את assay Coculture Neuron-astrocyte העקיפה: An<em&gt; במבחנה</em&gt; הגדרה לחקירה המפורטת של נוירון, גליה אינטראקציות

Summary

פרוטוקול זה מתאר את coculture נוירון astrocyte עקיפות ניתוח מידור של נוירון, גליה אינטראקציות.

Abstract

התפתחות עצבית תקינה ותפקוד הוא התנאי ההכרחי של הפיתוח ו במוח הבוגר. עם זאת, המנגנונים להיווצרות מאוד מבוקר ותחזוקה של רשתות נוירונים מורכבות אינם מובנים לחלוטין עד כה. השאלות הפתוחות בנוגע נוירונים בבריאות ובחולי מגווני לכת להבנת ההתפתחות הבסיסית לחקירת פתולוגיות הקשורות אדם, למשל, מחלת אלצהיימר וסכיזופרניה. הניתוח המפורט ביותר של נוירונים יכול להתבצע במבחנה. עם זאת, נוירונים דורשים תאים זקוקים לתמיכה נוספת של האסטרוציטים להישרדות ארוכת הטווח. ההטרוגניות הסלולר זהו בסכסוך במטרה לנתח את הניתוח של נוירונים האסטרוציטים. אנו מציגים כאן assay תא-תרבות המאפשר cocultivation ארוכת הטווח של הנוירונים העיקריים טהור האסטרוציטים, אשר חולקים את אותה בינוני הגדרה כימית, בעת היותו פיזיתמופרד. במצב זה, התרבויות לשרוד במשך עד ארבעה שבועות assay הוא מתאים למגוון של חקירות לגבי האינטראקציה נוירון, גליה.

Introduction

במהלך העשורים האחרונים, הפרשנות הכללית של תפקוד תאי גלייה התפתחה מן הייחוס של תומכת רק לקראת תפקיד רגולציה פעיל בדבר עצבי פונקציה ^1. בגלל ההשפעה הבולטת שלהם על הומאוסטזיס המוח בבריאות ובחולי ^2, האסטרוציטים הם בעלי עניין מיוחד עבור הקהילה המדעית. בשנים האחרונות, מגוון של המחקרים התמקדו נוירון, גליה אינטראקציות in vivo ו במבחנה ^3. עם זאת, רוב מערכות התרבות אינו מאפשרים הניתוח הנפרד של שני סוגי התאים ושל secretomes שלהם.

גישות מספר לנצל את cocultivation הישיר של נוירונים גליה להשיג הישרדות לאורך זמן ופיתוח רשת עצבית רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ^4-6. הפרוטוקול הנוכחי מגיע את אותן מטרות, תוך שמירה על סוגי תאים הן מופרדות ⁷ פיזית. לעומת conditioneבינוני ד גישות ^8,9, המערכת שלנו מאפשרת ללמוד את בתקשורת דו-כיוונית בין הנוירונים האסטרוציטים. הביטוי של מולקולות איתות מופרשים ניתן לנטר תוך התאים לְהַבשִׁיל במדיום המשותף. הזדמנות זה רלוונטית במיוחד, כמו האסטרוציטים לשחרר גורמים מסיסים, כגון ציטוקינים, גורמי גדילה ומולקולות מטריקס ^10,11, ובכך ויסות צמיחה עצבית ולתפקד ^7,12. לפיכך, הוכח כי תוספת של thrombospondin לתאי הגנגליון ברשתית במבחנה גורם להיווצרות של סינפסות ^13. עם זאת, אחרים עדיין גורמים לא ידועים נחוצים כדי להבהיר סינפסות ¹³ פונקציונלית. יתר על כן, מולקולות שפורסמו על ידי האסטרוציטים צריכות להיות מזוהות כדי להבין את הבסיס של נוירון, גליה אינטראקציות.

הטיפוח של נוירונים עיקרי האסטרוציטים מעכבר והחולדה תואר בעבר ^14-16. הנה אנחנולהציג כלי אלגנטים צדדי לשלב בין שני סוגי התאים בגישת coculture עקיפה. מאז שתי התרבויות מופרדים פיזית עדיין חולקים את אותו בינוני, ההשפעה של נוירונים, האסטרוציטים ומולקולות מסיסים, ניתן לנתח בנפרד, ובכך ליצור כלי רב עוצמה עבור מחקרים אינטראקציה נוירון, גליה.

