Generación de anticuerpos monoclonales murino por el hibridoma Tecnología

Resumen

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

Resumen

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

Introducción

La tecnología de hibridomas se presenta en este protocolo fue descrito por primera vez por Köhler y Milstein ¹ en 1975 y, a excepción de algunas mejoras técnicas, el procedimiento principal no ha cambiado drásticamente durante los últimos 40 años ^2. El objetivo de este protocolo es para explicar una estrategia más apropiada inmunización, un método estándar para la generación de anticuerpos monoclonales, y un ejemplo de un método de validación (ELISA).

Los anticuerpos son herramientas increíbles y contribuyen a una amplia gama de enfoques tecnológicos, tales como citometría de flujo, clasificación de células magnético, o de inmunofluorescencia, así como a las opciones diagnósticas y terapéuticas para el seguimiento y tratamiento ³ enfermedad. La disponibilidad comercial de anticuerpos monoclonales para los objetivos deseados se demuestra por la presencia de más de 24 diferentes bases de datos web con casi innumerables cantidades de anticuerpos o productos relacionados con anticuerpos ^4. En 2015, unantibody moléculas eran parte de una discusión internacional ^5-7 debido a serios problemas en la validación y caracterización de anticuerpos disponibles comercialmente correcta.

Puede ser difícil y costoso para encontrar anticuerpos específicos para un antígeno específico, y, a menudo, no tienen la afinidad o especificidad necesaria. A pesar de generar un anticuerpo es todavía mucho tiempo y requiere de personal capacitado para desarrollar y validar el anticuerpo, que produce un anticuerpo individualmente puedan mejor que comprar uno.

Debido al hecho de que la producción de anticuerpos es mucho tiempo y requiere experiencia, se han desarrollado métodos alternativos para la producción de moléculas de unión para superar estos problemas. El método alternativo más comúnmente utilizada es la producción recombinante de anticuerpos de cadena única a través de presentación en fagos. Los genes de la región variable de unión se extraen de las células y se combinan con la proteína de revestimiento de un fago. los scadena ingle se expresa entonces en la superficie de un bacteriófago y se tamiza en varios pasos paneo ^8. La producción de anticuerpos de cadena única es un poco más rápido, pero también requiere un experimentador experto. Las desventajas de algunos anticuerpos de cadena simple recombinantes son una mala estabilidad y una falta de idoneidad para el diagnóstico in vitro. En la mayoría de las pruebas de diagnóstico, un Fc-receptor para la detección es necesario, que debe ser añadido a un anticuerpo de cadena sencilla recombinante después. De nuevo, esto es mucho tiempo y es aún más compleja que la técnica de hibridoma. En el diagnóstico in vitro, los anticuerpos monoclonales de ratón de longitud completa y de conejo se han demostrado ser la mejor opción.

Uno de los pasos más importantes en la generación de anticuerpos monoclonales se debe hacer antes de que el trabajo en el laboratorio a partir: el diseño del inmunoconjugado. Las preguntas que deben abordarse son: ¿Cuál es la composición física del objetivo en el último applicationes, y cuyas matrices están presentes? Cuya concentración será el objetivo de tener en la aplicación? ¿Cuál es la aplicación final, y cuáles son los requisitos que debe cumplir el anticuerpo?

Siempre tener en cuenta que si se utiliza un fragmento de péptido lineal, sino que también tiene que ser lineal en el epítopo final en la diana de elección; de lo contrario, el anticuerpo no se unirá. Por supuesto, independiente del método de selección, los anticuerpos podrían ser seleccionados para reconocer diferentes formatos antigénicos en diferentes aplicaciones, pero esto deben ser validados con mucha precisión. Estas son las razones por las cuales el desarrollo de anticuerpos y la validación son tales procesos ambiciosos.

