le colture da lungo tempo, si consiglia di riempire epozzi mpty con acqua sterile per ridurre l'evaporazione dal 24 a micropiastre.
17. Eseguire in vitro delle cellule analisi dopo periodi di coltura desiderata (ad esempio, per immunocitochimica, PCR, Western Blot, registrazioni elettrofisiologiche (patch clamp o matrice multielettrodico)) ^7,15,18.
    NOTA: Il sistema di coltura è adatto anche per il trattamento farmacologico acuta e cronica delle culture ^11.

Risultati

L'analisi delle colture neuronali tramite il sistema di co-coltura indiretta è multiforme e può essere eseguita in diverse fasi della cultura stagionatura. A causa del fatto che le cellule possono essere mantenute fino a 4 settimane, indagini a lungo termine delle culture sono possibili.

Lo schema del pannello centrale sinistro della figura 1 mostra la configurazione co-coltivazione. Con l'uso di que...

Discussione

L'obiettivo principale del protocollo attuale è quello di colture neuronali e astrociti completamente separati, mentre li mantenendo in mezzo condiviso. Per questo motivo, la purezza delle colture ottenute vanno verificate all'inizio del procedimento. Si consiglia l'uso di tubulina specifica dei neuroni, neurofilamenti o proteine ​​NeuN come marcatori neuronali, GFAP come marcatore astrociti, O4 antigene come marcatore degli oligodendrociti precursore e proteine ​​Iba1 per identificare microglia.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
B27	Gibco (Life Technologies)	17504-044
Cell-culture-grade water	MilliQ
Cytosine-β-D-arabinofuranoside (AraC)	Sigma-Aldrich	C1768	CAUTION: H317, H361
DMEM	Gibco (Life Technologies)	41966-029
DNAse	Worthington	LS002007
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1397	CAUTION: H317-334
Glucose	Serva	22700
HBSS	Gibco (Life Technologies)	14170-088
HEPES	Gibco (Life Technologies)	15630-056
Horse serum	Biochrom AG	S9135
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C-2529
MEM	Gibco (Life Technologies)	31095-029
Ovalbumin	Sigma-Aldrich	A7641	CAUTION: H334
Papain	Worthington	3126
PBS	self-made
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P0899
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P3655
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636
Trypsin-EDTA	Gibco (Life Technologies)	25300054
Equipment
24-well-plates	Thermoscientific/Nunc	142475
24-wells-plate (for the  indirect co-culture)	BD Falcon	353504
Binocular	Leica	MZ6
Cell-culture inserts	BD Falcon	353095
Centrifuge	Heraeus	Multifuge 3S-R
Counting Chamber	Marienfeld	650010
Forceps	FST Dumont (#5)	11254-20
glass cover slips (12 mm)	Carl Roth (Menzel- Gläser)	P231.1
Incubator	Thermo Scientific	Heracell 240i
Micro-tube (2 mL)	Sarstedt	72,691
Microscope	Leica	DMIL
Millex Syringe-driven filter unit	Millipore	SLGV013SL
Orbital shaker	New Brunswick Scientific	Innova 4000
Parafilm	Bemis	PM-996
Petri dishes (10 cm)	Sarstedt	833,902
pipette (1 mL)	Gilson	Pipetman 1000
Sterile work bench	The Baker Company	Laminar Flow SterilGARD III
Surgical scissors	FST Dumont	14094-11
Syringe	Henry Schein	9003016
T75 flask	Sarstedt	833,911,002
tube (15 mL)	Sarstedt	64,554,502
Water bath	GFL	Water bath type 1004