Генерация мышиных моноклональных антител с помощью гибридом технологии

Резюме

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

Аннотация

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

Введение

Технология гибридомная , представленная в настоящем протоколе впервые был описан Келером и Мильштейн ¹ в 1975 году , и, за исключением некоторых технических усовершенствований , за исключением того , основная процедура не сильно изменилась за последние 40 лет ^2. Целью данного протокола является разъяснение более подходящей стратегии иммунизации, стандартный метод для генерации моноклональных антител, а также пример для метода проверки (ELISA).

Антитела представляют собой невероятные инструменты и внести свой вклад в широкий диапазон технологических подходов, таких как поточной цитометрии, магнитной сортировки клеток, или иммунофлюоресценции, а также для диагностических и терапевтических возможностей для контроля и лечения заболеваний ^3. Коммерческой доступности моноклональных антител для желаемых целей свидетельствует наличие более чем 24 различных веб - баз данных с почти бесчисленные количества антител или продуктов антител , связанных с ⁴ -х . В 2015 годуntibody молекулы были частью международной дискуссии ^5-7 из - за серьезных проблем в надлежащей проверки и определения характеристик коммерчески доступных антител.

Это может быть трудным и дорогостоящим, чтобы найти специфические антитела для целевого антигена, и часто, они не имеют сродства или специфичности необходимо. Несмотря на то, генерируя антитела по-прежнему отнимает много времени и требует квалифицированного персонала для разработки и проверки антитела, получения антитела по отдельности может лучше, чем покупать один.

В связи с тем, что продукция антител отнимает много времени и требует опыта, были разработаны альтернативные способы получения связывающих молекул, чтобы преодолеть эти проблемы. Наиболее часто используемым альтернативным методом является рекомбинантное получение одноцепочечных антител с помощью фагового дисплея. Гены вариабельной области связывания извлекаются из клеток и в сочетании с белком покрытия фага. В sIngle цепь затем экспрессируется на поверхности бактериофага и подвергают скринингу в нескольких панорамирование ⁸ шагов. Получение одноцепочечных антител немного быстрее, но он также требует квалифицированного экспериментатора. К недостаткам некоторых рекомбинантных одноцепочечных антител являются бедными стабильность и отсутствие пригодности для диагностики в лабораторных условиях . В большинстве диагностических тестов, ЯК-рецептор для обнаружения необходимо, которая должна быть добавлена ​​к рекомбинантным одноцепочечных антител после этого. Опять же, это отнимает много времени и еще более сложным, чем техника гибридом. В диагностике в пробирке, полнометражные моноклональное мыши и антитела кролика были продемонстрированы быть лучшим выбором.

Одним из важнейших шагов в создании моноклональных антител должно быть сделано до того, как работа в лаборатории начинается: дизайн иммуноконъюгата. Вопросы, которые необходимо решить, являются: Каков физический состав мишени в конечном APPLICATиона, и где матрицы присутствуют? Какая концентрация будет иметь цель в приложении? Что такое окончательное приложение, и каковы требования, что антитело должен удовлетворять?

Всегда принимать во внимание, что если используется линейный пептидный фрагмент, он также должен быть линейным в конечном эпитоп в мишени выбора; в противном случае, это антитело не будет связываться. Конечно, независимо от метода скрининга, антитела могут быть выбраны, чтобы распознавать различные антигенные форматы в различных приложениях, но это должно быть подтверждено очень точно. Вот причины, почему антитела разработки и валидации являются такие амбициозные процессы.