La elección del formato antigénico para la inmunización es fundamental para el desarrollo de anticuerpos y determina el éxito o el fracaso de este proceso. Una vez que los ratones expresan un título de anticuerpos relevantes, se aíslan las células del bazo y se fusionan con células de mieloma. Las líneas celulares de mieloma más comunes parael desarrollo de anticuerpos monoclonales murinos son X63-Ag 8.653 ⁹ y Sp2 / 0-Ag 14 ¹⁰ de un / c cepa de ratón Balb. Las células descienden de un linfoma de células B malignas y se seleccionaron debido a que no secretan cualquiera de sus propias cadenas pesadas o ligeras. Las células pueden adaptarse a una relación de entre 1:10 y 10: 1 (esplenocitos frente a las células de mieloma). En este protocolo, las células se adaptan a una proporción de 3: 1 y se fusionan por polietilenglicol (PEG) y electrofusión, de acuerdo con Stoicheva y Hui ^11.

La fusión de las células B y las células de mieloma es un proceso aleatorio. Por lo tanto, los híbridos de dos B linfocitos o dos células de mieloma se podrían generar, pero los híbridos que no serían capaces de sobrevivir durante un largo tiempo en cultivo. Las células se someten a una selección de hipoxantina, aminopterina, y timidina (HAT), mediante el cual sólo las células de hibridoma fusionadas pueden sobrevivir debido a la posibilidad de utilizar la vía de novo de la síntesis de pirimidina. Para la generación de lunoclonal anticuerpos, es necesario obtener una línea celular procedente de una célula madre. El monoclonalidad se garantiza mediante la limitación de las técnicas de dilución y el análisis microscópico de crecimiento celular. Los sobrenadantes del cultivo de hibridoma se criban para la producción de anticuerpos específicos, principalmente por ELISA o citometría de flujo, y los mejores aglutinantes se seleccionan. Después de la cultura de masas y la purificación, la molécula de anticuerpo, finalmente, se puede caracterizar y validado para la aplicación deseada.

Protocolo

Balb / c o ratones NMRI (Mus musculus) de nuestra colonia de cría de la Universidad de Potsdam (Potsdam, Alemania) se utilizaron para la producción de anticuerpos monoclonales. El trabajo con animales se llevó a cabo de acuerdo con las directrices nacionales e internacionales pertinentes. El estudio fue aprobado por el Ministerio de Medio Ambiente Brandenburg, salud y protección del consumidor (número de referencia V3-2347-A16-4-2012).

1. Preparación de inmunoconjugados

1. Para el acoplamiento del antígeno a un vehículo, utilizar los protocolos estándar de acoplamiento a través de amino-, carboxi, sulfo o grupos, tales como por glutaraldehído, N - (3-dimetilaminopropil) - N etilcarbodiimida (EDC), o N - [y-maleimidobutiriloxi éster succinimida] (sulfo-GMBS).
2. Para el acoplamiento (por ejemplo, con glutaraldehído) ^13, utilizar la proteína diana o péptido y el portador (ovoalbúmina, albúmina de suero bovino, o hemocianina de lapa de ojo de cerradura) en una proporción de 1: 1. Se diluye el objetivo prOtein o péptido en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y la proteína portadora en NaHCO mM tampón ₃ 50. Adaptar el volumen y la concentración de la cantidad necesaria para las inmunizaciones.
   1. Mezclar las dos soluciones y añadir 1,25% de glutaraldehído. Mezclar e incubar la muestra durante 4 h a temperatura ambiente (RT). Para seleccionar las células de hibridoma, que el mismo inmunoconjugado, pero con otro vehículo, a fin de evitar la selección de ligantes portadores inespecíficos.
3. Se dializa la muestra de acoplamiento mediante la realización de una diálisis rápida con resina comercial grueso (por ejemplo, Sephadex G25).
   1. Perforar el fondo de un vial de reacción de 1,5 ml con una aguja hueca y colocarlo en un tubo de 15 ml. Poner la lana de vidrio en la parte inferior para el sellado y se cubre con 300 mg de resina gruesa (hasta la marca de calibración de 0,5 ml).
   2. Con cuidado, ponga 1 ml de PBS gota a gota en un tubo de reacción de 1,5 ml y asegúrese de que la lana de vidrio todavía está sellando la perforación. Dejar que la resina s gruesabien y se centrifuga la columna a 500 xg durante 2 min. Un tal columna se puede utilizar para dializar 200 l de la muestra de acoplamiento. Para volúmenes mayores, hacer más columnas.
   3. Cambiar el tubo y dejar caer la solución de acoplamiento sobre la resina gruesa hinchado. Centrifugar de nuevo a 500 xg durante 2 min. Retire el eluyente desde el tubo y lo utilizan para la inmunización.

