Hibridoma teknolojisi ile murin monoklonal antikorlar üretilmesi

Özet

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

Özet

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

Giriş

Bu protokol sunulan hibridoma teknolojisi ilk Köhler ve 1975 yılında Milstein ¹ tarafından tarif edilmiştir ve bazı teknik iyileştirmeler dışında, ana prosedür son 40 yıl ² sırasında önemli ölçüde değişmedi. Bu protokolün amacı, daha uygun bir aşı stratejisi, monoklonal antikorların üretilmesi için standart bir yöntem ve bir doğrulama yöntemi (ELISA) için bir örnek açıklamaktır.

Antikorlar inanılmaz araçlar ve hastalık izleme ve tedavi ³ tanı ve tedavi seçenekleri yanı sıra, bu tür flow sitometri, manyetik hücre sıralama, ya da immünofloresan gibi teknolojik yaklaşımlar, geniş bir yelpazede katkıda bulunur. İstenilen hedeflere yönelik monoklonal antikorların, ticari uygunluk antikorlar veya antikor-ilgili ürünlerin ⁴ yaklaşık sayısız miktarlarda 24 farklı bir web veri tabanları varlığı ile ortaya konmuştur. 2015 yılında, birntibody moleküller nedeniyle uygun doğrulama ve piyasada mevcut antikorların karakterizasyonu ciddi sorunlara uluslararası bir tartışmanın ^5-7 parçasıydı.

Hedef bir antijen için spesifik antikorları bulmak zor ve pahalı olabilir, ve genellikle, bu afinite ve özgüllük gerekli bulunmamaktadır. Bir antikor üreten hala zaman alıcı ve kudret daha iyi bir satın alma daha ayrı bir antikor üreten, geliştirmek ve antikor doğrulamak için kalifiye personele ihtiyaç duyar rağmen.

Nedeniyle antikor üretimi zaman alıcıdır ve deneyim gerektirir olması, bağlama moleküllerinin üretimi için alternatif yöntemler, bu sorunların üstesinden gelmek için geliştirilmiştir. En yaygın olarak kullanılan alternatif bir yöntem, faj gösterimi ile, tek zincirli antikorların rekombinant üretimi. Değişken bağlayıcı bölge genleri hücrelerinden ekstre edilmiş ve bir faj kaplama proteini ile bir araya getirilmektedir. sIngle zinciri daha sonra bakteriyofaj yüzeyi üzerinde ifade edilir ve birden fazla kaydırma adımda ⁸ taranır. Tek zincirli antikorların üretimi daha hızlıdır, ancak, aynı zamanda, bir uzman deneye gerektirir. Bazı biraraya getiren tek zincirli antikorların dezavantajları kötü istikrar ve in vitro diagnostik için uygunluk eksikliği vardır. En tanısal testlerde, saptama için bir Fc-reseptörü sonradan yeniden birleştirici tek zincirli antikor eklenmesi ihtiyacı olan gereklidir. Yine, bu zaman alıcı ve hibridoma tekniği daha fazla karmaşıktır. In vitro diagnostik, tam uzunlukta monoklonal fare ve tavşan antikorları en iyi seçenek olarak gösterilmiştir.

immüno tasarımı: laboratuarda çalışma başlamadan önce monoklonal antikorların üretilmesi önemli adımlardan biri yapılmalıdır. ele alınması gereken sorular şunlardır: Nihai applicat hedefin fiziksel kompozisyonu nediriyonu ve mevcut olduğu matrisler? hedef uygulamada hangi konsantrasyon olacak? Nihai uygulama nedir ve antikor yerine getirmesi gerektiğini istenenler nelerdir?

Her zaman doğrusal bir peptid fragmanı kullanıldığı takdirde, aynı zamanda seçim hedefi nihai epitop doğrusal gerektiği dikkate almak; aksi halde, bir antikor bağlamayacaktır. Tabii ki, tarama yönteminin, bağımsız olarak, antikorlar, farklı uygulamalarda farklı antijenik biçimleri tanıyan seçilebilir, ancak bu çok kesin doğrulanması gerekir. Bu antikor geliştirme ve doğrulama gibi iddialı süreçlerdir nedenleri vardır.

