3D cuantitativa<em&gt; In silico</em&gt; Modelado (q3DISM) de beta-amiloide cerebral fagocitosis en roedores modelos de enfermedad de Alzheimer

Resumen

Hemos desarrollado una metodología para 3D cuantitativa en el modelado in silico (q3DISM) de β-amiloide cerebral fagocitosis (Aß) por los fagocitos mononucleares en modelos de roedores de la enfermedad de Alzheimer. Este método puede ser generalizado para la cuantificación de virtualmente cualquier caso fagocítica in vivo.

Resumen

Neuroinflamación es ahora reconocida como un factor etiológico importante en la enfermedad neurodegenerativa. fagocitos mononucleares son células inmunes innatas responsables de la fagocitosis y la eliminación de escombros y detritus. Estas células incluyen macrófagos residentes del SNC conocidas como microglia y fagocitos mononucleares infiltrantes de la periferia. Microscopía de luz en general se ha utilizado para visualizar la fagocitosis en roedores o muestras de cerebro humano. Sin embargo, los métodos cualitativos no han proporcionado pruebas definitivas de la fagocitosis in vivo. A continuación, describimos 3D cuantitativa en el modelado in silico (q3DISM), un método robusto que permite la cuantificación verdadera 3D de amiloide-β fagocitosis (Aß) por los fagocitos mononucleares en modelos de roedores de la enfermedad de Alzheimer (EA). El método implica la visualización de fluorescencia Aß encapsulado dentro fagolisosomas en secciones del cerebro de roedores. Grandes conjuntos de datos confocal z dimensiones son entonces reconstruidos en 3D para la cuantificación de A &# 946; espacialmente colocalized dentro del fagolisosoma. Se demuestra la aplicación exitosa de q3DISM de cerebros de ratones y ratas, pero esta metodología se puede extender a prácticamente cualquier evento de fagocitosis en cualquier tejido.

Introducción

La enfermedad de Alzheimer (EA), la demencia más común relacionada con la edad ^1, se caracteriza por la acumulación de amiloide cerebral-β (Aß) en forma de placas "seniles" ß-amiloide, la neuroinflamación crónica de bajo nivel, taupatía, pérdida neuronal y alteraciones cognitivas ² . En los cerebros de pacientes con AD, la neuroinflamación se destina por los astrocitos y los fagocitos mononucleares reactiva (referida como microglia, aunque sus centrales vs. origen periférico sigue siendo poco clara) que rodea los depósitos de Aß ^3. Como los centinelas inmunes innatas del CNS, microglia se posicionan centralmente para borrar cerebro Aß. Sin embargo, el reclutamiento microglial a las placas de Aß se acompaña de muy poca, o ninguna, la fagocitosis Aß ^4,5. Una hipótesis es que la microglía son inicialmente neuroprotector por phagocytozing pequeños montajes de Aß. Sin embargo, con el tiempo estas células se convierten neurotóxico tan abrumadora carga de Aß y / o relacionada con la edad d funcionalecline, provoca la microglía en un fenotipo proinflamatorio disfuncional, lo que contribuye a la neurotoxicidad y la disminución cognitiva ^6.

Los estudios de asociación de genoma completo (GWAS recientes) han identificado un grupo de alelos de riesgo de AD que pertenecen al núcleo vías inmune innata que modulan la fagocitosis ^{7 8-11.} En consecuencia, la respuesta inmune a la deposición de amiloide cerebral se ha convertido en una importante área de interés, tanto en términos de la comprensión de la etiología de AD y para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos ^12-14. Sin embargo, hay una necesidad vital de la metodología para evaluar la fagocitosis Aß in vivo. Para hacer frente a esta necesidad no satisfecha, hemos desarrollado 3D cuantitativa en el modelado in silico (q3DISM) para permitir la cuantificación real en 3D de la fagocitosis cerebral Aß por los fagocitos mononucleares en modelos de roedores de la enfermedad de Alzheimer similar.

Limitada sólo por el grado en que recapitular la enfermedad, los modelos animales tienensido de gran ayuda para la comprensión de pathoetiology AD y para la evaluación terapéutica experimental. Debido al hecho de que las mutaciones en los genes presenilina (PS) y la proteína amiloide Precursor (APP) causan independientemente AD autosómica dominante, estos transgenes mutantes se han utilizado ampliamente para generar modelos de roedores transgénicos. Los ratones transgénicos APP / PS1 co-expresar de forma simultánea "sueca" APP mutante humana _(SWE APP) y Δ exón 9 presenilina humana mutante 1 (PS1ΔE9) presentes con amiloidosis cerebral acelerada y la neuroinflamación ^15,16. Además, hemos generado ratones bi-transgénico coinjected con APP _SWE y construcciones PS1ΔE9 (línea TgF344-AD, sobre un fondo Fischer 344). A diferencia de modelos de ratones transgénicos de amiloidosis cerebral, ratas TgF344-AD desarrollan amiloide cerebral que precede taupatía, pérdida de apoptosis de las neuronas, y el deterioro del comportamiento ^17.

