간접 신경-성상 세포 공동 배양 분석 일 :<em&gt; 체외</em&gt; 신경 세포 - glia 상호 작용의 상세한 조사를위한 셋업

요약

이 프로토콜은 신경 세포 - glia의 상호 작용의 실형 분석을위한 간접적 인 신경 세포 성상 세포의 공 배양을 설명합니다.

초록

적절한 신경 개발 및 기능은 개발 및 성인 뇌의 전제 조건입니다. 그러나, 복잡한 신경 네트워크의 고도의 제어 형성과 유지 관리의 기초가되는 메커니즘은 완전히 지금까지 이해되지 않습니다. 건강과 질병에서 신경 세포에 관한 개방형 질문은 인간과 관련된 병리, 예를 들어, 알츠하이머 병 및 정신 분열증 조사에 기본 개발을 이해에서 다양하고 도달한다. 뉴런의 가장 상세한 분석은 시험 관내에서 수행 될 수있다. 그러나 신경 세포를 요구하고 장기적인 생존을위한 성상 교세포의 추가 지원이 필요합니다. 이 세포의 이질성은 신경 세포와 성상 세포의 분석을 해부하는 목표와 충돌합니다. 물리적 인하면서, 여기에 동일한 화학적 한정 배지를 공유 순수한 차 뉴런 및 성상 세포의 장기간 동시 배양 허용 세포 배양 분석을 제시분리. 이 설정에서, 문화는 최대 4 주 동안 생존 분석은 신경 세포 - glia의 상호 작용에 관한 연구의 다양성에 적합하다.

서문

지난 수십 년 동안, 신경 교세포 기능의 일반적인 해석은 신경 기능 ^(1)에 관한 적극적인 규제 역할 향해 단순히 지원의 속성에서 진화했다. 때문에 건강과 ^질병이 뇌의 항상성에 자신의 눈에 띄는 영향으로, 성상 세포는 과학계에 대한 특별한 관심이 있습니다. 지난 몇 년 동안, 연구는 다양한 생체 내 및 생체 외 ³ 뉴런 - 아교 세포의 상호 작용에 초점을 맞추고있다. 그러나, 배양 시스템의 대부분은 두 종류의 세포 분리 및 분석을 위해 해당 secretomes으로 허용되지 않는다.

몇몇 접근 방식이 오래 지속 생존과 관련된 신경 생리 네트워크 ^개발을 달성하기 위해 ^4-6 뉴런 및 아교 세포의 직접 동시 배양을 이용한다. 물리적으로 분리 된 두 ⁷ 세포 형태를 유지하면서, 본 프로토콜은 동일한 목표에 도달한다. conditione에 비해D 매체는 우리의 시스템은 신경 세포와 성상 세포 사이의 양방향 통신을 연구 할 수 있습니다, ^8,9 접근한다. 세포를 상기 공유 매체에 성숙하다 동안 분비 신호 분자의 발현을 모니터링 할 수있다. 성상 교세포함으로써 신경 세포의 성장을 조절, 같은 사이토 카인, 성장 인자 및 세포 외 기질 분자 ^{10, 11} 등의 수용성 요소를 해제하고 ^7,12을 기능으로이 기회, 특히 관련이있다. 따라서, 시험 관내에서 망막 신경절 세포 트롬의 첨가가 시냅스 ^(13)의 형성을 유도하는 것으로 입증되었다. 그러나, 다른 아직 알려지지 않은 요소 ⁽¹³⁾ 기능 시냅스를 렌더링하는 데 필요한. 또한, 성상 세포에 의해 방출 분자는 신경 아교 세포 - 상호 작용에 기초를 이해하기 위해 식별되어야한다.

마우스와 래트 차 뉴런 및 성상 세포의 배양은 ^14-16 앞서 설명되었다. 여기에 우리간접 공 배양 방법에서 두 종류의 세포를 결합 우아하고 다양한 도구를 제시한다. 두 문화가 아직 실제로 동일한 매체, 뉴런, 아스트로 사이트 및 수용성 분자의 영향을 공유 분리되어 있기 때문에, 이와 별도로 뉴런 신경교 상호 작용의 연구를위한 강력한 도구를 만드는, 분석 될 수있다.

프로토콜

쥐 실험 동물 사육의 신경 과학 지침에 대한 독일의 법률과 독일의 사회에 따라했다. 루르 - 대학 보훔의 동물 관리 및 사용위원회는 적절한 허가를 부여했다.

1. 준비 및 두피 성상의 재배

참고 : 뉴런이 준비되기 전에 성상 세포 배양이 합류 단층으로 개발해야로서, 다음 단계로 진행하기 전에 프로토콜 적어도 7 일 이내의 다음 단계를 완료합니다. 차 성상 세포는 출생 후 하루 (P) 0-3 주위에 마우스 새끼에서 얻은 혼합 폐해 문화에서 파생됩니다. T75 플라스크 당 세 뇌 (피질 6)이 사용되어야한다.

1. 무균 조건에서 10 %의 v / V 말 혈청과 0.1 % V / V의 겐타 마이신으로 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM)을 보완하여 성상 세포 매체를 준비합니다. 최대 2 주 동안 4 ° C에서 매체를 저장합니다.
2. 코트 배 T75은 위스콘신 플라스크6 % V / V의 CO _2의 존재하에 37 ℃에서 적어도 1 시간 동안 (세포 배양 등급의 물 PDL) 10 μg의 / ㎖ 폴리 D 라이신 번째. 도포 후, 결합되지 않은 양이온을 제거하고, 9 ㎖의 성상 세포의 배지를 추가하는 인산염 완충 식염수 (PBS)로 두 번 플라스크를 세척 하였다.
3. 뇌의 준비를 위해, (에 관계없이 사용되는 뇌의 수) 10 ㎖ 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)을 15 mL의 튜브를 1 배인 10cm 페트리 접시 1 ㎖의 HBSS를 1 배에 추가. 수술 가위,이 미세 집게 한 쌍 및 절차 범위 내에서 쌍안경을 유지합니다.
4. 수술 가위로 빠르게 3 새끼 목을 벨과 빈 10cm 접시에 머리를 수집합니다.
   1. 양안에서 피질의 준비를 수행합니다. 이 미세 집게를 사용하여 눈의 수준으로 목부터 시작하여 중간 선에서 두개골의 지느러미 피부를 제거합니다. 그 후, 그 혈관과 뇌는 두개골에서 볼 수 있습니다.
   2. 포셉 쌍 입쪽 끝에 헤드를 고정하고 후방 단부에서 시작 두개골의 정중선을 절개. 이어서, 뇌를 노출 오른쪽 두개골의 왼쪽 절반을 클립.
   3. 포셉의 끝을 닫고 뇌에서 복부를 놓습니다. 두개골에서 뇌를 들어 올려 HBSS 가득 10cm 페트리 접시로 전송합니다. 모든 뇌는 접시에 수집 될 때까지 남아있는 시료와 동일한 방식으로 진행.
5. 뇌를 수집 한 후, 가위 등 포셉 한 쌍을 사용하여 후뇌을 곤란에 의한 피질의 분리로 시작합니다. 포셉 한 쌍의 두 반구 사이의 중간 선 절개를 수행합니다. 조심스럽게 집게로 뇌를 수정하고 중뇌을 차단하고, 두 번째 집게를 사용 후각 전구는 대뇌 피질의 절반으로 끝낼 수 있습니다.
6. 포셉 한 쌍의 하나 대뇌 피질의 절반을 해결와 F를 분리하여 반구의 수막을 벗겨측면 가장자리 ROM이어서 제 집게를 사용하여 피질 표면을 당기는.
7. 접시를 향해 아래로 향한 표면과 대뇌 피질의 절반 플립; 신중하게 해부 포셉 한 쌍을 사용하여 초승달 모양의 해마를 제거합니다. 개인 피질을 수행하는 하나의 닫힌 집게를 사용하여 원뿔 15 ML의 튜브에 단일 피질을 전송합니다.
8. 멸균 층류 후드에 모든 피질, 대중 교통을 수집하고 대뇌 피질 조직의 분리를위한 준비를 시작 후.
9. 2 mL의 반응 관에 1 mL의 DMEM을 추가 및 v 파파인 (30 대) 승 / 0.1 %를 추가합니다. 정화 된 용액 (3 분)을 나타낼 때까지 37 ℃의 수조에서 현탁액을 부화. 0.24 ㎎ / ㎖의 L 시스테인 20 μg의 / mL의 DNase를 추가하고 부드럽게 흔들어.
   주 : 소화 효소 용액을 대략 1 mL의 필요하다.
10. 추가하기 전에 1 mL의 멸균 용액을 얻었다 필터 (0.22 ㎛의 공극 크기)그것은 대뇌 피질의 조직. (수욕, IE) 37 ° C에서 1 시간 - 30 분 동안 튜브를 _부화.
    주 : 1.11 단계 - 1.14가 중요하며 15 분 이내에 완료해야합니다.
11. 소화 반응을 종료하려면, 1 ML의 성상 세포 매체를 추가하고 신중 1 ML의 피펫을 사용하여 소화 조직을 씹다. 분쇄를 들어, 부드럽게하여 흡입 및 대뇌 피질의 조직 현탁액을 압출, 피펫 플런저를 이동합니다.
12. 조직을 단일 세포 현탁액 내로 해리되면, 216 x g에서 5 분 동안 5 ㎖의 성상 매체 원심 분리기를 추가.
13. 그 결과 펠렛에서 조심스럽게 뜨는을 대기음 1 ML의 성상 세포 배지에서 세포를 재현 탁.
14. 9 ML의 성상 세포 배지 (1.2 참조) 보충 T75 플라스크에 세포 현탁액을 추가합니다.
15. 6 % V / V의 CO ₂ 존재 하에서 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포를 인큐베이션. 4 D 후 (최초 완전 배지 변경을 수행10 ㎖). 3 일 - 그 후, 배지마다 2를 변경합니다.
16. 세포가 합류 단층을 형성 한 경우 7 일 이내 후 확인합니다. 문화의 완전한 합류가 달성 될 때까지 삼일 -하지 않으면, 또 다른 2 기다립니다.
    참고 : 성상 큰 평평한 세포 기관을 표시는 플라스크의 바닥에 지역화 및 주목할만한 세포 과정을 개발하지 않습니다. 이들은 단일 층 ^(17)의 상부에있는 작은 위상차 밝은 전구 세포 및 미세 아교 다르다.
17. 위해서는 전구 세포 없애과 순수 성상 세포 배양을 구 궤도 통에 T75 플라스크를 배치하고 250 rpm에서 문화 O / N를 흔들 수 있습니다. 온도를 37 ℃로하고, 플라스크의 필터가 CO _(2)의 증발을 방지하기 위해 실험실 필름으로 밀봉되도록 조정되는 것을 _{보장한다.}
18. 다음 날, elimina 20 μM 사이토 신-1-β-D-아라 비노 푸라 노 시드 (AraC)와 보충 10 mL의 신선한 문화 매체를 매체를 대기음 및 추가테 잔류 분할 세포.
    참고 : 2 AraC와 배양 - 37 ° C에서 인큐베이터에서 3 일이 6 % CO _2는 순수 성상 세포 배양에 발생합니다.
19. 광 현미경으로 육안 검사에 의한 성상 세포 배양의 순도를 모니터링합니다. 잔여 위상 대비 밝은 전구 세포 및 미세 아교 세포는 여전히 성상 세포 단일 층 ^(17)의 상단에있는 경우, 반복 1.18 및 1.19 단계 (단계 1.16 참조).
    참고 : 융합과 순수한 성상 세포 단일 층은 다음 단계로 진행하기 전에 인큐베이터에서 최대 14 일 (37 ° C, 6 % V / V의 CO _2)를 위해 유지 될 수있다. 매체의 반마다 3 일을 변경합니다. 이러한 세포가 저장 프로 시저를 통해 연결을 지원 특성을 잃게됩니다로서, 수집, 동결 및 성상 세포를 해동하지 마십시오.

간접 공동 배양 2. 준비 성상

참고 : 48-72 시간을 CEL에 신경 전달 성상을 준비하기 전에1- 문화 삽입. 일반적으로, 하나의 T75 플라스크에 제조 한 얻은 신경 세포 배양을 지원하기 위해 셀의 충분한 수를 제공한다.

1. 24 웰 플레이트에 필요한만큼의 삽입을 놓습니다. 코트 37 ° C에서 약 1 시간 10 μg의 / mL의 PDL (세포 배양 등급의 물에 용해)와 각 삽입, 6 % V / V의 CO _2. 배양 한 후, PBS로 두 번 삽입을 씻는다. 한편, 성상 세포의 준비를 진행합니다.
   참고 : 성상 세포의 세포 현탁액 사용할 준비가 될 때까지 PBS로 가득 인서트가 유지 될 수있다.
2. (AraC 포함) 성상 세포 매체를 기음과 잔여 혈청을 제거하기 위해 10 mL의 PBS와 문화를 한 번 씻는다.
3. 플라스크에 0.05 % 트립신 EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산) 3 mL를 넣고 약 10 분 동안 37 ° C, 6 % V / V의 CO _2에서 트립신의 세포를 배양한다.
4. 현미경 및 facilita를 사용하여 육안 검사에 의한 세포 분리를 제어바탕 화면에 대한 플라스크의 측면을 눌러 세포의 분리를 테.
   참고 : 2.5 단계 - 2.8이 중요한 15 내에 완료되어야한다 - 20 분.
5. 트립신 처리 후, 부드럽게 7 ML의 성상 세포 배지에서 세포를 다시 정지하고 15 ㎖의 튜브에 세포 현탁액을 전송. 216 X g에서 5 분 동안 원심 분리기.
6. 조심스럽게 뜨는을 대기음 1 ML의 성상 세포 배지에서 세포 펠렛을 resuspend.
7. 카운팅 챔버를 사용하여 세포를 카운트.
8. 500 μL의 성상 세포 배지로 24 웰 플레이트의 웰의 바닥을 채우고 각 인서트에 500 μL의 성상 세포 배지에서 25,000 세포를 옮긴다. 37 ° C, 6 % V / V의 CO _2의 문화를 품어.
   참고 : 42 후 - 72 시간 배양은 약 100 %의 합류에 도달합니다. 이 단계에서 배양액의 순도는 ¹¹ 면역 세포에 의해 확인 될 수있다. 합류 배양이 진행까지 7 일 동안 유지 될 수있다다음 단계. 매체의 반마다 3 일을 변경합니다.

차 해마 신경 세포의 3. 준비

참고 : 기본 마우스 해마의 신경 세포가 E15.5에서 유래한다 - 시간 초과 임신 쥐의 E16 배아.