bağışıklama için antijenik biçimi seçimi antikor gelişimi için esastır ve bu sürecin başarısını veya başarısızlığını belirler. farenin ilgili bir antikor titresi ifade sonra, dalak hücreleri izole edildi ve miyeloma hücreleri ile birleştirilmiştir. En sık miyeloma hücre çizgilerifare monoklonal antikor gelişimi X63-Ag 8,653 ⁹ ve Balb / c fare suşundan SP2 / 0-Ag 14 ¹⁰ vardır. Hücreler malign B hücre lenfoması soyundan ve kendi ağır veya hafif zincirlerinin bir salgılar çünkü seçilmiştir. 1 (miyelom hücreleri karşı splenositler): hücreler 1:10 ile 10 arasında bir oranda uyarlanabilir. Stoicheva Hui ^11'e göre, 1 ve polietilen glikol (PEG) ve elektrofüzyon ile kaynaşık: Bu protokol, hücrelerin 3 bir oranda uyarlanmıştır.

B hücreleri ve miyelom hücrelerinin füzyonu rasgele bir süreçtir. Bu nedenle, iki B lenfositleri ya da iki miyelom hücrelerinin hibridlerinin oluşturulmasına olabilir, ancak bu melez kültürde uzun süre hayatta mümkün olmaz. Hücreleri sadece kaynaşık hibridoma hücreleri nedeniyle pirimidin sentezi de novo yolu kullanan olasılığı dayanabildiği bir hipoksantin, aminopterin ve timidin (HAT) seçimi, tabi tutulur. mon üretimi içinoclonal antikorlar, bir ana hücreden kaynaklanan bir hücre çizgisi elde etmek için gereklidir. monoklonalitenin seyreltme teknikleri ve hücre büyümesinin mikroskobik analizi sınırlayarak sağlanır. hibridom kültür süpernatantları çok ELISA ile spesifik antikor üretimi için ya da akış sitometrisi, ve en iyi bağlayıcılar seçilebilirler. kitle kültürü ve saflaştırmadan sonra, antikor molekülü son karakterize edilebilir ve arzu edilen uygulama için doğrulandı.

Protokol

Potsdam'ın University (Potsdam, Almanya), bizim ıslah kolonisinden Balb / c ya da NMRI fareleri (Mus musculus) monoklonal antikorların üretilmesi için kullanıldı. Hayvan çalışmaları, ilgili ulusal ve uluslar arası kurallara göre yapılmıştır. Çalışma Ortamı, Sağlık Brandenburg Bakanlığı ve Tüketiciyi Koruma (referans numarası V3-2347-A16-4-2012) tarafından onaylanmıştır.

Immüno 1. Hazırlık

1. Bir taşıyıcıya antijen bağlanması için, amino- ile standart eşleme protokollerini kullanarak, örneğin glutaraldehid, N ile olduğu gibi karboksi ya da sülfo-gruplan, - (3-dimetilaminopropil) - etilkarbodiimid (EDC) veya N - [y-maleimidobutiriloksi ] süksinimid ester (sülfo-GMBS).
2. : 1 oranında (glutaraldehitle ör) bağlantı ^13, bir 1 hedef proteini veya peptidi ve bir taşıyıcı (ovalbümin, büyükbaş hayvan serum albümini veya anahtar deliği limpet hemosiyanin) kullanın. Hedef pr seyreltinotein veya fosfat tamponlu tuz (PBS) ve 50 mM NaHCO ₃ tamponunda taşıyıcı protein peptid. hacim ve aşılar için gerekli miktara konsantrasyonu uyarlayın.
   1. Her iki çözüm karıştırın ve% 1.25 glutaraldehid ekleyin. Karıştırınız ve oda sıcaklığında 4 saat (RT) örnek inkübe edilir. hibridoma hücreleri seçmek için aynı immünokonjugatı yapmak, ancak başka bir taşıyıcı ile, sırayla belirsiz taşıyıcı bağlayıcıların seçimi önlemek için.
3. (Örneğin, Sephadex G25) ticari kaba reçine ile hızlı bir diyaliz gerçekleştirerek bağlantı örneği dialyze.
   1. içi boş bir iğne ile bir 1.5 ml reaksiyon şişesine alt delmek ve bir 15 ml tüp içine koyun. Sızdırmazlık için alt cam yünü koyun ve (0.5 mL kalibrasyon işareti) kaba reçine 300 mg ile örtün.
   2. Dikkatle, 1.5 ml reaksiyon tüpüne 1 ml PBS damla damla koymak ve cam yünü hala perforasyon sızdırmazlık emin olun. kaba reçine s Letiyi ve santrifüj 2 dakika süreyle 500 xg'de sütun. Bu tür bir kolon birleştirme örnek 200 uL diyaliz için kullanılabilir. yüksek miktarlar için, daha fazla sütun yapmak.
   3. hortumunu değiştirin ve kabarmış kaba reçine üzerine bağlantı çözümü bırakın. Santrifüj tekrar 2 dakika süreyle 500 xg'de. tüpten eluent çıkarın ve bağışıklama için kullanabilirsiniz.