Выбор антигенной формата для иммунизации имеет основополагающее значение для развития антител и определяет успех или неудачу этого процесса. После того, как мыши, проявляющие соответствующий титр антител, клетки селезенки выдел ют и сливают с клетками миеломы. Наиболее распространенные миеломы клеточные линии дляРазвитие мышиные моноклональные антитела являются X63-Ag 8,653 ⁹ и Sp2 / 0-Ag 14 ¹⁰ из / с мышиного штамма Balb. Клетки происходят от злокачественной лимфомы В-клеток, и были выбраны потому, что они не секретируют какие-либо из своих собственных тяжелой или легкой цепи. Клетки могут быть адаптированы к соотношении от 1:10 до 10: 1 (спленоциты в сравнении с клетками миеломы). В этом протоколе клетки были адаптированы к соотношении 3: 1 , и слитый с полиэтиленгликолем (ПЭГ) и электросваркой, в соответствии с Stoicheva и Hui ^11.

Слияние В-клеток и клеток миеломы является случайным процессом. Следовательно, гибриды двух В-лимфоциты или две клетки миеломы может быть сгенерирован, но эти гибриды не смогли бы выжить в течение длительного времени в культуре. Клетки проходят отбор гипоксантин, аминоптерин и тимидин (HAT), в которой только слитые клетки гибридомы могут выжить из - за возможности использования De Novo пути синтеза пиримидинов. Для поколения пнoclonal антитела, необходимо, чтобы получить линию клеток, происходящих из одной материнской клетки. Моноклональности обеспечивается путем ограничения методов разрежения и микроскопический анализ клеточного роста. Супернатанты культуры гибридомы подвергают скринингу на специфических антител, в основном, с помощью ELISA или проточной цитометрии, и лучшие связующие выбраны. После массовой культуры и очистки, молекула антитела, наконец, могут быть охарактеризованы и утверждены для желаемого применения.

протокол

Balb / с или NMRI мышей (Mus Musculus) из нашей гнездовой колонии в университете Потсдама (Потсдам, Германия) были использованы для получения моноклональных антител. Работа животных была проведена в соответствии с соответствующими национальными и международными стандартами. Исследование было одобрено Министерством Бранденбург окружающей среды, здоровья и защиты прав потребителей (номер ссылки V3-2347-A16-4-2012).

1. Приготовление иммуноконъюгатов

1. Для связывания антигена с носителем, используют стандартные протоколы связи через амино-, карбокси или сульфо-группы, такие как глутаровый альдегид, путем N - (3-диметиламинопропил) - N -ethylcarbodiimide (EDC), или N - [Y-maleimidobutyryloxy ] сукцинимид эфир (сульфо-GMBS).
2. Для связи (например, с помощью глутарового альдегида) ^13, используют целевой белок или пептид и носитель (овальбумина, бычий сывороточный альбумин, или гемоцианин) в соотношении 1: 1. Развести целевой прotein или пептида в фосфатно-солевом буфере (PBS) и белком - носителем , в 50 мМ NaHCO ₃ буфера. Адаптировать объем и концентрацию в количестве, необходимом для иммунизации.
   1. Смешайте оба раствора и добавить 1,25% глутаральдегида. Смешать и инкубировать образец в течение 4 ч при комнатной температуре (RT). Для того, чтобы выбрать гибридомные клетки, сделать то же самое иммуноконъюгата, но с другим носителем, для того, чтобы избежать выбора неспецифических связующих носителей.
3. Диализировать образец муфты путем выполнения быстрого диализ с коммерческой грубой смолой (например, Sephadex G25).
   1. Перфорируйте в нижней части реакционной ампуле 1,5 мл с полой иглой и поместить его в пробирку объемом 15 мл. Поместите стекловату в нижней части для уплотнения и покрыть ее с 300 мг грубой смолы (до калибровочной отметки 0,5 мл).
   2. Осторожно, положить 1 мл PBS по каплям в реакционную пробирку 1,5 мл и убедитесь, что стекловата еще герметизация перфорацию. Пусть грубой смолы Sну и центрифуга колонку при 500 мкг в течение 2 мин. Один такой столбец может быть использован для диализировать 200 мкл образца связи. Для большего объема, сделать несколько столбцов.
   3. Измените трубку и поместите раствор муфты на опухшей грубой смолой. Центрифуга снова при 500 мкг в течение 2 мин. Извлеките элюент из трубы и использовать его для иммунизации.

2. Иммунизация животных

1. Выберите два или три от 6 до 12-недельного возраста Balb / C мышей для иммунизации.
2. Для одного животного, подготовить 150 - 200 мкг иммуноконъюгата в 200 мкл PBS и смешать его с 100 мкл полной Freund's адъювантной (CFA). Приготовьте раствор 3 раза с короткой и тонкой иглой (0,6 мм в диаметре) на шприц 1 мл. Вводят раствор внутрибрюшинно в мышь.
3. Дайте ревакцинации через 6 недель с тем же самым количеством иммуноконъюгата, но без CFA. Возьмите кровь через 7 дней (из ретроорбитального пазухи) и Подготовительномповторно сыворотке путем инкубирования крови в течение 3-х - 4 ч при комнатной температуре (RT).
   1. Центрифуга смесь при 3000 х г в течение 5 мин. Возьмите сывороточный супернатант и перенести его в новую пробирку. Хранить при -20 ° С. Выбросите осадок.
4. Анализ сывороток с помощью ELISA, как описано в шаге 3. Для слияния, выбрать мышь с наивысшим титром сыворотки.
5. В рамках подготовки к слиянию клеток, повысить мышь с 150 - 200 мкг иммуноконъюгата в 300 мкл PBS без адъюванта всего 4 дня до слияния.

3. ELISA

1. Готовят раствор антигена с концентрацией 5 мкг / мл в PBS и переносят 50 мкл в каждую ELISA лунку 96-луночного планшета.
2. Инкубируйте планшет в течение 2 ч при температуре 37 ° С или в течение ночи при 4 ° С во влажной камере.
3. Промыть пластины 3 раза с водопроводной водой. Блок лунки 80 мкл PBS / 5% неонатальной сыворотки теленка (NCS) на лунку в течение 1 ч при комнатной температуре во влажной чянтарный. Подготовьте разведений сыворотки в соотношении 1: 5 серии, начиная с 1:50. Для анализа клеточной культуры, используют неразбавленный супернатант культуры.
4. Промыть пластины 3 раза с водопроводной водой. 50 мкл образца на лунку и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре во влажной камере. Приготовьте раствор вторичного антитела в отношении 1: 5000 разбавлением козьего анти-мышиного IgG антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP).
5. Промыть пластины 3 раза с водопроводной водой и добавляют 50 мкл вторичного раствора антител на лунку. Инкубировать в течение 45 мин при комнатной температуре во влажной камере.
6. Приготовить свежий раствор субстрата. Сделайте исходные растворы 0,1 М NaH ₂ PO ₄ и 0,1% перекиси водорода. Взять 5 частей NaH ₂ PO _4, 4 части перекиси водорода и 1 часть тетраметилбензидина для раствора свежего субстрата.
   1. Промыть пластины 10 раз водопроводной водой. 50 мкл свежего раствора субстрата в лунки и инкубировать в течение 5 - 10 мин втемно.
7. Остановить реакцию с 50 мкл 1 М H ₂ SO ₄ в каждую лунку. С помощью планшет-ридера, измеряют оптическую плотность при длине волны 450 нм с эталонной длины волны при 630 нм.

4. Подготовка миеломы клеточных культур

1. С этого момента, выполнить все работы в стерильных условиях.
2. Приготовьте свежую культуральную среду для культивирования клеток. Дополнение 500 мл RPMI1640 с 10% эмбриональной сыворотки теленка (50 мл), 2 мМ L-глутамина (5 мл) и 50 мкМ меркаптоэтанола (5 мл). Подставьте глютамин каждые 7 дней.
3. Оттепель флакон мышиных SP2 / 0 клеток в теплой воде. Переносят раствор клеток в 10 мл свежей культуральной среды и центрифугировать в течение 10 мин при 200 х г. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют таблетку в 1 мл свежей культуральной среды.
4. Передача клеток в 25 см ² колбу и инкубировать их при 37 ° С и 5% СО ₂ в инкубаторе. Расширить клетки к двум 75-м ² колбах BEFРуда фьюжн. Сбережение аликвоты для длительного хранения, как описано в шаге 7.