En este informe, se describe un protocolo para la immunostaining microglia, fagolisosomas y depósitos de Aß en secciones cerebrales de ratones APP / PS1 y ratas TgF344-AD, y la adquisición de grandes imágenes confocal z-dimensional. Nos detalle en la generación y análisis de las verdaderas reconstrucciones 3D a partir de conjuntos de datos confocal que permite la cuantificación de la captación de Aß en fagolisosomas microgliales silico. En términos más generales, la metodología que detallamos aquí se puede utilizar para cuantificar prácticamente cualquier forma de fagocitosis in vivo.

Protocolo

Declaración de ética de la investigación: Todos los experimentos con animales que se detallan en este documento fueron aprobados por la Universidad del Sur de California Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) y lleva a cabo estrictamente de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud directrices y recomendaciones de la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Internacional de los Animales.

1. Aislamiento del roedor del cerebro y la preparación para la inmunotinción

DÍA 1:

1. Coloque ratas TgF344-AD de edades (de 14 meses de edad) o APP / PS1 ratones (12 meses de edad) bajo anestesia con isoflurano profunda continua (4%). Evaluar la profundidad de la anestesia por pellizco del dedo del pie y la ausencia de reflejo de retirada.
2. Corte a través de ambos lados de la caja torácica y levantar para exponer el corazón. Insertar una aguja de 23 G en el ventrículo izquierdo del corazón y hacer una pequeña incisión en la aurícula derecha. Continúe con el desangramiento por perfusión transcardial con solución salina tamponada con fosfato enfriada con hielo(PBS) usando una bomba peristáltica (30 ml para los ratones; 150-200 ml para ratas).
3. Se practica una incisión en la línea media caudal en la piel y mover la piel y el músculo a un lado. Corte a través de la parte superior del cráneo a lo largo de la línea media y entre los ojos. Retire las placas óseas y aislar todo el cerebro del cráneo.
4. Coloque el cerebro en una matriz de cerebro de roedores coronal y cortar en cuartos. Incubar cuartas partes posteriores O / N (16 h) en fijador paraformaldehído (4% PFA en PBS) a 4 ° C. Lavar 3x en PBS y, a continuación, transferir a un 70% de etanol. Precaución: PFA es tóxico y debe ser manejado bajo una campana química con el equipo de protección personal adecuado.

DIA 2:

5. Coloque cuartas partes del cerebro en casetes de incrustación y progresivamente deshidratar tejido en sucesivamente más concentradas baños de etanol 1 h (70%, 80%, 95% y 100% x3).
6. etanol Borrar en el tejido con tres sucesivos baños de xileno 100% (1 h cada una). Precaución: El xileno es tóxico y shOuld ser manejado bajo una campana química con el equipo de protección personal adecuado.
7. Insertar el tejido en bloques de parafina después de dos cuartos de baño fundido de cera de parafina (56 a 58 ° C, 90 min cada uno).

DÍA 3:

8. Cortar secciones de 10 micras de espesor de cerebros incluidos en parafina utilizando un microtomo. secciones se sumergen en un baño de agua (50 ° C durante 1 min) y se aplican a portaobjetos de microscopio. Deja las diapositivas para O / N se seque, lo que garantiza la adhesión del tejido a la diapositiva.

2. La inmunotinción

Nota: Las diferentes combinaciones de anticuerpos pueden ser utilizados para el procedimiento de tinción se describe a continuación. Cócteles de anticuerpos compatibles con el tejido cerebral de ratas y ratones se enumeran en la Tabla 1.