Hayvanların 2. Bağışıklama

1. immünizasyon için, iki ya da üç 6 ila 12 haftalık Balb / c fareleri seçin.
2. 200 ul PBS içinde immüno 200 ug ve tam Freund's yardımcı madde, 100 uL (CFA) ile karıştırarak - bir hayvan için, 150 hazırlayın. 1 ml şırınga çözelti bir kısa ve ince bir iğne ile 3 kez (0.6 mm çap) karıştırın. fare içine intraperitoneal çözüm enjekte.
3. 6 hafta sonra immüno aynı miktarda bir yükseltici enjeksiyonu, ama CFA olmadan. (Retroorbital sinüs dışarı) 7 gün sonra kan ve Koordinatörler alınOda sıcaklığında 4 saat (RT) - 3 için kan inkübe edilerek serum yeniden.
   1. 5 dakika boyunca 3.000 xg'de karışımı santrifüj. Serum süpernatant atın ve yeni bir tüp içine aktarın. -20 ° C'de saklayın. pelet atın.
4. ELISA aracılığıyla sera analiz, füzyon için Adım 3'te açıklandığı gibi, en yüksek serum titresi ile fare seçin.
5. Sadece 4 gün füzyon önce adjuvan olmadan PBS 300 uL immüno 200 mikrogram - hücre füzyonu için hazırlık olarak, 150 ile fare artırmak.

3. ELISA

1. PBS içinde 5 mg / mL'lik bir konsantrasyon ile bir antijen çözeltisi hazırlayın ve 96 oyuklu plakanın her bir ELISA içinde 50 uL aktarın.
2. 37 ° C ya da gece boyunca nemli bir oda içinde 4 ° C'de 2 saat boyunca inkübasyona bırakılır.
3. musluk suyu ile plaka 3 kez yıkayın. Nemli Ch, oda sıcaklığında 1 saat boyunca göz başına PBS /% 5 neonatal dana serumu, 80 uL (NCS) ile kuyu blokekehribar. 1:50 ile başlayan 5 serisi: 1 serum dilüsyonları hazırlayın. hücre kültürü analizi için, seyreltilmemiş kültür süpernatanı kullanımı.
4. musluk suyu ile plaka 3 kez yıkayın. Pipet 50 oyuk başına örnek ul ve nemli bir oda içinde oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. yaban turpu peroksidazı (HRP) konjuge edilmiş bir keçi anti-fare IgG antikoru 5000 seyreltme: 1 ikincil antikor çözeltisi hazırlayın.
5. musluk suyu ile plaka 3 kez yıkanır ve her ikincil antikor çözeltisinin 50 ul ekle. nemli bir oda içinde oda sıcaklığında 45 dakika boyunca inkübe edin.
6. taze bir substrat çözeltisi hazırlayın. 0.1 M NaH ₂ PO ₄ ve% 0.1 hidrojen peroksit stok çözümleri olun. 5 parça NaH ₂ PO _4, 4 kısım hidrojen peroksit ve taze alt-tabaka çözeltisi 1 parçası tetrametilbenzidin al.
   1. musluk suyu ile plaka 10 kez yıkayın. Pipet 50 kuyulara taze substrat çözeltisi uL ve 5 için inkübe - 10 dakikakaranlık.
7. 50 uL 1 MH ₂ kuyu başına SO ₄ ile reaksiyonu durdurun. Bir levha okuyucu ile 630 nm'de bir referans dalga boyu ile 450 nm'de optik yoğunluk ölçülür.

Miyelom Hücre Kültürleri 4. hazırlanması

1. Şu andan itibaren, steril koşullar altında tüm çalışmaları gerçekleştirmek.
2. Hücre ekimi için taze bir kültür ortamı hazırlayın. % 10 fetal dana serumu (50 mL), 2 mM L-glutamin (5 ml) ve 50 uM merkaptoetanol (5 mL) ile RPMI1640 500 mL Supplement. Her 7 gün glutamin değiştirin.
3. Sıcak su içinde murin SP2 / 0 hücre şişe çözülme. 200 x g'de 10 dakika süre ile taze kültür ortamı ve santrifüj 10 ml hücre solüsyonu aktarın. Süpernatant atılır ve taze kültür ortamına 1 mL pelletini.
4. 25 ^cm2 şişeye hücreleri aktarın ve bir kuluçka _CO2 37 ° C'de inkübe ve% 5. İki 75-m hücreleri genişletmek ² şişeler befcevher füzyon. Adım 7'de tarif edildiği gibi, uzun süreli depolama için alikotları koruyun.