2. Inmunización de Animales

1. Elija ratones dos o tres de 6 a 12 semanas de edad Balb / c para la inmunización.
2. Para un animal, preparar 150 - 200 mg del inmunoconjugado en 200 l de PBS y se mezcla con 100 l de adyuvante completo Freund's (CFA). Mezclar la solución 3 veces con una aguja corta y delgada (0,6 mm de diámetro) en una jeringa de 1 ml. Se inyecta la solución por vía intraperitoneal en el ratón.
3. Dar una inyección de refuerzo 6 semanas más tarde con la misma cantidad de inmunoconjugado, pero sin CFA. Tomar la sangre 7 días más tarde (fuera del seno retroorbital) y la AEEre el suero mediante la incubación de la sangre durante 3 - 4 h a temperatura ambiente (RT).
   1. Centrifugar la mezcla a 3000 xg durante 5 min. Tomar el sobrenadante en el suero y la transfiere a un nuevo tubo. Almacenarlo a -20 ° C. Se desecha el precipitado.
4. Analizar el suero mediante ELISA, tal como se describe en el paso 3. Para la fusión, elegir el ratón con el título más elevado en suero.
5. En preparación para la fusión celular, aumentar el ratón con 150 a 200 mg del inmunoconjugado en 300 l de PBS sin adyuvante sólo 4 días antes de la fusión.

3. ELISA

1. Preparar una solución de antígeno con una concentración de 5 mg / ml en PBS y transferir 50 l en cada ELISA pocillo de una placa de 96 pocillos.
2. Incubar la placa durante 2 horas a 37 ° C o durante la noche a 4 ° C en una cámara húmeda.
3. Lavar la placa 3 veces con agua del grifo. Bloquear los pocillos con 80 l de suero de ternera neonatal PBS / 5% (NCS) por pocillo durante 1 h a TA en un ch húmedoámbar. Preparar las diluciones de suero en una proporción 1: 5 series empezando por 1:50. Para el análisis del cultivo celular, utilizar el sobrenadante de cultivo sin diluir.
4. Lavar la placa 3 veces con agua del grifo. Pipeta de 50 l de la muestra por pocillo y se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente en una cámara húmeda. Preparar la solución de anticuerpo secundario en una dilución 1: 5000 de un anticuerpo anti-ratón IgG de cabra conjugado con peroxidasa de rábano (HRP).
5. Lavar la placa 3 veces con agua del grifo y se añaden 50 l de la solución de anticuerpo secundario por pocillo. Incubar durante 45 min a TA en una cámara húmeda.
6. Preparar una solución de sustrato fresco. Hacer las soluciones madre de M NaH ₂ PO ₄ peróxido de hidrógeno al 0,1 y 0,1%. Tome 5 partes NaH ₂ PO _4, 4 partes de peróxido de hidrógeno y 1 parte de tetrametilbencidina para la solución de sustrato fresco.
   1. Lavar la placa 10 veces con agua del grifo. Pipetear 50 l de solución de sustrato fresco en los pocillos e incubar durante 5 a 10 min en eloscuro.
7. Detener la reacción con 50 l 1 MH ₂ SO ₄ por pocillo. El uso de un lector de placas, se mide la densidad óptica a 450 nm con una longitud de onda de referencia a 630 nm.

4. Preparación de cultivos celulares de mieloma

1. A partir de ahora, lleve a cabo todo el trabajo en condiciones estériles.
2. Preparar un nuevo medio de cultivo para el cultivo celular. Suplemento 500 ml de RPMI1640 con 10% de suero fetal de ternera (50 ml), 2 mM L-glutamina (5 ml), y 50 mM mercaptoetanol (5 ml). Sustituir la glutamina cada 7 días.
3. Descongelar un vial de 0 murinos células SP2 / en agua tibia. Transferir la solución de células en 10 ml de medio de cultivo fresco y se centrifuga durante 10 min a 200 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 ml de medio de cultivo fresco.
4. La transferencia de las células en un 25-cm ² matraz y se incuban a 37 ° C y 5% de _CO2 en una incubadora. Expandir las células para dos de 75 m ² frascos befde fusión de mineral. Conserve alícuotas para almacenamiento a largo plazo, como se describe en el Paso 7.