1. / w 0.6 %와 신경 세포 배지 (10 mM의 피루브산 나트륨과 MEM, w 0.1 % / V의 난백 알부민, 2 % V / V의 B27 매체 보충, 0.1 % V / V의 겐타 마이신 (멸균 여과)), 및 준비 매체 (HBSS를 준비 V 포도당과의 10mM HEPES (4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산)). 사전 따뜻한 사전 평형 37 ° C, 6 % V / V의 CO _2에서 필터 플라스크에 신경 매체를.
2. 24- 웰 플레이트의 웰에 유리 커버 슬립 (12mm 직경) 위 (세포 배양 인서트와 함께 사용하기 위해 절결 된 특수 커버 슬립을 사용).
   1. 37 ° C에서 물 (세포 배양 등급) 15 μg의 / mL의 폴리 DL-오르니 틴 적어도 1 시간 동안 코트. 을 보장하기 위하여 잘 당 최소 500 μL를 사용하여커버 슬립이 완전히 덮여있다. PBS로 두 번 우물을 씻으십시오. 세포를 도금 할 때까지 우물에서 PBS를 남겨주세요. 우물이 건조하지 않도록해야합니다.
3. 해마를 해부하기 위해 준비 매체 가득 배 10cm 요리와 1 mL를 준비 매체와 1X 2 mL의 튜브를 준비합니다. 위 및 2 미세 집게를 준비합니다.
4. 자궁 전위에 의해 임신 한 마우스를 희생 70 % v / V를 에탄올로 세척하여 복부를 소독하고 날카로운 가위를 사용하여 복부를 엽니 다. 가위로 조심스럽게 페르시 자궁을 절제하고 준비 매체 가득 1X 10cm 접시에 오르간을 전송합니다.
5. 다음으로, 자궁에서 태아를 제거합니다. 조심스럽게 자궁을 절개하고 2 집게를 사용하여 배아를 해치지 않고 양막을 제거합니다. 그 후, 가위 각 배아 목을 벨과 준비 매체와 함께 제공되는 두 번째 10cm 접시에 머리를 전송합니다.
6. 위해 준비 할 유사한 헤드의 준비 (진행합니다1.7) - ATION 1.4에 설명.
   1. 포셉 쌍 헤드를 고정하고 neuraxis 직교 후뇌에 가까운 목 영역의 두개골과 피부를 절개. 하여 뇌를 노출, 두개골과 취재 피부를 모두 들어 올린 머리의 주동이의 끝을 향해 부드러운 두개골 캡이 구부러 집게의 두 번째 쌍을 사용합니다.
   2. 이 집게의 도움으로, 두개골 캐비티에서 뇌를 분리합니다. 이 포셉, 1 닫기 쌍을하고 후각 전구에서 시작하여 후뇌으로 이동 두개골에서 뇌를 구분합니다. 준비 매체 가득 다른 10cm 접시에 두뇌를 수집합니다.
7. 성상 세포의 제조 (단계 1.6)에 대해 상술 한 바와 같이 피질 부분에서 해마를 해부하다. 각 반구에서 해마를 제거하고 준비 매체 가득 2 ㎖의 튜브를 수집합니다.
8. 절개를 완료 한 후, 멸균 층류 벤치 diges로 전송 튜브1 ㎖의 분해 용액을 함유하는 파파인과 해마 조직에서 t. 단계 1.9에 기재된 바와 같이 소화 용액을 조제 - 1.10 있지만 MEM 대신 DMEM을 사용한다.
   참고 : 3.9 단계 - 3.12이 중요한 10 이내에 완료되어야한다 - 15 분.
9. 분해 종료 후, 조심스럽게 피펫으로 부드러운 흡입하여 소화 용액을 철회.
10. 순차적으로 추가 한 후 조심스럽게 세척 사이클 당 1 mL의 신선한 배지를 흡입하여 해마에게 신경 매체를 3 회 반복한다. 세포 현탁액을 원심 분리하지 마십시오.
11. 최종 세척 단계 후, 조심스럽게 1 mL의 뉴런 배지에서 조직을 씹다.
12. 카운팅 챔버를 사용하여 세포를 세어 24 웰 플레이트 (3.2에서 언급 한 판)의 단일 웰 당 500 μL 뉴런 배지에 35,000 세포 접시.
    참고 : 선택적으로, 셀 나누어지는이 셀 준비의 활력을 평가하기 위해 트리 판 블루와 대조 할 수 있습니다. 시각적 검사에 의해 도금 밀도 제어(- 표준 10 배 대물 렌즈의 시야 당 110 셀 일반적으로 90) 이온 현미경을 사용.
13. 37 ° C, 1 시간 동안 6 % V / V의 CO _2에서 인큐베이터에 넣어 뉴런.
14. , 배양을 게시 준비된 삽입을 인큐베이터 중 (합류 성상 세포 단일 층으로 시드) (단계 2.8 참조). 성상 세포의 배지를 흡인하고 500 ㎕의 신선한 뉴런 배지로 교체하여 배지를 교환한다.
    참고 : 삽입 2 이후에 합류 성상 세포 단일 층 항구한다 - 3 DIV (체외에서 일).
15. 신중하게 멸균 집게를 사용하여 신경 세포 문화 (3.13 단계)에 포함 된 우물에 성상 세포로 삽입을 놓습니다.
16. 37 ° C, 6 % V / V의 CO _2에서 다시 인큐베이터로 인해 발생하는 간접적 신경 세포 성상 세포의 공 배양을 놓습니다.
    주 : 이러한 조건 하에서, 뉴런 완전히 한정 배지에서 4 주 동안 배양 될 수있다. 어떤 매체 변화는 필요하지 않습니다. 장기간 배양 들어, 예를 채우기 위해 권장24 웰 플레이트에서 증발을 감소시키기 위해 멸균 물 mpty 웰.
17. 수행 체외 세포 분석 후 배양 기간을 원하는 (예를 들어, 면역 세포, PCR, 웨스턴 블롯, 전기 생리 녹음 (패치 클램프 또는 다중 전극 배열)에 대한) ^7,15,18.
    주 : 배양 시스템은 배양액 ^(11)의 급성 및 만성적 인 약물 치료에 적합하다.