5. Подготовка питающих клеток

1. Пожертвуйте 12-недельных NMRI мыши ( в соответствии с национальными и институциональных руководящих принципов; например, CO ₂ ингаляции). Удалите мех и очистить живота с 70% этанола.
2. Вводят 5 мл охлажденного льдом RPMI среды в живот, массаж живота с пинцета, и аспирация суспензии клеток-фидеров. Поместите клетки в пустой 50-мл пробирку. Выполните этот шаг еще раз. От 7 до 10 мл клеточной суспензии фидера должна быть восстановлена.
3. Приготовьте 100 мл питатель суспензии клеток путем добавления 90 мл культуральной среды с полной клеток (RPMI 1640, 10% фетальной сыворотки теленка, 2 мМ глутамина и 50 мкМ меркаптоэтанола). Смешайте его и передать 100 мкл / лунку в 10 х 96-луночный культуральный пластин. Инкубируйте пластин в течение ночи при температуре 37 ° С и 5% СО ₂ в инкубаторе.

6. Cell Fusion

1. Жертвуют иммунизированной мыши путем смещения шейных позвонков или CO ₂ ингаляции и акцизный селезенку ^14. Взять дополнительную кровь от сердца и готовят сыворотку, как описано на стадии 2.3, в качестве положительного контроля в ELISA.
2. Подготовка суспензии клеток селезенки, нажав на селезенку через клеточный фильтр. Наполните до 20 мл с полной клеточной культуральной среды. Сбора клеток в 50 мл пробирки с помощью центрифугирования (200 мкг, 10 мин и 4 ° С). Удалите супернатант.
3. Смыва колбы для культивирования клеток и сбора клеток миеломы путем центрифугирования (200 мкг, 10 мин и 4 ° С) и отбросить супернатант.
4. Ресуспендируют клеточный дебрис в 20 мл сбалансированного солевого буфера (БСС) (125 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 4 мМ CaCl _2, 2,5 мМ MgCl ₂ и 5 мМ Трис-HCl, рН 7,4) и центрифугируют снова. Повторить стадии промывки три раза.
5. Для регулировки спленоцитов: соотношение клеток миеломы, подсчет клеток после второй стадии промывки пихтовымиулица ресуспендирования осадка в 1 мл буфера ПБС. Сделать разведение 1:10 и передачи 10 мкл в камере подсчета клеток. Граф клеток и определяют концентрацию клеток в 1 мл.
6. Регулировка числа клеток в буфере БС, на три части спленоцитов и однокомпонентных клетками миеломы в конечном объеме 1 мл. Взять 200 мкл клеточной суспензии и смешать его с 200 мкл PEG8000 (1 г в 4 мл буфера BSS). Перенести 400 мкл в кювету для электропорации с диаметром 2 мм и установить импульс (600 - 650 В и 25 мс).
   1. После того, как импульс, инкубировать клетки при комнатной температуре в течение 3 мин в кювету. Удалить клетки и поместить их по каплям в колбу Эрленмейера с 100 мл среды НАТ (RPMI 1640, 10% FCS, 2 мМ глутамина, 50 мкМ меркаптоэтанола, 100 мкМ гипоксантина, 5,8 мкМ azaserine, и 16 мкМ тимидина).
   2. Повторите слитого 4 раза до тех пор, партия 1-мл не расходуется. Выдержите коническую колбу в течение 3 ч при 37 ° С и 5% CO ₂в инкубаторе.
7. Дополнение клеточной суспензии снова с гипоксантин, azaserine и тимидин, прежде чем покрытие клеток на фидерного слоя. Добавьте 100 мкл суспензии клеток на лунку на слой пластин фидерных и инкубировать пластин при 37 ° С и 5% CO ₂ (в термостате). Конечная концентрация в скважине должна быть не менее 100 мкМ гипоксантина, 5,8 мкМ azaserine и 16 мкМ тимидина.
8. Провести микроскопический анализ (увеличение: 10х объектив, 10x окуляр) для клонального роста в каждую лунку пластины через 7 дней для того, чтобы определить, есть ли данные скважины моно- или поликлональными. Моноклональные клетки один кластер из клеток, происходящих из одной единственной клетки. Поликлональные клетки множественные скопления клеток в одной скважине. Изменение полной среды через 7 дней и снова инкубировать в течение 7 дней в среде НАТ.
9. Изменение среды НАТ и культивирования клеток в полной среде для культивирования клеток. Используйте супернатант для выполнения ELISA, как описано в шаге 3. Позитивные гибридомные клетки должны быть расширены в 24-луночные планшеты в соответствии с тестами для получения специфических антител. Если клетки поликлональные, ограниченное разведение должно быть выполнено (описано на шаге 8).

7. Криоконсервация гибридом

1. Cryoconserve положительный моно- и поликлональные гибридом для длительного хранения. Сбора клеток из 24-луночного планшета с впадения> 60% путем центрифугирования (200 мкг, 10 мин и 4 ° С).
2. Ресуспендируют осадок в 500 мкл полной среды для культивирования клеток и перевести его в криоскопической пробирки. Добавить 500 мкл сублимационной среды (RPMI 1640, 20% FCS и 15% диметилсульфоксида), смешать его, и положил его в в пенопластовую коробку или специальный ящик замерзания. Хранить при температуре -80 ° С в течение 3-х дней. После 3-х дней, криоскопической может быть переведен в жидкий азот для длительного хранения.

8. Ограничение разбавление поликлональных гибридом

1. Makеа фидерного слоя культуры, как описано в шаге 5. Урожай положительные поликлональные клетки, как описано в шаге 7.1. Граф клеток, как описано в шаге 6.5, и регулировать количество клеток до 10 клеток / мл, с получением конечного объема 10 мл в течение 96-луночного планшета. Добавьте 100 мкл / лунку на фидерный слой.
2. Выдержите в течение 7 дней при 37 ° С и анализируют рост клонов микроскопически (увеличение: 10х Линза объектива, 10x окуляр). Сделать ELISA из супернатанта культуры, как описано в шаге 3, и определить соответствующие моноклональные гибридом в массовой культуре.

9. Массовая культура и очистка моноклональных антител

1. Перенесите моноклональные гибридом с соответствующими сигналами ELISA на 25 см ² или 75 см ² колбах и собирают до 500 мл супернатанта культуры. Тестирование культуры еженедельно для специфических антител и сохранить 3 - 5 аликвот за гибридом для длительного хранения, как описано в шаге 7.
2. Центрифуга супернатант культуры в 4900 XG и 4 ° С в течение 15 мин и фильтруют ее через фильтр с размером пор 0,45 мкм. Смешайте супернатанта с буфером для связывания (4 М NaCl и 2 М глицин NaOH, рН 8,9) в соотношении 3: 1.
3. Готовят колонку с белком А путем ее промывки промывочным буфером (разбавить связывающим буфером 1: 3 в дН ₂ O). Пропускают супернатант со стадии 9.2 над колонной и собирать проточные. Элюции связанное антитело с помощью 0,1 М цитрата, рН 3,5, и сразу же нейтрализуют рН с 500 мкл Трис-HCl, рН 9,0.
4. Охарактеризовать элюированного антитела в SDS-PAGE, вестерн-блот и ELISA, и проверить его для конечного применения.
   1. Для PAGE SDS, принимают 3 - 5 мкг очищенного раствора антител на полосу (образец 20-мкл), добавляют 5 мкл 4х SDS загрузки образца буфера (8% SDS, 20% 2-меркаптоэтанола, 40% глицерина и 0.015 % бромфенол, снижается), и нагревать зонды при 95 ° с в течение 5 мин. В качестве контроля используют один и тот же образец с очистилиntibody того же изотипа, но нерелевантной специфичности.
   2. Загрузка образцов на SDS геле 12,5%, поместите 5 мкл неокрашенной белка лестницы в дополнительной полосе, и разделить их с помощью электрофореза. Пятно гель Кумасси бриллиантовым синим и документировать результаты. Основной протокол SDS был создан Лаеммли в 1970 году ^15.

Результаты

На рисунке 1 показан пример антиген-специфического сывороточного титра для одной иммунизации , выполняемой в лаборатории. На этой фигуре, иммунных сывороток А и В были титрованию от 1:50 до 1: 5000000 по сравнению с сывороткой наивных мыши. Антиген был нанесен на тве...

Обсуждение

Генерирование моноклональных антител с помощью гибридомной технологии требует интенсивного и детального анализа антигенной детерминанты, в особенности в отношении конечного применения, когда антитело должно распознавать цели. Это часто недооценивается пользователей и приводит к а...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
glutaraldehyde	Sigma Aldrich	G5882
N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC)	Sigma Aldrich	39391-10ML
Sulfo-GMBS	Perbio Science Germany	22324
ovalbumin	Sigma Aldrich	A5503
bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A2153
keyhole limpet hemocyanin	Sigma Aldrich	H8283
Falcon tubes 15 mL	Biochrom GmbH	P91015
reaction vials, 1.5 mL	Carl Roth GmbH & C0.KG	CNT2.1
hollow needle	Carl Roth GmbH & C0.KG	C724.1
glass wool	Carl Roth GmbH & C0.KG	6574.1
Sephadex G25 coarse	Sigma Aldrich	GE-17-0034-02
Freund´s adjuvant, complete	Sigma Aldrich	F5881-10ML
ELISA plates, 96 well	Greiner bio-one	655101
neonatal calf serum	Biochrom GmbH	S1025
TipOne Tips 1000 µL	Starlab	S1111-2021
Pipette tips 200 µL	Greiner bio-one	739291
HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody	Dianova	115-035-003
tetramethylbenzidine	Carl Roth GmbH & C0.KG	6350.2
Natriumdihydrogenphosphat	Carl Roth GmbH & C0.KG	K300.2
peroxide/urea
sulphuric acid	Carl Roth GmbH & C0.KG	4623.3
RPMI 1640	Life technologies GmbH	31870074
L-glutamine	Carl Roth GmbH & C0.KG	HN08.2
beta-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250
fetal calf serum	Invitrogen	10270106
TC-flask 25 cm2	Peske GmbH	86-V025
TC-flask 75 cm2	Peske GmbH	86-V075
ethanol, 96%	Carl Roth GmbH & C0.KG	P075.1
cell strainer	VWR international	734-0002
Falcon tubes 50 mL	Biochrom GmbH	P91050
PEG 8000	Sigma Aldrich	1546605
electroporation cuvette, 2mm	Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K.	EKL2,25
hypoxanthine	Sigma Aldrich	H9636-25G
azaserine	Sigma Aldrich	A4142
thymidine	USB Europa GmbH	22305 1 GM
TC-plates 96 well	Biochrom GmbH	P92696
TC-plates 24 well	Biochrom GmbH	P92424
cryotubes, 1mL	Sigma Aldrich	V7384-1CS
dimethylsulfoxid	Carl Roth GmbH & C0.KG	4720.1
protein A sepharose	Sigma Aldrich	P3391-1G
SDS sample loading buffer, Roti-Load 1	Carl Roth GmbH & C0.KG	K929.1
unstained protein ladder	BioRad Laboratories	161-0363
comassie brilliant blue R-250	BioRad Laboratories	161-0406