5. Preparación de células alimentadoras

1. Sacrificar un ratón de 12 semanas de edad NMRI (de acuerdo con las directrices nacionales e institucionales, por ejemplo, mediante inhalación de _CO2). Retire la piel y el limpiar el abdomen con un 70% de etanol.
2. Inyectar 5 ml de medio RPMI enfriado con hielo en el abdomen, un masaje en el abdomen con una pinza, y aspirar la suspensión de células de alimentación. Colocar las células en un tubo de vacío de 50 ml. Realice este paso una vez más. 7 a 10 ml de la suspensión de células de alimentación deben ser recuperados.
3. Preparar una suspensión de células de alimentación de 100 ml mediante la adición de 90 ml de medio de cultivo celular completo (RPMI 1640, 10% de suero de ternero fetal, glutamina 2 mM, y 50 mM mercaptoetanol). Mezclar y transferir 100 l / pocillo en placas de cultivo celular de 10 x 96 pocillos. Se incuban las placas durante la noche a 37 ° C y 5% de _CO2 en una incubadora.

6. Fusión Celular

1. Sacrificar el ratón inmunizado por dislocación cervical o inhalación de _CO2 y extirpar el bazo ^14. Tomar la sangre adicional desde el corazón y preparar el suero, como se describe en el paso 2.3, como control positivo en el ELISA.
2. Preparar una suspensión de células de bazo presionando el bazo a través de un filtro de células. Llenar hasta 20 ml con medio de cultivo celular completo. Recoger las células en tubos de 50 ml por centrifugación (200 xg, 10 min, y 4 ° C). Descartar el sobrenadante.
3. Lavar el matraz de cultivo de células y recoger las células de mieloma por centrifugación (200 xg, 10 min, y 4 ° C) y descartar el sobrenadante.
4. Resuspender los sedimentos celulares en 20 ml de tampón de sal equilibrada (BSS) (NaCl 125 mM, KCl 5 mM, 4 mM CaCl _2, 2,5 mM MgCl _2, y mM Tris-HCl 5; pH 7,4) y se centrifuga de nuevo. Repita los pasos del lavado tres veces.
5. Para ajustar el esplenocitos: proporción de células de mieloma, contar las células después de la segunda etapa de lavado de abetosst resuspender el sedimento en 1 ml de tampón BSS. Hacer una dilución 1:10 y transferir 10 l a una cámara de recuento celular. Contar las células y determinar la concentración de células en 1 ml.
6. Ajustar el número de células en el tampón de BSS a tres piezas de esplenocitos y células de mieloma de una sola parte en un volumen final de 1 ml. Tomar 200 l de la suspensión celular y se mezcla con 200 l de PEG8000 (1 g en 4 ml de tampón BSS). Transferir los 400 l en una cubeta de electroporación con un diámetro de 2 mm y establecer el impulso (600 a 650 V y 25 ms).
   1. Después del pulso, se incuban las células a temperatura ambiente durante 3 min en la cubeta. Eliminar las células y los pusieron gota a gota en un matraz Erlenmeyer con 100 ml de HAT Medio (RPMI 1640, 10% FCS, glutamina 2 mM, mercaptoetanol 50 mM, 100 mM hipoxantina, 5,8 M azaserina, y 16 mM timidina).
   2. Repita la fusión 4 veces hasta que se gasta el lote de 1 ml. Incubar el matraz Erlenmeyer durante 3 horas a 37 ° C y 5% de CO ₂en una incubadora.
7. Complementar la suspensión celular de nuevo con hipoxantina, azaserina, y timidina antes en placas las células en la capa alimentadora. Añadir 100 ml de la suspensión celular por pocillo a las placas de capa de alimentación y se incuban las placas a 37 ° C y 5% de CO ₂ (en una incubadora). La concentración final dentro del pozo debe ser de 100 hipoxantina M, 5,8 M azaserina, y 16 mM de timidina.
8. Realizar un análisis microscópico (ampliación: lente objetivo de 10X, 10X ocular) para el crecimiento clonal en cada pocillo de la placa después de 7 días con el fin de determinar si los pozos son mono- o policlonal. células monoclonales son un grupo de células que se originan a partir de una sola célula. células policlonales son múltiples grupos de células en un pocillo. Cambiar el medio completo después de 7 días y se incuba de nuevo durante 7 días en un medio HAT.
9. Cambiar el medio HAT y cultivar las células en medio de cultivo celular completo. Utilice el sobrenadante para realizar un ELISA, como se describe en el paso 3. Las células de hibridoma positivas debe ser ampliado en placas de 24 pocillos de acuerdo a las pruebas para la producción de anticuerpos específicos. Si las células son policlonales, una dilución limitada se tiene que realizar (que se describe en el paso 8).

7. La crioconservación de hibridomas

1. Cryoconservé mono- positivo y hibridomas policlonales para el almacenamiento a largo plazo. Recoger las células de una placa de 24 pocillos con una confluencia de> 60% mediante centrifugación (200 xg, 10 min, y 4 ° C).
2. Resuspender el precipitado en 500 l de medio de cultivo celular completo y la transfiere en un tubo criogénico. Añadir 500 l de medio de congelación (RPMI 1640, FCS al 20%, y 15% de dimetilsulfóxido), se mezcla, y lo puso en una caja de espuma de poliestireno en una caja de congelación o especial. Almacenar a -80 ° C durante 3 días. Después de 3 días, el criotubo se puede transferir a nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.

8. dilución limitante de anticuerpos policlonales Los hibridomas

1. Makea cultura capa de alimentación, como se describe en el paso 5. Cosecha células policlonales positivos, como se describe en el paso 7.1. Contar las células, como se describe en el paso 6.5, y ajustar el número de células a 10 células / ml, con un volumen final de 10 ml para una placa de 96 pocillos. Añadir 100 ml / pocillo a la capa de alimentación.
2. Incubar durante 7 días a 37 ° C y analizar el crecimiento clonal microscopio (ampliación: 10X lente objetivo, 10X ocular). Hacer un ELISA del sobrenadante del cultivo, como se describe en el paso 3, e identificar los hibridomas monoclonales apropiados para la cultura de masas.

9. Cultura de Masas y purificación de anticuerpos monoclonales

1. La transferencia de los hibridomas monoclonales con las señales de ELISA apropiadas para 25 cm ² o matraces de 75 ^cm2 y obtener hasta 500 ml del sobrenadante del cultivo. Prueba de la semana de cultivo para la producción de anticuerpos específicos y conservar 3 - 5 alícuotas por hibridoma para el almacenamiento a largo plazo, tal como se describe en el paso 7.
2. Centrifugar el sobrenadante de cultivo a 4.900 xg y 4 ° C durante 15 min y filtrar a través de un filtro de 0,45-micras. Mezclar el sobrenadante con tampón (4 M NaCl y 2 M de glicina NaOH, pH 8,9) de unión en una proporción de 3: 1.
3. Preparar una columna de proteína mediante el lavado con tampón de lavado (diluir el tampón de unión 1: 3 en dH ₂ O). Pasar el sobrenadante de la Etapa 9.2 sobre la columna y se recoge el flujo a través. Eluir el anticuerpo unido con 0,1 M de citrato, pH 3,5 y neutralizar el pH inmediatamente con 500 l de Tris-HCl, pH 9,0.
4. Caracterizar el anticuerpo eluido por SDS-PAGE, Western Blot y ELISA, y validarlo para la aplicación final.
   1. Para el SDS PAGE, tome 3 - 5 de g de solución de anticuerpo purificado por carril (una muestra de 20 l), añadir 5 l de tampón de carga de muestra 4x SDS (SDS al 8%, 20% de 2-mercaptoetanol, 40% de glicerina, y 0,015 % de bromofenol, reducida), y calentar las sondas en 95 ° C durante 5 min. Como control, utilizar la misma muestra con un una purificadontibody del mismo isotipo pero especificidad irrelevante.
   2. Cargar las muestras en un gel de SDS 12,5%, coloque 5 l de una escalera de proteína sin teñir en un carril adicional, y separarlos por electroforesis. Teñir el gel con azul brillante de Coomassie y documentar los resultados. Un protocolo básico SDS fue establecido por Laemmli en 1970 ^15.