Besleyici hücreler 5. hazırlanması

1. (; Örneğin, CO ₂ inhalasyon yoluyla ulusal ve kurumsal kurallarına göre) 12 haftalık NMRI fare Kurban. kürk çıkarın ve% 70 etanol ile karın temizleyin.
2. , Karın içine buz RPMI ortamı 5 ml enjekte edilir bir cımbız ile karın masaj ve besleyici hücre süspansiyonu aspire. Boş 50 ml bir tüp içinde hücreleri yerleştirin. bir kez daha bu adımı gerçekleştirin. besleyici hücre süspansiyonu, 7 ila 10 ml geri alınmalıdır.
3. Tam hücre kültür ortamında 90 mL (RPMI 1640,% 10 fetal dana serumu, 2 mM glutamin, ve 50 uM merkaptoetanol) ekleyerek 100 mL'lik besleyici hücre süspansiyonu hazırlamak. Karıştır ve 10 x 96 gözlü hücre kültür levhaları içerisine oyuk başına 100 uL / ​​aktarın. Gece boyunca kuluçka makinesi içinde 37 ° C ve% 5 _CO2 de inkübe edin.

6. Hücre Füzyon

1. Servikal dislokasyon veya CO ₂ inhalasyon yoluyla bağışıklı fare Kurban ve dalak ¹⁴ tüketim. ELISA'da pozitif kontrol olarak, aşama 2.3'de tarif edildiği gibi, kalp ek kan örneği ve serum hazırlamak.
2. Bir hücre süzgecinden dalak basarak bir dalak hücre süspansiyonu hazırlayın. Tam hücre kültür ortamı ile 20 ml'ye kadar doldurun. santrifüj ile 50 ml tüpler hücreleri hasat (200 x g'de, 10 dakika, 4 ° C). süpernatant atın.
3. Hücre kültür şişesi yıkayın ve santrifüj ile miyeloma hücreleri hasat (200 x g'de, 10 dakika, 4 ° C) ve süpernatant atılır.
4. 20 dengeli tuz tamponu (BSS) hücre pelet yeniden süspanse (125 mM NaCI, 5 mM KCI, 4 mM _CaCl2, 2.5 mM _MgCl2, 5 mM Tris-HCI, pH 7.4) ve santrifüj daha. Yıkama üç kez adımları tekrarlayın.
5. splenosit ayarlamak için: miyelom hücre oranı, köknar ikinci yıkama aşamasından sonra hücreleri saymakSt BSS tamponu 1 mL içinde topağın tekrar askıda. 1:10 seyreltme yapın ve bir hücre sayım odasına 10 uL aktarın. Hücre sayımı ve 1 ml hücre konsantrasyonunu belirler.
6. 1 ml nihai hacim içinde üç parça splenosit ve tek parçalı bir miyelom hücrelerine BSS tamponu içinde hücre sayısını ayarlar. Hücre süspansiyonunun 200 uL al ve PEG8000 200 uL (BSS 4 ml tampon içinde 1 g) ile karıştırın. 2 mm çapındaki bir elektroporasyon küvetine 400 uL aktarın ve nabız ayarlayın (600-650 V ve 25 ms).
   1. nabız sonra küvet içinde 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe hücreleri. hücreleri çıkarın ve HAT ortamı 100 mL (RPMI 1640,% 10 FCS, 2 mM glutamin, 50 uM merkaptoetanol, 100 uM hipoksantin, 5.8 uM azaserin, ve 16 uM timidin) sahip bir Erlenmeyer şişesi içine damlatılmıştır.
   2. 1-ml toplu harcanan kadar füzyon 4 kez tekrarlayın. 37 ° C ve% 5 _CO2 seviyesinde 3 saat Erleni inkübebir kuluçka makinesi içinde.
7. besleyici katmandaki hücreleri kaplama önce hipoksantin, azaserin ve timidin ile tekrar hücre süspansiyonu Supplement. Besleyici tabaka plakalarına yuva başına hücre süspansiyonu 100 ul ekleyin ve 37 ° C'de ve% 5 (bir kuluçka makinesi içinde) _CO2 de inkübe edin. oyuk içindeki nihai konsantrasyon 100 uM hipoksantin, 5.8 uM azaserin, ve 16 uM timidin olmalıdır.
8. kuyu mono- ya da poliklonal olup olmadığını tespit etmek amacıyla 7 gün sonra plakanın her bir klonal büyümesi için iyi: mikroskopik analiz (10X objektif lens, 10X göz parça büyütme) uygulayın. Monoklonal hücreler tek bir hücrenin köken hücrelerin bir küme vardır. Poliklonal hücre, bir gözdeki hücrelerin birden çok kümelerdir. 7 gün sonra tam ortam değiştirme ve HAT ortamında 7 gün daha inkübe edilir.
9. HAT ortamı değiştirin ve tam hücre kültürü ortamında hücreleri yetiştirmek. Bir E gerçekleştirmek için süpernatant kullanınAşama tarif edildiği gibi lisa 3. Pozitif hibridoma hücreleri özel antikorların üretimi için testlere göre 24 oyuklu plakalar içinde yayılması gerekir. Hücreler poliklonal ise, sınırlı seyreltme (aşama 8'de tarif) yapılmalıdır.