Protocol

הניסויים עם עכברים היו בהתאם לחוק הגרמני ואת החברה הגרמנית הנחיות Neuroscience של בעלי חיים. ועדות הטיפול וניצול בעלי חיים של בוכום הרור, האוניברסיטה העניקו את האישורים המתאימים.

הכנה טיפוח 1. של האסטרוציטים קורטיקלי

ההערה: בצע את השלבים הבאים של הפרוטוקול לפחות 7 ד לפני שאמשיך את הצעדים הבאים, כמו תרבויות astrocyte צריכות להתפתח monolayers ומחובר לפני נוירונים ערוכים. האסטרוציטים ראשיים נגזרים מתרבויות גליה מעורבות המתקבלות גורי עכבר סביב יום לידה (P) 0-3. שלושה מוחות (6 הקורטקס) לכל בקבוק T75 הם לשמש.

1. הכן את המדיום astrocyte ידי משלים בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם סרום סוס V / V 10% ו -0.1% v / v gentamycin בתנאים סטריליים. אחסן את המדיום על 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות.
2. 3x מעיל T75 צלוחיות wiה 10 מיקרוגרם / מ"ל Poly-D- ליזין (PDL; במים תא-תרבות-כיתה) עבור h 1 לפחות ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 6% v / v ₂ CO. לאחר ציפוי, לשטוף את הצלוחיות פעמים עם פוספט שנאגר מלוח (PBS) כדי להסיר קטיונים מאוגדים, ולהוסיף 9 בינוני astrocyte מיליליטר.
3. להכנת במוחם, להוסיף 10 תמיסת מלח מאוזן של מ"ל האנק (HBSS) כדי 1X 10 ס"מ צלחת פטרי ו 1 מ"ל HBSS כדי 1x 15 צינור מ"ל (ללא קשר למספר של המוח אשר ישמשו). שמור זוג מספריים כירורגיות, 2 מלקחיים בסדר המשקפת בהישג יד עבור ההליך.
4. לערוף 3 גורים במהירות עם מספריים כירורגיות ולאסוף ראשי בצלחת 10 ס"מ ריק.
   1. בצע את הכנת הקורטקס תחת המשקפת. שימוש בשני מלקחיים בסדר, להסיר את עור הגב מהגולגולת על קו האמצע, החל מהצוואר לכיוון רמת העיניים. לאחר מכן, המוח עם כלי הדם שלו גלוי תחת הגולגולת.
   2. תקן את הראש בסוף המקורי עם זוג מלקחיים לחתוך את קו האמצע של הגולגולת, החל בסוף האחורי. בהמשך לכך, קליפ את הזכות ואת החצאים השמאלי של הגולגולת כדי לחשוף את המוח.
   3. סגור את קצה מלקחי מיצובו ventrally תחת המוח. הרם את המוח מתוך הגולגולת ולהעביר אותו לתוך צלחת HBSS מלא 10 ס"מ פטרי. המשך באותו אופן עם הדגימה שנותרו עד שכל המוחות נאספים בצלחת.
5. לאחר איסוף המוח, להתחיל עם הפרדה של קליפת המוח על ידי צובט את למוח האחורי בעזרת זוג מלקחיים כמו זוג מספריים. בצע חתך קו אמצע בין שתי ההמיספרות עם זוג אחד של מלקחיים. בזהירות לתקן את המוח עם מלקחיים לנתק את המוח התיכון ואת נורות חוש הריח באמצעות מלקחיים שניים בסופו של דבר עם חצי קליפת המוח.
6. תקן חצי אחד של קליפת המוח עם זוג אחד של מלקחיים לקלף את קרומי המוח מן האונות ידי ניתוקם fROM קץ לרוחב ובהמשך מושך אותם מפני השטח של קליפת המוח באמצעות מלקחיים שניים.
7. הפוך את חצי קליפת המוח עם המשטח בכיוון מטה לכיוון צלחת; בזהירות לנתח ולהסיר את ההיפוקמפוס בצורת חצי סהר באמצעות זוג אחד של מלקחיים. מעביר את הקורטקס היחיד לתוך צינור 15 מיליליטר החרוטים באמצעות מלקחיים סגורים לשאת קליפת פרט.
8. לאחר איסוף כל הקורטקס, מעבר למכסת מנוע הזרימה למינרית סטרילי ולהתחיל בהכנות לקראת הניתוק של רקמת קליפת המוח.
9. הוסף 1 מ"ל DMEM לצינור 2 מ"ל התגובה ולהוסיף 0.1% w / v פפאין (30 יחידות). לדגור על השעיית באמבט מים ב 37 ° C עד מפתחת פתרון בהיר (כ -3 דקות). להוסיף 0.24 מ"ג / מ"ל ​​L-ציסטאין 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​DNAse ולנער בעדינות.
   הערה: לעיכול, כ 1 מ"ל של תמיסת אנזים הוא זקוק.
10. מסנן (0.22 מיקרומטר גודל נקבובי) להשיג 1 פתרון סטרילי מיליליטר לפני ההוספהאותו רקמת קליפת המוח. דגירת הצינורות למשך 30 דקות - 1 שעות ב 37 ° C (כלומר, בתוך אמבט _מים).
    הערה: שלבים 1.11 - 1.14 הן קריטיות ואמור להסתיים בתוך 15 דקות.
11. כדי לסיים את התגובה העיכול, להוסיף בינוני astrocyte מ"ל 1 ובזהירות triturate רקמת מתעכל בעזרת פיפטה 1 מ"ל. לקבלת טחינה דקה, בעדינות להזיז את הבוכנה פיפטה, ובכך aspirating ו לשיחול ההשעיה רקמת קליפת המוח.
12. לאחר הרקמה כבר ניתק לתוך ההשעיה תא בודד, מוסיפים 5 מ"ל astrocyte בינוני ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 216 x ז.
13. לשאוב supernatant בזהירות מן גלולה וכתוצאה ו resuspend התאים במדיום astrocyte 1 מ"ל.
14. מוסיפים את המתלים תא צלוחיות T75 מתחדש עם 9 בינוני astrocyte מ"ל (ראה 1.2).
15. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס בחממה בנוכחות נ נ 6% / CO _2. אחרי 4 ד, לבצע את השינוי הבינוני המלא הראשון (10 מ"ל). לאחר מכן, לשנות את המדיום תרבות כל 2 - 3 ד.
16. לאחר 7 ד, לבדוק אם התאים יצרו בשכבה ומחוברת. אם לא, לחכות עוד 2 - 3 ימים עד מפגש מלא של התרבות מושג.
    הערה: האסטרוציטים להציג גופי תא גדולים ושטוחים, למקם בתחתית הבקבוק ואינו מפתחי תהליכים תאיים בולטים. הם נבדלים מן ובתאים בהירים שלב בניגוד הקטנים microglia המתגוררים על גבי monolayer ^17.
17. על מנת להיפטר ובתאים ולקבל תרבות astrocyte טהור, למקם את צלוחיות T75 על שייקר מסלולית ולנער התרבויות O / N ב 250 סל"ד. ודא שהטמפרטורה מותאם ל -37 מעלות צלזיוס, שהמסנן של הבקבוק הוא חתום עם סרט במעבדה על מנת למנוע אידוי של CO _2.
18. למחרת, לשאוב את המדיום ולהוסיף בינוני תרבות טרי 10 מ"ל מתחדש עם 20 מיקרומטר ציטוזין-1-β-D-arabinofuranoside (AraC) כדי eliminaתאים המתחלקים שיורית te.
    הערה: דגירה עם AraC עבור 2 - 3 ד בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 6% CO ₂ תגרומנה תרבות astrocyte טהורה.
19. לפקח על טוהר התרבויות astrocyte ידי בדיקה ויזואלית תחת מיקרוסקופ אור. אם ובתאים בהירים שיורית שלב בניגוד ו microglia עדיין מתגוררים על גבי monolayer astrocytic ¹⁷ (ראה שלב 1.16), חזור על שלבי 1.18 ו 1.19.
    הערה: ומחוברות monolayers astrocyte טהור יכול להישמר לתקופה של עד 14 ד בחממה (37 ° C, 6% v / v CO ₂₎ לפני שתמשיך לשלב הבא. שנה וחצי של המדיום כל 3 ד. אל תאסוף, הקפאה להפשיר את האסטרוציטים, כמו תאים אלה יאבדו נכסים התומכים העצביים שלהם באמצעות הליך האחסון.

2. האסטרוציטים הכנות לקראת Coculture עקיף

הערה: 48 - 72 שעות לפני הכנת נוירונים, האסטרוציטים העברת celמוסיף l-תרבות. באופן כללי, בקבוקון T75 אחת מספק כמות מספקת של תאי לתמוך תרבויות העצביות שהושגו עם הכנה אחד.

1. מניחים כמה מוסיף כנדרש לתוך 24 גם צלחות. מעיל אחד להכניס את עם 10 מיקרוגרם / מ"ל PDL (מומס במים תא-תרבות-כיתה) במשך כ 1 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 6% v / v CO _2. לאחר הדגירה, לשטוף את הוסיף פעמים עם PBS. בינתיים, להמשיך עם הכנת האסטרוציטים.
   הערה: מוסיף מלא PBS יכול להישמר עד השעית תא astrocyte מוכנה לשימוש.
2. לשאוב את המדיום astrocyte (עם AraC) ולשטוף את זמן תרבות אחת עם 10 מ"ל PBS כדי לוודא שכל בסרום שיורית מוסר.
3. הוסף 3 מ"ל של 0.05% טריפסין- EDTA (חומצה Ethylenediaminetetraacetic) כדי צלוחיות דגירה תאים עבור trypsinization על 37 מעלות צלזיוס, 6% v / v CO ₂ למשך כ 10 דקות.
4. שליטת ניתוק התא על ידי בדיקה ויזואלית באמצעות מיקרוסקופ facilitate ניתוק של התאים על ידי הקשה על הצד של צלוחיות נגד שולחן העבודה.
   הערה: שלבי 2.5 - 2.8 הם קריטיים אמורים להסתיים תוך 15 - 20 דקות.
5. בעקבות trypsinization, בעדינות מחדש להשעות את התאים בינוני 7 מ"ל astrocyte ולהעביר את ההשעיה לתא צינור 15 מ"ל. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב g 216 x.
6. בזהירות לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה במדיום astrocyte 1 מ"ל.
7. ספירת התאים באמצעות תא ספירה.
8. מלא את התחתון של הבארות של 24 גם הצלחת עם מדיום astrocyte 500 μL ולהעביר 25,000 תאים במדיום astrocyte 500 μL לתוך כל כנס פרט. דגירת התרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 6% ₂ V / V CO.
   הערה: לאחר 42 - 72 שעות התרבויות תגענה כ 100% מפגש. בשלב זה טוהר התרבות ניתן לאמת על ידי immunocytochemistry ^11. תרבויות ומחוברות יכול להישמר לתקופה של עד 7 ד עד שתמשיךהצעד הבא. שנה וחצי של המדיום כל 3 ד.

3. הכנת נוירונים בהיפוקמפוס ראשי

הערה: נוירונים בהיפוקמפוס עכבר יסודי צריכים להיגזר E15.5 - עובר E16 של עכברות הרות מתוזמן.

1. הכן בינוני נוירון (ממ עם פירובט נתרן 10 מ"מ, 0.1% w / ovalbumin נ, 2 נ% / תוספת בינוני נ B27, ו גנטמיצין 0.1% v / v (לאחר סינון סטרילי)), ובינוניים הכנה (HBSS עם 0.6% w / גלוקוז נ ו HEPES 10mm (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine חומצה ethanesulfonic)). טרום חם מראש לאזן מדיום נוירון צלוחיות מסננות על 37 מעלות צלזיוס, 6% v / v CO _2.
2. מניחים את coverslips זכוכית (12 מ"מ קוטר) לתוך הבארות של 24-היטב צלחות (השתמש coverslips מיוחד, אשר מחורצים לשימוש עם מוסיף תרבית תאים).
   1. מעיל לפחות 1 שעות עם 15 מיקרוגרם / מ"ל ​​Poly-DL-ornithine במים (תא-תרבות-כיתה) על 37 מעלות צלזיוס. השתמש לפחות 500 μL לכל טוב על מנת להבטיח כיאת coverslips מכוסה לחלוטין. לשטוף את הבארות פעמים עם PBS. השאירו את PBS בבארות עד ציפוי התאים. ודא בארות שלא יתייבשו.
3. כדי לנתח את hippocampi, להכין מאכלים 3x 10 ס"מ מלאים בינוני הכנה 1x 2 צינור מ"ל עם 1 בינוני הכנה מ"ל. כן מספריים 2 מלקחיים בסדר.
4. להקריב את העכבר בהריון על ידי נקע בצוואר הרחם, לעקר את הבטן על ידי שטיפה עם אתנול 70% v / v, ולפתוח את הבטן באמצעות מספריים חדים. ובלו הרחם חרוז בזהירות במספריים ולהעביר את האיבר לתוך צלחת 1x 10 סנטימטרים מלאים בינוני הכנה.
5. בשלב הבא, להסיר את העוברים מן הרחם. בזהירות לחתוך את הרחם ולהסיר את amnion מבלי לפגוע עוברי באמצעות 2 מלקחיים. לאחר מכן, לערוף כל עובר עם זוג מספרי ולהעביר את הראש לתוך צלחת 10 סנטימטרים שני שמצורפת בינוני הכנה.
6. המשך עם הכנת הראשי (בדומה preparation תיאר 1.4 - 1.7).
   1. לשתק את הראש עם זוג מלקחיים לחתוך את גולגולת עור באזור הצוואר קרובה למוח האחורי, בניצב צירה העצבים. השתמש בזוג שני של מלקחיים להרים הן גולגולת עור מכסה, לכופף את כובע הגולגולת הרך לקראת הסוף המקורי של הראש, ובכך לחשוף את המוח.
   2. בעזרת 2 מלקחיים, לנתק את המוח מחלל הגולגולת. כדי לעשות זאת, קרוב 1 זוג מלקחיים ולהפריד את המוח מהגולגולת החל נורות חוש הריח ולנוע לכיוון למוח האחורי. אסוף את המוח בעוד צלחת 10 ס"מ מלאים בינוני הכנה.
7. לנתח את hippocampi מן moieties קליפת כמתואר לעיל לעריכת astrocyte (שלב 1.6). הסר את hippocampi מן האונה כל ולאסוף אותם בצינור 2 מ"ל מלאים בינוני הכנה.
8. לאחר שסיים את הנתיחה, להעביר את הצינור אל ספסל diges זרימה למינרית סטריליt הרקמה בהיפוקמפוס עם פתרון העיכול 1 מ"ל המכיל פפאין. הכן את הפתרון העיכול כמתואר בשלב 1.9 - 1.10, אבל להשתמש MEM במקום DMEM.
   הערה: שלבים 3.9 - 3.12 הן קריטיות ואמור להסתיים בתוך 10 - 15 דקות.
9. לאחר השלמת העיכול, בזהירות למשוך את פתרון העיכול על ידי שאיבה עדינה עם טפטפת.
10. שטפו את hippocampi 3 פעמים עם המדיום נוירון ידי הוספת ברצף ואילך בזהירות aspirating 1 בינוני תרבות טרי מ"ל לכל מחזור הכביסה. אל בצנטריפוגה השעית התא.
11. לאחר שלב הכביסה הסופי, בזהירות triturate רקמה במדיום נוירון 1 מיליליטר.
12. ספירת התאים באמצעות תא ספירת צלחת 35,000 תאי 500 בינוני נוירון μL לכל באר יחיד של 24 גם צלחת (צלחת מוזכרים 3.2).
    הערה: לחלופין, aliquot תא ניתן counterstained עם trypan כחול כדי להעריך את החיוניות של הכנת התא. שליטת צפיפות הציפוי ידי ויזואלית לבדוקיון באמצעות מיקרוסקופ (בדרך כלל 90 - 110 תאים לכל שדה ראייה של מטרת 10X סטנדרטית).
13. מקום נוירונים בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 6% v / v CO ₂ עבור H 1.
14. פרסם הדגירה, לקחת מחדיר מוכן (זורעים עם monolayers astrocyte ומחוברות) מתוך האינקובטור (ראה שלב 2.8). חילופי הבינוני ידי aspirating מדיום astrocyte והחלפתו 500 μl הבינוני נוירון טרי.
    הערה: מוסיף צריכה נמל monolayers astrocyte ומחובר לאחר 2 - 3 DIV (ימים במבחנה).
15. מניח את מוסיף עם האסטרוציטים בזהירות לתוך הבארות המכילות את תרבויות נוירון (שלב 3.13) באמצעות מלקחיים סטרילית.
16. מניח את coculture נוירון astrocyte העקיף הנובע בחזרה לתוך החממה ב 37 מעלות צלזיוס, 6% נ נ / CO _2.
    הערה: בתנאים אלה, נוירונים יכול להיות מתורבת עבור עד 4 שבועות לחלוטין מוגדר בינוני. אין שינוי המדיום הוא הכרחי. עבור תרבויות לטווח זמן, מומלץ למלא דוארבארות mpty עם מים סטריליים על מנת להפחית את האידוי של צלחת 24 גם.
17. בצע במבחנה תא מנתח לאחר הרצוי תקופות תרבות (למשל, עבור immunocytochemistry, PCR, כתם המערבי, הקלטות אלקטרו (מהדק תיקון או מערך multielectrode)) ^7,15,18.
    הערה: מערכת התרבות מתאימה גם לטיפול תרופתי אקוטי וכרוני של התרבויות ^11.