DÍA 4:

1. Desparafinar secciones del cerebro usando 2x 100% baños de xileno (12 min cada uno).
2. Rehidratar secciones de cerebro en baños sucesivos de etanol - 100% durante 10 min, 95% para 5 min, 80% para 10 min y, finalmente, 70% para 15 min - followed por lavados con PBS 3x [5 min a temperatura ambiente, con agitación ligera]. Mientras tanto, el calor solución de recuperación de antígenos a 95 - 97ºC en una placa caliente con agitación barra magnética.
3. Incubar las secciones del cerebro en la solución de recuperación de antígeno a 95 - 97ºC durante 30 min. A continuación, lavar 3 veces en PBS (5 min a temperatura ambiente, con agitación ligera).
4. Rápidamente secar los portaobjetos utilizando limpiaparabrisas tarea delicada para evitar la desecación del tejido, y trazar una barrera hidrofóbica alrededor de la zona de tejido con una pluma barrera hidrofóbica. Llene la región de tejido rodeada con tampón de bloqueo [PBS que contiene 0,3% de Triton X-100 y 10% normal burro suero (NDS)], y se incuba a TA durante 1 h en una cámara humidificada.
5. Sustituir el tampón Iba1 anticuerpo primario (diluido en tampón de bloqueo) para etiquetar los fagocitos mononucleares, y se incuba O / N a 4 ° C en una cámara humidificada de bloqueo. Para los hosts de anticuerpos y diluciones de trabajo, véase la Tabla 1 y la Tabla de Materiales.

DÍA 5:

6. Enjuagueanticuerpo primario con baños 3x PBS (5 min a temperatura ambiente con agitación ligera). Incubar con anticuerpo fluorescente secundario (conjugado con un fluoróforo de emisión 594 nm) durante 1 h (en tampón de bloqueo a temperatura ambiente en la oscuridad) seguido de baños 3x PBS (5 min a temperatura ambiente con agitación la luz). En este momento, mantener las secciones en la oscuridad para evitar la decoloración de la señal fluorescente.

DÍA 6 - 7:

7. Repita los pasos 2.5 y 2.6 con CD68 (los cerebros de ratas) o LÁMPARA1 (tejido de ratón) de anticuerpos y anticuerpos secundarios apropiados (junto con un fluoróforo emisión de 488 nm) para etiquetar fagolisosomas.

DÍA 7 - 8:

8. Repita los pasos 2.5 y 2.6 con OC (tejido de rata) o 4G8 (cerebros de ratón) de anticuerpos y anticuerpos secundarios apropiados (acoplado a un fluoróforo 647 nm) para marcar los depósitos de Aß.
   NOTA: Como alternativa, el anticuerpo 6E10 puede ser utilizado con éxito tanto en el ratón y la rata de tejido. Para las combinaciones de anticuerpos adecuados, consulte la Tabla de Materiales .
9. Permitir a las secciones completamente seca O / N a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, la cubierta especímenes con una hoja de cubierta sellada por medio de montaje de fluorescencia DAPI.

3. Adquisición de Gran Z-pila confocal Conjuntos de datos

Nota: Este protocolo requiere un escaneo láser confocal microscopio totalmente automatizado equipado con un objetivo de 60X y 405 nm, 488 nm, 594 nm, y 647 nm láser. Todo el equipo es controlado por un software de imagen y control del láser ordenador. Antes de comenzar el protocolo de imagen, encendido de la computadora, lámpara de epifluorescencia, microscopio, láser y cámara.

DÍA 9:

1. Seleccione el objetivo del microscopio 60X. Añadir el aceite de inmersión de la lente, y colocar la muestra en el soporte del microscopio de diapositivas. Elevar el objetivo hasta que el aceite se pone en contacto con la corredera. Ajustar el plano focal para localizar las placas de amiloide en el hipocampo o la corteza cerebral y requiere una iluminación de epifluorescencia a través de los oculares.
2. Adquirir im confocaledades de los fagocitos mononucleares activados que rodean los depósitos de amiloide en el hipocampo o la corteza de los roedores por microscopía confocal (ampliación 60X, pasos pila Z: 0,25 m

4. q3DISM

Nota: Con el fin de producir resultados significativos, se sugiere el análisis de un mínimo de 3 imágenes por animal / región de interés. Para cada imagen, la abundancia de células a analizar puede variar dependiendo de los paradigmas experimentales. En los resultados representativos mostrados en este informe, analizamos 3 células / condición (por ejemplo, los fagocitos mononucleares distantes o asociados con placas; véanse las Figuras 1C - D y 2C - D).