Hibridomalar 7. dondurarak korunması

1. Uzun süreli depolama için pozitif mono- ve poliklonal hibridomalar Cryoconserve. santrifüj ile>% 60 bir izdiham ile 24 oyuklu plaka hücreleri hasat (200 x g'de, 10 dakika, 4 ° C).
2. Tam hücre kültür ortamının 500 uL pelletini ve cryotube içine aktarın. Dondurarak ortamın 500 uL (RPMI 1640,% 20 FCS ve% 15 dimethylsülfoksit) ekleyin karıştırın ve bir strafor kutu veya özel bir dondurma kutusuna koydu. 3 gün -80 ° C'de saklayın. 3 gün sonra, cryotube uzun süreli saklama için sıvı nitrojen aktarılabilir.

8. Poliklonal hibridomalar sınırlayıcı seyreltme

1. MakEA besleyici tabaka kültürü, Aşama 7.1'de tarif edildiği gibi Adım 5. Hasat pozitif poliklonal hücreleri tarif edildiği gibi. Aşama 6.5 de tarif edildiği gibi, hücre sayımı ve 96 oyuklu bir plaka 10 mL'lik bir son hacme sahip 10 hücre / ml hücre sayısını ayarlamak. 100 uL / ​​oyuk üzerine besleme katmanı ekleyin.
2. 37 ° C'de 7 gün inkübe ve mikroskopik (büyütme: 10X objektif lens, 10X göz parça) klonal büyüme analiz. Aşama 3'te tarif edildiği gibi, kültür süpernatanı içinde bir ELISA olun ve kütle kültürü için uygun monoklonal hibridomlar tespit.

9. Kütle Kültür ve monoklonal antikorların saflaştırılması,

1. 25 ^cm2 veya 75 ^cm2 şişelerde uygun ELISA sinyalleri ile monoklonal hibridomalar transferi ve kültür yüzey 500 mL'ye toplar. özel bir antikor üretimi için kültür haftalık test edin ve 3 muhafaza - Adım 7'de tarif edildiği gibi, uzun süreli depolama için hibridoma başına 5 alikotları.
2. Santrifüj kültürünün 4,900 xg'de süpernatan 15 dakika boyunca 4 ° C ve 0.45 mm'lik bir filtreden filtre. : 1 oranında bir 3 tamponu (4 M NaCI ve 2 M glisin NaOH, pH 8.9) bağlayıcı süpernatant karıştırın.
3. (: DH ₂ O 3 bağlayıcı tampon: 1 seyreltin) yıkama tamponu ile yıkanarak bir protein, bir kolon hazırlanmıştır. kolonu üzerinde Adım 9.2 süpernatant Pass ve flow-through toplamak. 0.1 M sitrat, pH 3.5 ile bağlı antikoru Zehir ve Tris-HCl, 500 uL, pH 9.0 hemen pH nötralize.
4. SDS-PAGE, Western Blot, ve ELISA ile elüt antikoru karakterize ve son uygulama için doğrulamak.
   1. 5 uL 4 x SDS numune yükleme tamponu (% 8 SDS,% 20 2-merkaptoetanol,% 40 gliserin ve 0.015 ekleyin, şerit (20 uL numune) her saflaştınlmış antikor çözeltisi 5 ug - SDS PAGE için, 3 sunar % bromofenol, indirgenmiş) ve 5 dakika boyunca 95 ° C 'de probları ısıtın. Bir kontrol olarak, saflaştırılmış A ile aynı örnek kullanımıAynı izotip ancak özgüllüğü belli olmayan ntibody.
   2. ,% 12.5 SDS jel örnekleri yükleyin ek şeritte bir boyanmamış protein merdiven 5 uL koyun ve elektroforez ile ayırın. Coomassie Brillant Blue ile jel Leke ve sonuçları belgelemek. Temel SDS protokolü 1970 ¹⁵ Laemmli tarafından kurulmuştur.