Resultados

La figura 1 muestra un ejemplo de la titulación de suero específico de antígeno para una inmunización realizada en el laboratorio. En esta figura, los sueros inmunes A y B se titularon de 1:50 a 1: 5.000.000 en comparación con un suero de un ratón ingenuo. El antígeno se recubre sobre la fase sólida, y los anticuerpos específicos se detectaron con un anticuerpo anti-Ig de ratón de cabra conjugado con POD. Ambos sueros de los ratones inmunizados mostraron un tí...

Discusión

La generación de anticuerpos monoclonales mediante tecnología de hibridoma requiere un análisis intenso y detallado epítopo, especialmente con respecto a la aplicación final, cuando el anticuerpo debería reconocer el objetivo. Esto es a menudo subestimada por los usuarios y conduce a los anticuerpos con los pobres resultados. El proceso de fusión es siempre aleatorio, lo que significa que el resultado de hibridomas específicos es altamente dependiente de la relación de células y la vitalidad en este punto. Des...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
glutaraldehyde	Sigma Aldrich	G5882
N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC)	Sigma Aldrich	39391-10ML
Sulfo-GMBS	Perbio Science Germany	22324
ovalbumin	Sigma Aldrich	A5503
bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A2153
keyhole limpet hemocyanin	Sigma Aldrich	H8283
Falcon tubes 15 mL	Biochrom GmbH	P91015
reaction vials, 1.5 mL	Carl Roth GmbH & C0.KG	CNT2.1
hollow needle	Carl Roth GmbH & C0.KG	C724.1
glass wool	Carl Roth GmbH & C0.KG	6574.1
Sephadex G25 coarse	Sigma Aldrich	GE-17-0034-02
Freund´s adjuvant, complete	Sigma Aldrich	F5881-10ML
ELISA plates, 96 well	Greiner bio-one	655101
neonatal calf serum	Biochrom GmbH	S1025
TipOne Tips 1,000 µL	Starlab	S1111-2021
Pipette tips 200 µL	Greiner bio-one	739291
HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody	Dianova	115-035-003
tetramethylbenzidine	Carl Roth GmbH & C0.KG	6350.2
Natriumdihydrogenphosphat	Carl Roth GmbH & C0.KG	K300.2
peroxide/urea
sulphuric acid	Carl Roth GmbH & C0.KG	4623.3
RPMI 1640	Life technologies GmbH	31870074
L-glutamine	Carl Roth GmbH & C0.KG	HN08.2
beta-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250
fetal calf serum	Invitrogen	10270106
TC-flask 25 cm2	Peske GmbH	86-V025
TC-flask 75 cm2	Peske GmbH	86-V075
ethanol, 96%	Carl Roth GmbH & C0.KG	P075.1
cell strainer	VWR international	734-0002
Falcon tubes 50 mL	Biochrom GmbH	P91050
PEG 8000	Sigma Aldrich	1546605
electroporation cuvette, 2 mm	Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K.	EKL2,25
hypoxanthine	Sigma Aldrich	H9636-25G
azaserine	Sigma Aldrich	A4142
thymidine	USB Europa GmbH	22305 1 GM
TC-plates 96 well	Biochrom GmbH	P92696
TC-plates 24 well	Biochrom GmbH	P92424
cryotubes, 1 mL	Sigma Aldrich	V7384-1CS
dimethylsulfoxide	Carl Roth GmbH & C0.KG	4720.1
protein A sepharose	Sigma Aldrich	P3391-1G
SDS sample loading buffer, Roti-Load 1	Carl Roth GmbH & C0.KG	K929.1
unstained protein ladder	BioRad Laboratories	161-0363
comassie brilliant blue R-250	BioRad Laboratories	161-0406