DÍA 10:

1. Analizar conjuntos de datos confocal con colocalización de procesamiento de imágenes 3D científica y análisis de software (coloc) Módulo de proximidad espacial de Iba1 / CD68 (tejido de rata) o Iba1 / LÁMPARA1 (tejido de ratón) tinción en todos los planos z simultáneamente.Crear Iba ⁺ / CD68 ⁺ o canales Iba ⁺ / ⁺ LÁMPARA1 colocalización que corresponden a fagolisosomas dentro de los fagocitos mononucleares activados.
   1. Seleccionar TRITC para el canal A (correspondiente a la tinción Iba1 junto con 594 fluoróforo nm) y FITC para el canal B (correspondiente a CD68 o tinción LAMP1 junto con 488 fluoróforo nm). En la parte derecha de la ventana del software de 'modo de chequeo,' 'umbral', seleccionar y de 'intensidades Coloc,' Seleccionar '' canales de origen.
   2. Haga clic en 'Editar' para seleccionar 'de color coloc' en el lado derecho de la ventana del software.
   3. Para cada canal de forma independiente, ajustar los umbrales para incluir y excluir a una tinción específica fondo señales / no específicos. Una vez ajustado, no cambie umbrales entre imágenes para garantizar un análisis imparcial. Los voxels (pixels colocalized de todos los z-pilas) aparecerán en el color seleccionado en el paso 4.1.2 en todos los z-pilas SIMultaneously.
   4. Haga clic en "construir el canal coloc '. El canal de colocalización creado aparecerá en la ventana de ajuste de visualización.
   5. Haga clic en el canal coloc para abrir estadísticas del canal. El '% del volumen / material A por encima del umbral colocalizó' representa el% de señal Iba1 (voxels correspondientes al fluoróforo 594 nm) colocalized con LÁMPARA1 o señal de CD68 (voxels correspondientes al fluoróforo 488 nm). Más simplemente, esto es el volumen ocupado por los monocitos fagolisosomas (ver las figuras 1C y 2C).
      NOTA: '% del volumen / material B por encima del umbral colocalizó' corresponde al% de la señal LÁMPARA1 o CD68 colocalized con Iba1. Esto debería ser cercana al 100%, como fagolisosomas son estructuras intracelulares. Los valores se basan en la relación entre la señal de todos los z-pilas por encima del umbral colocalized.
2. Con el módulo de coloc, analizar el canal coloc creado en el paso 4.1 para la proximidad espacial con OC (ti rataN ú mero) o 4G8 (tejido de ratón) señales de Aß. Esto permite la cuantificación de Aß encapsulado dentro de fagolisosomas.
   1. Seleccione el canal Un conjunto de datos coloc (correspondiente a la Iba1 / CD68 o canal Iba1 / LAMP1 coloc creado en el paso 4.1) y Cy5 para el canal B (correspondiente a OC o tinción 4G8 junto con 647 fluoróforo nm).
   2. Construir un canal coloc como se describe en los pasos 4.1.2 a 4.1.5.
   3. Haga clic en el canal coloc para abrir estadísticas del canal. El "% de volumen / material A por encima del umbral colocalized 'representa el% de Iba1 / LAMP1 o Iba1 / CD68 (voxels correspondiente al canal coloc construido en el paso 4.1.5.) Colocalized con OC o señal 4G8 (voxels que corresponde a la 647 nm fluoróforo). Este es el volumen ocupado por fagolisosómico beta (véanse las figuras 1D y 2D).
      NOTA: '% del volumen / material B por encima del umbral colocalizó' se corresponde con la señal de Aß% de total de colocalized con fagolisosomas.Esto se puede utilizar para evaluar la fracción del total de depósitos de Aß encapsulados dentro fagolisosomas (no se muestra en los presentes resultados representativos).
3. Utilice el módulo de superar a reconstruir las pilas de imágenes confocal y generar modelos 3D de Aß encapsulados dentro fagolisosomas monocitos.
   1. En la ventana de "ajuste de visualización ', seleccione TRITC (tinción para mostrar solamente Iba1). En la ventana '' propiedades del volumen, haga clic en "añadir nueva superficie '.
   2. En el paso '1/5 algoritmo', en 'Configuración', seleccione 'superficie'. Además, en 'Color', seleccionar el tipo de color en la paleta o RGB y ajustar la transparencia (rojo se fija en el 60% de transparencia en las figuras 1B y 2B). casilla de verificación "Seleccionar una región de interés". Haga clic en Siguiente.
   3. En el Paso '2/5 región de interés,' dibujar una ventana alrededor de la célula de interés mediante el ajuste de X, Y y Z coordenadas (ver cuadros blancos en las figuras 1A y 2A). Haga clic en Siguiente.
   4. En el Paso '3/5 canal de origen', seleccione el canal de origen TRITC. Marque la casilla 'suave', y el nivel de detalle superficie de 0,4 micras. Para 'umbral', seleccione la intensidad absoluta. Haga clic en Siguiente.
   5. En el Paso '4/5 umbral,' ajustar el umbral de modo que el volumen creado superpone a la perfección con la señal del canal TRITC. Haga clic en Siguiente.
   6. En el Paso '5/5 clasifican superficies,' en la sección 'tipo de filtro,' seleccionar objetos en función de su tamaño para ser incluidos o excluidos de los volúmenes a ser creados. Haga clic en Finalizar, ejecutar todos los pasos de creación, y salir del asistente.
   7. Repetir los pasos 4.3.1 a 4.3.6 para crear una superficie 3D para el canal de FITC (LAMP1 ⁺ o CD68 ⁺ fagolisosomas).
   8. Repita los pasos 4.3.1 a 4.3.6 para crear una superficie 3D para el canal de Cy5 (4G8 ⁺ depósitos de Aß OC ⁺ o).