결과

간접 공 배양 시스템을 통해 신경 배양 분석은 여러 가지이며, 배양 성숙의 다른 단계에서 수행 될 수있다. 인해 세포가 4 주 동안 유지 될 수 있다는 사실로 인해, 배양 장기간 조사도 가능하다.

그림 1의 중간 왼쪽 패널의 회로도는 공동 배양 설정을 보여줍니다. 성상 세포 단층 (좌측 상단 패널) 및 신경 네트워크...

토론

공유 매체에 그들을 유지하면서 현재 프로토콜의 주요 목표는 완전히 별도의 연결 및 성상 세포 배양 물이다. 이 때문에, 얻어지는 배양액의 순도는 절차의 시작 부분에서 검증되어야한다. 우리는 신경 세포 마커로서 신경 세포 고유의 튜 불린, neurofilaments 또는 NeuN 단백질의 사용을 권장, GFAP는 성상 세포 마커로, 희소 돌기 아교 세포 전구체 마커 Iba1 단백질로 O4 항원은 미세 아교 세포를 식별합?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
B27	Gibco (Life Technologies)	17504-044
Cell-culture-grade water	MilliQ
Cytosine-β-D-arabinofuranoside (AraC)	Sigma-Aldrich	C1768	CAUTION: H317, H361
DMEM	Gibco (Life Technologies)	41966-029
DNAse	Worthington	LS002007
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1397	CAUTION: H317-334
Glucose	Serva	22700
HBSS	Gibco (Life Technologies)	14170-088
HEPES	Gibco (Life Technologies)	15630-056
Horse serum	Biochrom AG	S9135
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C-2529
MEM	Gibco (Life Technologies)	31095-029
Ovalbumin	Sigma-Aldrich	A7641	CAUTION: H334
Papain	Worthington	3126
PBS	self-made
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P0899
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P3655
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636
Trypsin-EDTA	Gibco (Life Technologies)	25300054
Equipment
24-well-plates	Thermoscientific/Nunc	142475
24-wells-plate (for the  indirect co-culture)	BD Falcon	353504
Binocular	Leica	MZ6
Cell-culture inserts	BD Falcon	353095
Centrifuge	Heraeus	Multifuge 3S-R
Counting Chamber	Marienfeld	650010
Forceps	FST Dumont (#5)	11254-20
glass cover slips (12 mm)	Carl Roth (Menzel- Gläser)	P231.1
Incubator	Thermo Scientific	Heracell 240i
Micro-tube (2 mL)	Sarstedt	72,691
Microscope	Leica	DMIL
Millex Syringe-driven filter unit	Millipore	SLGV013SL
Orbital shaker	New Brunswick Scientific	Innova 4000
Parafilm	Bemis	PM-996
Petri dishes (10 cm)	Sarstedt	833,902
pipette (1 mL)	Gilson	Pipetman 1000
Sterile work bench	The Baker Company	Laminar Flow SterilGARD III
Surgical scissors	FST Dumont	14094-11
Syringe	Henry Schein	9003016
T75 flask	Sarstedt	833,911,002
tube (15 mL)	Sarstedt	64,554,502
Water bath	GFL	Water bath type 1004