Sonuçlar

Şekil 1, laboratuarda yapılan bir immünizasyon için antijene özel serum titeri bir örneğini göstermektedir. naif fare serumu ile karşılaştırıldığında 5,000,000: Bu şekilde, bağışıklık serasının A ve B 1:50 1 ila titre edilmiştir. Antijen katı faz üzerinde kaplanmış ve spesifik antikorlar POD-konjuge keçi anti-fare Ig antikoru ile tespit edilmiştir. bağışıklık kazandırılmış farelerin iki sera naif fare ile karşılaştırıldığın...

Tartışmalar

hibridoma teknolojisi ile monoklonal antikorların üretimi, antikor hedefi kabul ne zaman, özellikle de son uygulama ile ilgili olarak, yoğun ve ayrıntılı epitop analizi gerektirir. Bu genellikle kullanıcılar tarafından hafife ve zayıf performansları ile antikorlara neden olmaktadır. Füzyon işlemi spesifik hibridomlar sonucu bu noktada hücre oranı ve canlılık üzerine son derece bağlı olduğu anlamına gelir, her rastgele. Sınırlı seyreltildikten sonra, hücreler, çok dengesizdirler ve hücre bü...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
glutaraldehyde	Sigma Aldrich	G5882
N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC)	Sigma Aldrich	39391-10ML
Sulfo-GMBS	Perbio Science Germany	22324
ovalbumin	Sigma Aldrich	A5503
bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A2153
keyhole limpet hemocyanin	Sigma Aldrich	H8283
Falcon tubes 15 mL	Biochrom GmbH	P91015
reaction vials, 1.5 mL	Carl Roth GmbH & C0.KG	CNT2.1
hollow needle	Carl Roth GmbH & C0.KG	C724.1
glass wool	Carl Roth GmbH & C0.KG	6574.1
Sephadex G25 coarse	Sigma Aldrich	GE-17-0034-02
Freund´s adjuvant, complete	Sigma Aldrich	F5881-10ML
ELISA plates, 96 well	Greiner bio-one	655101
neonatal calf serum	Biochrom GmbH	S1025
TipOne Tips 1,000 µL	Starlab	S1111-2021
Pipette tips 200 µL	Greiner bio-one	739291
HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody	Dianova	115-035-003
tetramethylbenzidine	Carl Roth GmbH & C0.KG	6350.2
Natriumdihydrogenphosphat	Carl Roth GmbH & C0.KG	K300.2
peroxide/urea
sulphuric acid	Carl Roth GmbH & C0.KG	4623.3
RPMI 1640	Life technologies GmbH	31870074
L-glutamine	Carl Roth GmbH & C0.KG	HN08.2
beta-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250
fetal calf serum	Invitrogen	10270106
TC-flask 25 cm2	Peske GmbH	86-V025
TC-flask 75 cm2	Peske GmbH	86-V075
ethanol, 96%	Carl Roth GmbH & C0.KG	P075.1
cell strainer	VWR international	734-0002
Falcon tubes 50 mL	Biochrom GmbH	P91050
PEG 8000	Sigma Aldrich	1546605
electroporation cuvette, 2 mm	Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K.	EKL2,25
hypoxanthine	Sigma Aldrich	H9636-25G
azaserine	Sigma Aldrich	A4142
thymidine	USB Europa GmbH	22305 1 GM
TC-plates 96 well	Biochrom GmbH	P92696
TC-plates 24 well	Biochrom GmbH	P92424
cryotubes, 1 mL	Sigma Aldrich	V7384-1CS
dimethylsulfoxide	Carl Roth GmbH & C0.KG	4720.1
protein A sepharose	Sigma Aldrich	P3391-1G
SDS sample loading buffer, Roti-Load 1	Carl Roth GmbH & C0.KG	K929.1
unstained protein ladder	BioRad Laboratories	161-0363
comassie brilliant blue R-250	BioRad Laboratories	161-0406