Resultados

Utilizando la metodología de múltiples etapas para q3DISM se ha detallado anteriormente, somos capaces de cuantificar la absorción de Aß en fagolisosomas monocitos en los cerebros de APP / PS1 ratones (Figura 1) y ratas TgF344-AD (Figura 2). Por lo tanto, la metodología q3DISM ha permitido el análisis de los fagocitos mononucleares en ratón y rata modelos de AD. Curiosamente, el volumen ocupado por CD68 ⁺ fagolisosomas es significativam...

Discusión

El protocolo que se describe en este informe para una verdadera cuantificación 3D de Aß fagocitosis in vivo por los fagocitos mononucleares se basa en el etiquetado específico de los compartimentos celulares y subcelulares, así como los depósitos de Aß. Específicamente, usamos Iba1 (ionizada-calcio Encuadernación adaptador molécula 1), una proteína que está implicada en ruffling membrana y la fagocitosis tras la activación de células ^{18, 19,} para teñir los fagocito...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Abbott	NDC 0044-5260-05
Dissecting scissors	VWR	82027-582
Dissecting scissors Blunt tip	VWR	82027-588
Tweezers	VWR	94024-408
23 G needle	VWR	BD305145
peristaltic pump FH10	Thermo Scientific	72-310-010
PBS 10x	Bioland Scientific	PBS01-02	Phosphate-buffered Saline; Working concentration 1x
Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm	Kent Scientific	RBMS-200C
Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm	Kent Scientific	RBMS-305C
32% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA)	EMS	15714-S	Caution: Toxic. Working concentration: 4% in PBS
Ethanol	VWR	89125-188	Various concentrations, see protocol
Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura	VWR	25608-774
Embedding and Infiltration Paraffin	VWR	15147-839
Microtome Leica RM2125	Leica Biosystems
Disposable Microtome Blades	VWR	25608-964
Water bath Leica HI 1210	Leica Biosystems
Micro slide Superfrost plus	VWR	48311-703
Xylene	Sigma-Aldrich	534056-4X4L	Caution: Toxic
Target Retrieval Solution 10x	DAKO	S1699	Working concentration 1x
KimWipes	VWR	21905-026
Hydrophobic PAP pen	VWR	95025-252
Triton X-100	VWR	97062-208
Normal Donkey Serum (NDS)	Jackson Immuno	017-000-121
Coverslips	VWR	48393081
Prolong Gold antifade reagent with DAPI	Life Technologies	P36935
Glass Slide Rack	VWR	100492-942
Iba1 antibody (polyclonal, rabbit)	Wako	019-19741	Working concentration 1:200
Iba1 antibody (polyclonal, goat)	LifeSpan Bioscience	LS-B2645	Working concentration 1:200
rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse)	Abcam	ab955	Working concentration 1:200
mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat)	Abcam	ab53444	Working concentration 1:200
mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat)	Affymetrix	14-1071	Working concentration 1:100
Beta-Amyloid, 17 - 24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse)	Covance	SIG-39220	Working concentration 1:200
Beta-Amyloid, 1 - 16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse)	Covance	SIG-39320	Working concentration 1:200
OC antibody (polyclonal, rabbit)	Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine)	Working concentration 1:200
Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody	Invitrogen	A-11001	Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 488 rat secondary antibody	Invitrogen	A-11006	Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody	Invitrogen	A-11037	Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 594 goat secondary antibody	Invitrogen	A-11080	Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody	Invitrogen	A-21235	Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody	Invitrogen	A-21443	Working concentration 1:1,000
Immersion oil	Nikon
A1 Confocal microscope	Nikon
NIS Elements Advanced Research software	Nikon
Imaris:Bitplane software version 7.6	Bitplane		"coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets.