Geração de anticorpos monoclonais murinos pelo hibridoma Tecnologia

Resumo

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

Resumo

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

Introdução

A tecnologia de hibridoma apresentadas neste protocolo foi descrita pela primeira vez por Kohler e Milstein ¹ em 1975 e, com exceção de algumas melhorias técnicas, do processo principal não mudou dramaticamente durante os últimos 40 anos ^2. O objectivo do presente protocolo é a explicar uma estratégia mais adequada a imunização, um método padrão para a geração de anticorpos monoclonais, e um exemplo de um método de validação (ELISA).

Os anticorpos são ferramentas incrível e contribuem para uma grande variedade de abordagens tecnológicas, tais como citometria de fluxo, separação de células magnético, ou imunofluorescência, bem como para possibilidades de diagnóstico e terapêuticas para o controlo e tratamento da doença ^3. A disponibilidade comercial de anticorpos monoclonais para os alvos desejados é demonstrada pela presença de mais de 24 bases de dados da web com diferentes quantidades de cerca de inúmeros anticorpos ou de produtos relacionados com o Anticorpo ^4. Em 2015, ummoléculas ntibody eram parte de uma discussão internacional ^5-7 devido a problemas graves na validação adequada e caracterização de anticorpos disponíveis comercialmente.

Pode ser difícil e caro para encontrar os anticorpos específicos para um antigénio alvo, e, muitas vezes, eles não têm a afinidade ou especificidade necessárias. Apesar de gerar um anticorpo ainda é demorado e requer pessoal qualificado para desenvolver e validar o anticorpo, produzindo um anticorpo individualmente poderia melhor do que comprar um.

Devido ao facto de a produção de anticorpos é demorada e exige experiência, foram desenvolvidos métodos alternativos para a produção de moléculas de ligação para superar estes problemas. O método alternativo mais utilizada é a produção recombinante de anticorpos de cadeia simples através de apresentação de fagos. Os genes para a região variável de ligação são extraídos a partir de células e combinado com a proteína de revestimento de um fago. os single cadeia é então expresso na superfície de uma bacteriófago e rastreados em vários passos panning ^8. A produção de anticorpos de cadeia única é um pouco mais rápido, mas também requer um experimentalista especializado. As desvantagens de alguns anticorpos de cadeia simples recombinantes são fraca estabilidade e falta de aptidão para o diagnóstico in vitro. Na maioria dos testes de diagnóstico, um receptor de Fc para detecção é necessário, o que tem de ser adicionado a um anticorpo de cadeia única recombinante depois. Mais uma vez, esta é morosa e ainda mais complexa do que a técnica de hibridoma. Em diagnóstico in vitro, de anticorpos de comprimento completo monoclonal de ratinho e de coelho foram demonstradas para ser a melhor escolha.

Um dos principais passos na geração de anticorpos monoclonais deve ser feito antes que o trabalho começa no laboratório: o desenho do imunoconjugado. Questões que precisam ser abordadas são: Qual é a composição física do alvo na última application, e em que as matrizes estão presentes? Onde a concentração será o alvo tem na sua aplicação? Qual é a aplicação final, e quais são os requisitos que o anticorpo deve cumprir?

Ter sempre em conta que, se um fragmento de péptido linear é usado, tem também de ser linear, no epitopo final no alvo de escolha; caso contrário, o anticorpo não se ligarão. Claro que, independentemente do método de rastreio, os anticorpos podem ser seleccionadas para reconhecer diferentes formatos antigénicos em diferentes aplicações, mas este deve ser validado de forma muito precisa. Estas são as razões pelas quais o desenvolvimento de anticorpos e validação são tais processos ambiciosos.

A escolha do formato antigénico para a imunização é fundamental para o desenvolvimento de anticorpos e determina o sucesso ou a falha do presente processo. Uma vez que os ratinhos expressam um título de anticorpo necessário, as células do baço são isoladas e fundidas com células de mieloma. As linhas celulares de mieloma mais comuns paradesenvolvimento anticorpo monoclonal murino são X63-Ag 8.653 ⁹ e Sp2 / 0-Ag 14 ¹⁰ a partir de um / c estirpe de ratinhos Balb. As células são descendentes de um linfoma de células B malignas e foram selecionados porque eles não secretam qualquer de suas próprias cadeias pesadas ou leves. As células podem ser adaptadas a uma razão entre 1:10 e 10: 1 (em comparação com células de mieloma esplenócitos). Neste protocolo, as células foram adaptadas para uma proporção de 3: 1 e fundida por polietileno-glicol (PEG) e de electrofusão, de acordo com Stoicheva e Hui ^11.

A fusão de células B e células de mieloma é um processo aleatório. Portanto, dois híbridos de linfócitos B ou duas células de mieloma pode ser gerada, mas esses híbridos não seriam capazes de sobreviver durante um longo período de tempo em cultura. As células passam por uma selecção de hipoxantina, aminopterina, e timidina (HAT), pelo que apenas as células de hibridoma fundidas podem sobreviver devido à possibilidade de utilizar a via de novo da síntese de pirimidina. Para a geração de monoclonal anticorpos, é necessário para obter uma linha de células proveniente de uma célula mãe. O monoclonalidade é assegurada por limitar as técnicas de diluição e a análise microscópica de crescimento celular. Os sobrenadantes da cultura de hibridoma são rastreados quanto à produção de anticorpos específicos, principalmente por meio de ELISA ou citometria de fluxo, e os melhores ligantes são seleccionados. Após cultura em massa e a purificação, a molécula de anticorpo pode, finalmente, ser caracterizado e validado para a aplicação desejada.

Protocolo

Balb / c ou ratinhos NMRI (Mus musculus) da nossa colónia de reprodução da Universidade de Potsdam (Potsdam, Germany) foram utilizados para a produção de anticorpos monoclonais. O trabalho animal foi conduzido de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais relevantes. O estudo foi aprovado pelo Ministério Brandenburg do Meio Ambiente, Saúde e Defesa do Consumidor (referência V3-2347-A16-4-2012).

1. Preparação de imunoconjugados

1. Para o acoplamento do antigénio a um veículo, usar protocolos padrão de acoplamento por meio de amino, carboxi ou sulfo-grupos, tais como por glutaraldeído, N - (3-dimetilaminopropil) - N etilcarbodiimida (EDC), ou N - [Y-maleimidobutiriloxi ] succinimida (sulfo-GMBS).
2. Para o acoplamento (por exemplo, com glutaraldeído) ^13, utilizar a proteína ou péptido alvo e o transportador (ovalbumina, albumina de soro bovino ou hemocianina de lapa) em uma proporção de 1: 1. Dilui-se a pr-alvootein ou péptido em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e a proteína transportadora em NaHCO ₃ 50 mM de tampão. Adaptar o volume ea concentração ao montante necessário para imunizações.
   1. Misturar as duas soluções e adiciona 1,25% glutaraldeído. Misturar e incubar a amostra durante 4 horas a temperatura ambiente (RT). Para seleccionar as células de hibridoma, fazer o mesmo imunoconjugado, mas com um outro portador, a fim de evitar a selecção dos ligantes veiculares inespecíficas.
3. Dializar a amostra de acoplamento através da realização de uma diálise rápido com resina comercial grosseiro (por exemplo, Sephadex G25).
   1. Perfurar a parte inferior de um frasco de reacção de 1,5 ml com uma agulha oca e colocá-lo em um tubo de 15 mL. Coloque a lã de vidro na parte inferior para selar e cobri-lo com 300 mg de resina grossa (à marca de referência de 0,5 mL).
   2. Com cuidado, coloque 1 mL PBS, gota a gota em um tubo de reacção de 1,5 mL e certifique-se de que a lã de vidro ainda está selando a perfuração. Deixe a resina s grossabem e centrifuga-se a coluna a 500 xg durante 2 min. Uma tal coluna pode ser utilizado para dialisar 200 ul da amostra de acoplamento. Para volumes maiores, fazer mais colunas.
   3. Alterar o tubo e soltar a solução de acoplamento sobre a resina grossa inchou. Centrifugar novamente a 500 xg durante 2 min. Remover o eluente a partir do tubo e usá-lo para a imunização.

2. Imunização de Animais

1. Escolha ratinhos Balb / c de dois ou três de 6 a 12 semanas de idade para imunização.
2. Para um animal, preparar 150-200 ug do imunoconjugado em 200 uL de PBS e misturá-lo com 100 uL de adjuvante completo Freund's (CFA). Misture a solução 3 vezes com uma agulha curta e fina (0,6 mm de diâmetro) numa seringa de 1 mL. Injectar a solução por via intraperitoneal no rato.
3. Dá uma injecção de reforço 6 semanas mais tarde com a mesma quantidade do imunoconjugado, mas sem CFA. Tome sangue 7 dias mais tarde (para fora do seio retro-orbital) e prepare o soro por incubação do sangue durante 3 - 4 h à temperatura ambiente (RT).
   1. Centrifugar a mistura a 3000 xg durante 5 min. Leve o sobrenadante soro e transferi-lo para um novo tubo. Armazená-lo a -20 ° C. Descartar o sedimento.
4. Analisar os soros por meio de ELISA, tal como descrito no Passo 3. Por fusão, escolher com o rato com o título mais elevado de soro.
5. Em preparação para a fusão celular, aumentar o mouse com 150-200 mg do imunoconjugado em 300 mL de PBS sem adjuvante apenas 4 dias antes da fusão.

3. ELISA

1. Prepara-se uma solução de antigénio com uma concentração de 5 ug / ml em PBS e transferir 50 ul em cada poço de ELISA de uma placa de 96 poços.
2. Incubar a placa durante 2 horas a 37 ° C ou durante a noite a 4 ° C numa câmara húmida.
3. Lavar a placa 3 vezes com água da torneira. Bloquear os poços com 80 mL de soro de vitelo neonatal PBS / 5% (NCS) por poço durante 1 h à temperatura ambiente numa CH húmidaâmbar. Prepare as diluições do soro em um 1: 5 série começando com 1:50. Para a análise da cultura de células, utilizar o sobrenadante de cultura não diluído.
4. Lavar a placa 3 vezes com água da torneira. Pipetar 50 ul de amostra por poço e incubar durante 1 h à temperatura ambiente numa câmara húmida. Preparar a solução de anticorpo secundário numa diluição de 1: 5000 de um anticorpo anti-rato IgG de cabra conjugado com peroxidase de rábano (HRP).
5. Lavar a placa 3 vezes com água da torneira e adicionar 50 ul de solução de anticorpo secundário por poço. Incubar durante 45 min à temperatura ambiente numa câmara húmida.
6. Prepara-se uma solução de substrato fresca. Faça soluções estoque de M NaH ₂ PO peróxido de hidrogênio 0,1 ₄ e 0,1%. Tome 5 partes NaH ₂ PO _4, 4 partes de peróxido de hidrogênio e uma parte tetrametilbenzidina para a solução de substrato fresco.
   1. Lave a placa 10 vezes com água da torneira. Pipetar 50 ul de solução de substrato fresca para os poços e incubar durante 5 - 10 min noescuro.
7. Parar a reacção com 50 ul 1 H ₂ SO ₄ por poço. Utilizando um leitor de placa, à medida da densidade óptica a 450 nm com um comprimento de onda de referência a 630 nm.

4. Preparação de culturas de células de mieloma

1. A partir de agora, realizar todo o trabalho em condições estéreis.
2. Prepare um meio de cultura fresco para o cultivo de células. Suplemento 500 ml de RPMI 1640 com 10% de soro fetal de vitelo (50 ml), 2 mM de L-glutamina (5 mL), e 50 uM de mercaptoetanol (5 mL). Substituir a glutamina a cada 7 dias.
3. Descongelar um frasco de SP2 0 células / murino em água morna. Transferir a solução de células para 10 ml de meio de cultura fresco e centrifuga-se durante 10 min a 200 x g. Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de meio de cultura fresco.
4. Transferir as células num de 25 ^cm2 balão e incubar a 37 ° C e 5% de _CO2 numa incubadora. Expandir as células a dois de 75 m ² frascos beffusão do minério. Conserve alíquotas para armazenamento a longo prazo, tal como descrito no Passo 7.

5. Preparação de células alimentadoras

1. Sacrificar um rato de 12 semanas de idade NMRI (de acordo com as diretrizes nacionais e institucionais, por exemplo, por inalação de CO _2). Retire a pele e limpar o abdômen com etanol 70%.
2. Injectar 5 ml de meio RPMI gelado no abdômen, massagear o abdômen com uma pinça, e aspirar a suspensão de células de alimentação. Colocar as células em um tubo vazio de 50 ml. Executar este passo mais uma vez. 7 a 10 ml da suspensão de células de alimentação deve ser recuperado.
3. Prepara-se uma suspensão de células de alimentação de 100 ml por adição de 90 mL de meio de cultura celular completo (RPMI 1640, 10% de soro fetal de vitelo, glutamina 2 mM, e 50 uM de mercaptoetanol). Misturar-e transferir 100 ul / cavidade em placas de cultura de células de 10 x 96 cavidades. Incubar as placas durante a noite a 37 ° C e 5% de _CO2 numa incubadora.

Fusão 6. celular

1. Sacrificar o rato imunizado por deslocamento cervical ou inalação de CO ₂ e extirpar o baço ^14. Aqui adicional de sangue a partir do coração e preparar o soro, tal como descrito na etapa 2.3, como um controlo positivo no ELISA.
2. Prepara-se uma suspensão de células do baço pressionando o baço através de um filtro de células. Encha até 20 mL com meio de cultura celular completo. Colher as células em tubos de 50 mL por centrifugação (200 xg, 10 min, e 4 ° C). Descartar o sobrenadante.
3. Lavar o balão de cultura de células e colheita das células de mieloma por centrifugação (200 xg, 10 min, e 4 ° C) e desprezar o sobrenadante.
4. Ressuspender as peletes de células em 20 mL de tampão de sal equilibrada (BSS) (NaCl 125 mM, KCl 5 mM, CaCl ₂ 4 mM, MgCl ₂ 2,5 mM, e Tris-HCl 5; pH 7,4) e centrifuga-se novamente. Repita os passos de lavagem três vezes.
5. Para ajustar o esplenócitos: proporção de células de mieloma, contar as células após o segundo passo de lavagem por abetor ressuspensão do sedimento em 1 ml de tampão BSS. Fazer uma diluição 1:10 e transferir 10 ul de uma câmara de contagem de células. Contar as células e determinar a concentração de células em 1 ml.
6. Ajustar os números de células no tampão BSS para três peças de esplenócitos e de células de mieloma de uma parte em um volume final de 1 ml. Tome 200 uL da suspensão de células e misturá-lo com 200 uL de PEG8000 (1 g em 4 mL de tampão BSS). Transferir 400 uL numa cuveta de electroporação com um diâmetro de 2 mm e definir o pulso (600-650 V e 25 ms).
   1. Após o pulso, as células incubar à TA durante 3 minutos na cuvete. Remover as células e colocá-los gota a gota a um balão de Erlenmeyer com 100 mL de meio HAT (meio RPMI 1640, FCS a 10%, glutamina 2 mM, mercaptoetanol 50 uM, 100 uM de hipoxantina, 5,8 ^ M azaserina, e 16 ^ M de timidina).
   2. Repetir a fusão até 4 vezes o lote de 1 ml é gasto. Incubar o balão de Erlenmeyer de 3 h a CO ₂ 37 ° C e 5%numa incubadora.
7. Suplemento da suspensão de células novamente com hipoxantina, azaserina, e timidina antes do plaqueamento das células na camada alimentadora. Adicionam-se 100 uL da suspensão de células por poço, às placas de camada alimentadora e incubar as placas a 37 ° C e 5% de CO ₂ (numa incubadora). A concentração final no poço deverá ser de 100 uM de hipoxantina, 5,8 ^ M azaserina, e 16 ^ M de timidina.
8. Realizar uma análise microscópica (ampliação: 10x lente objectiva, 10X olho peça) para o crescimento clonal em cada poço da placa, após 7 dias, a fim de determinar se os poços são mono- ou policlonal. células monoclonais são um aglomerado de células que se originam a partir de uma única célula. células policlonais são múltiplos grupos de células num poço. Mudar o meio completo após 7 dias e novamente incubar durante 7 dias em meio HAT.
9. Alterar o meio HAT e cultivar as células em meio de cultura celular completo. Utilizar o sobrenadante para executar um ELISA, tal como descrito no passo 3. As células de hibridoma positivas deve ser expandido em placas de 24 cavidades de acordo com os ensaios para a produção de anticorpos específicos. Se as células são policlonais, uma diluição limitada tem de ser realizada (descrito no passo 8).

7. crioconservação de hibridomas

1. Cryoconservé mono- positiva e hibridomas policlonais para armazenamento a longo prazo. Colheita das células a partir de uma placa de 24 poços com uma confluência de> 60% por centrifugação (200 xg, 10 min, e 4 ° C).
2. Ressuspender o sedimento em 500 ul de meio de cultura celular completo e transferi-lo para um tubo criogénico. Adicionar 500 mL de meio de congelamento (RPMI 1640, 20% FCS, e 15% de dimetilsulfóxido), misturá-lo e colocá-lo em em uma caixa de isopor ou uma caixa de congelamento especial. Armazenar a -80 ° C durante 3 dias. Após 3 dias, o tubo criogénico pode ser transferida para azoto líquido durante a armazenagem a longo prazo.

8. diluição limitante de anticorpos policlonais Os hibridomas

1. MakEA cultura camada de alimentação, tal como descrito no Passo 5. colheita de células policlonais positivas, conforme descrito no Passo 7.1. Contar as células, tal como descrito no passo 6.5, e ajustar o número de células para 10 células / ml, com um volume final de 10 ml para uma placa de 96 poços. Adicionam-se 100 ul / poço para a camada alimentadora.
2. Incubar durante 7 dias a 37 ° C e analisar o crescimento clonal microscopicamente (ampliação: 10x lente objectiva, 10X olho peça). Realizar uma ELISA do sobrenadante da cultura, tal como descrito no Passo 3, e identificar os hibridomas monoclonais adequados para a cultura em massa.

9. cultura de massa e purificação de anticorpos monoclonais

1. Transferir os hibridomas monoclonais com os sinais adequados ELISA a 25 ^cm2 ou 75 cm ² frascos e recolher-se a 500 mL do sobrenadante da cultura. Testar o semanal de cultura para produção de anticorpos específicos e de conservação 3 - 5 aliquotas por hibridoma para armazenamento a longo prazo, tal como descrito no passo 7.
2. Centrifugar o sobrenadante da cultura a 4.900 x g e 4 ° C durante 15 minutos e filtrar através de um filtro de 0,45? M. Misturar-se o sobrenadante com tampão (NaCl 4 M e 2 M de glicina NaOH, pH 8,9) de ligação na proporção de 3: 1.
3. Prepara-se uma coluna de proteína A por lavagem com tampão de lavagem (tampão de ligação diluir a 1: 3 em dH ₂ O). Passa-se o sobrenadante a partir do passo 9.2 sobre a coluna e recolher o fluxo de passagem. Elui-se o anticorpo ligado com citrato 0,1 M, pH 3,5 e neutralizar o pH imediatamente com 500 mL de Tris-HCl, pH 9,0.
4. Caracterizar o anticorpo eluído por SDS-PAGE, Western Blot, e ELISA, e validar para a aplicação final.
   1. Para o SDS-PAGE, tomar 3-5 ug de solução de anticorpo purificada por pista (uma amostra de 20 mL), adicionam-se 5 mL de 4x SDS tampão de carregamento de amostra (8% de SDS, 20% de 2-mercaptoetanol, 40% de glicerina, e 0,015 bromofenol%, reduzido), e aquecer as sondas a 95 ° C durante 5 min. Como controlo, usa o mesmo com uma amostra de uma purificadontibody do mesmo isotipo, mas de especificidade irrelevante.
   2. Coloque as amostras em um gel SDS 12,5%, coloque 5 mL de uma escada de proteína imaculada em uma faixa adicional, e separá-los por electroforese. Manchar o gel com Coomassie Brilliant Blue e documentar os resultados. Um protocolo básico SDS foi estabelecida por Laemmli, em 1970 ^15.

Resultados

A Figura 1 mostra um exemplo do título do soro específico de antigénio para uma imunização realizados no laboratório. Nesta figura, o soro imune A e B foram titulados a partir de 1:50 até 1: 5.000.000, em comparação com um soro de um rato ingénuos. O antigénio foi revestido em fase sólida, e os anticorpos específicos foram detectados com um anticorpo Ig anti-ratinho de cabra conjugado com POD. Ambos os soros dos ratinhos imunizados apresentaram títulos sign...

Discussão

A geração de anticorpos monoclonais por tecnologia de hibridoma requer uma análise epitopo intensa e detalhada, especialmente no que respeita à aplicação final, quando o anticorpo deve reconhecer o alvo. Este é muitas vezes subestimada pelos usuários e leva a anticorpos com performances fracas. O processo de fusão, é aleatória, o que significa que o resultado de hibridomas específicos é altamente dependente da proporção de células e a vitalidade neste ponto. Após diluição limitada, as células são mu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
glutaraldehyde	Sigma Aldrich	G5882
N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC)	Sigma Aldrich	39391-10ML
Sulfo-GMBS	Perbio Science Germany	22324
ovalbumin	Sigma Aldrich	A5503
bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A2153
keyhole limpet hemocyanin	Sigma Aldrich	H8283
Falcon tubes 15 mL	Biochrom GmbH	P91015
reaction vials, 1.5 mL	Carl Roth GmbH & C0.KG	CNT2.1
hollow needle	Carl Roth GmbH & C0.KG	C724.1
glass wool	Carl Roth GmbH & C0.KG	6574.1
Sephadex G25 coarse	Sigma Aldrich	GE-17-0034-02
Freund´s adjuvant, complete	Sigma Aldrich	F5881-10ML
ELISA plates, 96 well	Greiner bio-one	655101
neonatal calf serum	Biochrom GmbH	S1025
TipOne Tips 1000 µL	Starlab	S1111-2021
Pipette tips 200 µL	Greiner bio-one	739291
HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody	Dianova	115-035-003
tetramethylbenzidine	Carl Roth GmbH & C0.KG	6350.2
Natriumdihydrogenphosphat	Carl Roth GmbH & C0.KG	K300.2
peroxide/urea
sulphuric acid	Carl Roth GmbH & C0.KG	4623.3
RPMI 1640	Life technologies GmbH	31870074
L-glutamine	Carl Roth GmbH & C0.KG	HN08.2
beta-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250
fetal calf serum	Invitrogen	10270106
TC-flask 25 cm2	Peske GmbH	86-V025
TC-flask 75 cm2	Peske GmbH	86-V075
ethanol, 96%	Carl Roth GmbH & C0.KG	P075.1
cell strainer	VWR international	734-0002
Falcon tubes 50 mL	Biochrom GmbH	P91050
PEG 8000	Sigma Aldrich	1546605
electroporation cuvette, 2mm	Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K.	EKL2,25
hypoxanthine	Sigma Aldrich	H9636-25G
azaserine	Sigma Aldrich	A4142
thymidine	USB Europa GmbH	22305 1 GM
TC-plates 96 well	Biochrom GmbH	P92696
TC-plates 24 well	Biochrom GmbH	P92424
cryotubes, 1mL	Sigma Aldrich	V7384-1CS
dimethylsulfoxid	Carl Roth GmbH & C0.KG	4720.1
protein A sepharose	Sigma Aldrich	P3391-1G
SDS sample loading buffer, Roti-Load 1	Carl Roth GmbH & C0.KG	K929.1
unstained protein ladder	BioRad Laboratories	161-0363
comassie brilliant blue R-250	BioRad Laboratories	161-0406