תוצאות

הניתוח של התרבויות העצביות באמצעות מערכת coculture העקיפה מגוון וניתן לבצעו בשלבים שונים של התבגרות התרבות. בשל העובדה כי התאים יכולים להישמר לתקופה של עד 4 שבועות, חקירות ארוכות טווח של התרבויות אפשריות.

Discussion

המטרה העיקרית של הפרוטוקול הנוכחי היא תרבויות עצביות ו astrocytic נפרדים לחלוטין, תוך שמירה על אותם במדיום משותף. מסיבה זו, את הטוהר של תרבויות המתקבל צריך להיות מאומת בתחילת ההליך. אנו ממליצים על שימוש של טובולין נוירון ספציפי, neurofilaments או חלבון NeuN כמו סמנים עצביים, GFAP כסמ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
B27	Gibco (Life Technologies)	17504-044
Cell-culture-grade water	MilliQ
Cytosine-β-D-arabinofuranoside (AraC)	Sigma-Aldrich	C1768	CAUTION: H317, H361
DMEM	Gibco (Life Technologies)	41966-029
DNAse	Worthington	LS002007
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1397	CAUTION: H317-334
Glucose	Serva	22700
HBSS	Gibco (Life Technologies)	14170-088
HEPES	Gibco (Life Technologies)	15630-056
Horse serum	Biochrom AG	S9135
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C-2529
MEM	Gibco (Life Technologies)	31095-029
Ovalbumin	Sigma-Aldrich	A7641	CAUTION: H334
Papain	Worthington	3126
PBS	self-made
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P0899
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P3655
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636
Trypsin-EDTA	Gibco (Life Technologies)	25300054
Equipment
24-well-plates	Thermoscientific/Nunc	142475
24-wells-plate (for the  indirect co-culture)	BD Falcon	353504
Binocular	Leica	MZ6
Cell-culture inserts	BD Falcon	353095
Centrifuge	Heraeus	Multifuge 3S-R
Counting Chamber	Marienfeld	650010
Forceps	FST Dumont (#5)	11254-20
glass cover slips (12 mm)	Carl Roth (Menzel- Gläser)	P231.1
Incubator	Thermo Scientific	Heracell 240i
Micro-tube (2 mL)	Sarstedt	72,691
Microscope	Leica	DMIL
Millex Syringe-driven filter unit	Millipore	SLGV013SL
Orbital shaker	New Brunswick Scientific	Innova 4000
Parafilm	Bemis	PM-996
Petri dishes (10 cm)	Sarstedt	833,902
pipette (1 mL)	Gilson	Pipetman 1000
Sterile work bench	The Baker Company	Laminar Flow SterilGARD III
Surgical scissors	FST Dumont	14094-11
Syringe	Henry Schein	9003016
T75 flask	Sarstedt	833,911,002
tube (15 mL)	Sarstedt	64,554,502
Water bath	GFL	Water bath type 1004